專利名稱：抑制白介素-6產生的粉防已提取物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及能夠抑制白介素-6(下文簡稱為“IL-6”)產生的粉防己根提取物，制備該提取物的方法以及含有該提取物的藥物組合物，該組合物用于治療因IL-6的過量產生而引起的免疫疾病。
背景技術：
在韓國的南部和Cheju島發(fā)現(xiàn)的防己和青風藤已經作為止痛藥和抗炎劑使用了很長時間。另一方面，在韓國沒有發(fā)現(xiàn)的粉防己在中國慣常用來治療神經痛和關節(jié)炎。特別是，粉防己堿已經用作例如抗炎劑和抗高血壓劑。據報導粉防己具有抗吞噬細胞和抗氧化作用(Seow，W.K.等，Int.Archs.Allergy Appl.Immun.，85，404(1988))，并且在臨床和矽肺試驗模型中有效(Li，Q.等，Chinese J.Tuberc.Resp.Dis.，4，321(1981))；Xu，X.等，Ecotoxicol.Environ.Safety，7，306(1983)；和Liu，B.等，Ecotoxicol.Environ.Safety，7，323(1983))，而且還已知它具有抑制由人單核細胞分泌的白介素-1和腫瘤壞死因子-α產生效果(Seow，W.K.等，Clin.Exp.Immunol.，75，47(1989)；和Ferrante，A.等，Clin.Exp.Immunol.，80，232(1990))。據報導粉防己堿及其衍生物能夠促進大腦的功能(Tsumura & CO，WPIAcc.No.92-231935(1992))并且已經開發(fā)為抗瘧藥，此外還是頭發(fā)生長促進劑(Sunstar KK，WPI Acc.No.89-117236(1989))。
眾所周知，IL-6是參與細胞生長、分化和激活的一種調節(jié)因子。它是由各種器官細胞產生和分泌的并且在人體防御機理中起重要作用(Hirano，T.等，Immunol.Today，11，443(1990))。
據報導首先發(fā)現(xiàn)于單核細胞培養(yǎng)物中的IL-6能夠通過B細胞誘發(fā)抗體的產生(Muraguchi，A.等，J.Immunol.，127，412(1981))。據報導，由于Hirano，T.等人成功地克隆了IL-6的cDNA(Nature，324，73，(1986))，已經把IL-6作為B細胞雜交瘤和漿細胞瘤的生長因子(Snick，V.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83，9679(1986))，以及作為參與造血的一種因子(Koike，K.等，J.Exp.Med.，168，879(1988))再者，有人報導IL-6具有以下功能刺激T細胞的活化和生長(Lotz，M.等，J.EXP.Med.，167，1253(1988))；誘導肝細胞急性期的反應(Geiger，T.等，Eur.J.Immunol.，18，717(1988))；調節(jié)神經系統(tǒng)的細胞分化(Satoh，T.，Mol.Cell.Biol.，8，3546(1988))；促進角質化細胞的生長；調節(jié)骨代謝；促進腎小球膜細胞的生長；抑制黑素瘤和乳癌細胞的生長，等。
按照已有的報道，各種疾病可能是由于IL-6產生失調而引起的。報道的疾病例子是類風濕性關節(jié)炎(Hirano，T.等，Eur.J.Immunol.，18，1797(1988))，肝硬變(Devere，J.等，Clin.EXP.Immunol.，77，221(1989))，牛皮癬(Grossman，R.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86，6367(1989))，多發(fā)性骨髓瘤(Bataille，R.等，J.Clin.Invest.，84，2008(1989))，心臟粘液瘤，AIDS(Niles，S.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87，4068(1990))以及其他自身免疫疾病。這些發(fā)現(xiàn)證實了調節(jié)IL-6的產生對維持人體免疫系統(tǒng)體內平衡以及治療和預防疾病的重要性。
所以，人們已經提議調節(jié)白介素產生的許多途徑。例如，使用抗IL-6或IL-6受體的抗體已經抑制了患有因IL-6分泌過剩引起骨髓瘤的患者的單核細胞的增生(Suzuki，H.，Eur.J.Immunol.，22，1989(1992))。盡管如此，還沒有報道特異性抑制IL-6產生的物質或方法，因此，仍存在發(fā)現(xiàn)抗IL-6產生的特異性抑制劑的需要。
發(fā)明概述所以，本發(fā)明的一個目的是提供一種從粉防己根中獲得的能夠特異性抑制IL-6產生的提取物。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有有效量的該提取物的一種藥物組合物，它能夠治療因IL-6的過量產生而引起的免疫疾病。
附圖的簡要說明結合附圖從下面本發(fā)明的說明書將會清楚本發(fā)明上述和其他目的及特征，其中

圖1顯示了粉防己提取物A和B對人單核細胞和巨噬細胞的細胞毒性；圖2描述了粉防己提取物A和B對人單核細胞和巨噬細胞中IL-6的產生的抑制作用；圖3表示了粉防己提取物A對大鼠肺泡巨噬細胞中IL-6的產生的抑制作用；圖4公開了粉防己提取物C對大鼠IL-6的產生的抑制作用；
圖5表示了粉防己提取物C對大鼠肺成纖維細胞中IL-6的產生的抑制作用；圖6說明了粉防己提取物B對關節(jié)炎患者的滑膜細胞中IL-6的基因表達的抑制作用；圖7顯示了粉防己提取物A對關節(jié)炎患者的滑膜細胞增生的抑制作用；圖8表示了粉防己提取物A對大鼠肺成纖維細胞中膠原的產生的抑制作用；圖9反映了粉防己提取物C對大鼠肺組織中膠原的產生的抑制作用；圖10證實了粉防己提取物A對人單核細胞和巨噬細胞中的活性氧的產生的抑制作用；圖11顯示了粉防己提取物A，B，C和D對患有誘發(fā)性肝硬變的大鼠血清中的GOT和GPT含量的作用；以及圖12記錄了粉防已提取物A，B，C和D對大鼠肝硬變的作用。發(fā)明的詳細說明本文所引用的全部參考文件這里都把它們的全文作為參考。
按照本發(fā)明，已經發(fā)現(xiàn)了從粉防己根中獲得的提取物具有特異性抑制IL-6產生的能力；所以，該提取物可用于治療各種因IL-6的過量產生而引起的免疫疾病。
所述的粉防己提取物可以使用各種溶劑如甲醇，乙醇，己烷，二氯甲烷或其混合物，生理鹽水，蒸餾水等制備。具體來說，下面進一步描述的粉防己提取物A，B，C和D可以按照下面優(yōu)選實施例制備。
向1千克的粉防己干燥根中加入1-3升，優(yōu)選2升的甲醇；在50-70℃把該混合物加熱6-12小時，或者在室溫下加熱至少24小時，然后過濾。重復上述步驟，優(yōu)選重復三次，在減壓下如7mmHg濃縮合并的濾液獲得提取物A。
用200-400毫升、優(yōu)選250毫升甲醇和200-400毫升、優(yōu)選250毫升己烷萃取100克所述的提取物A。從中分離出甲醇部分并減壓濃縮。用氫氧化銨或氫氧化鈉把殘余物的pH值調到9-11的范圍。用400-800毫升、優(yōu)選500毫升的蒸餾水和二氯甲烷的混合物(1∶1(v/v))萃取所獲得的產物。從中分離出二氯甲烷部分，即生物堿部分，然后減壓濃縮獲得提取物B。
另一方面，把1千克的粉防己干燥根切碎，過篩，然后以50-200mg/ml、優(yōu)選100mg/ml的濃度懸浮于蒸餾水或生理鹽水中。把所獲得的懸浮液在80-100℃、優(yōu)選95℃加熱4-12小時，優(yōu)選6小時。過濾加熱過的懸浮液并減壓濃縮獲得提取物C。
還有一種方法是，把1千克的粉防己干燥根與1-3升、優(yōu)選2升蒸餾水混合并在80-100℃、優(yōu)選95℃加熱4-15小時，優(yōu)選12小時。把加熱過的混合物過濾并減壓濃縮。把殘余物在-70至-90℃、優(yōu)選-80℃貯存2-10小時、優(yōu)選8小時，然后冷凍干燥4-8小時、優(yōu)選6小時獲得粉末狀提取物C。
另外，向1千克的粉防己干燥根中加入1-3升，優(yōu)選2升乙醇并在60-90℃加熱該混合物6-12小時，或者在室溫加熱至少24小時，然后過濾并減壓濃縮合并的濾液，重復上述步驟，優(yōu)選重復三次，獲得提取物D。
所述的提取物A，B，C和D都具有抗炎、抑制膠原合成和活性氧產生并且降低血清中的GOT和GPT的含量等作用。所以，它們能夠單獨或者相互于一種藥物組合物中組合使用以治療因IL-6的過量產生而引起的免疫疾病如風濕性關節(jié)炎，肝硬變，牛皮癬，多發(fā)性骨髓瘤，心臟粘液瘤，矽肺和愛滋病。盡管如此，優(yōu)選是用提取物A治療炎性疾病，關節(jié)炎和纖維發(fā)生疾?。惶崛∥顱治療關節(jié)炎和自身免疫肝硬變；提取物C治療矽肺和肝臟的纖維發(fā)生疾?。灰约疤崛∥顳治療肝硬變。
本發(fā)明用于治療因IL-6的過量產生而引起的免疫疾病的藥物組合物可以含有藥物可接受的賦形劑，載體或稀釋劑和作為活性成分的粉防己提取物。可以采用常規(guī)方法將其制成藥物制劑。
制備組合物時，優(yōu)選把該活性成分與一種載體混合或稀釋，或者用一種載體包埋，這種載體可以是膠囊，香囊或其他裝載形式。當載體是稀釋劑時，它可以是固體，半固體或液體物質，其作為活性成分的載體，賦形劑或介質。所以，該組合物可以是片，丸，粉末，香囊，醑劑，懸浮液，乳濁液，溶液，糖漿，氣霧劑，軟和硬明膠膠囊，無菌注射液，無菌包裝的粉末等等形式。
適當的載體，賦形劑或稀釋劑的例子有乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯膠，藻酸鹽，明膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，水，甲基羥基苯甲酸鹽，丙基羥基苯甲酸鹽，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。該制劑中還可以加入潤滑劑，濕潤劑，矯味劑，懸浮劑，防腐劑等等。本發(fā)明組合物可以采用本領域所熟知的任何方法如此制備，以使得患者施用后，活性成分能夠快速、持續(xù)成緩慢釋放。
該藥物組合物能夠通過各種途徑如口服，經皮，皮下，靜脈和肌肉引入進行給藥。一般活性成分的每日用量可以為1-500μg/kg體重，優(yōu)選為30-300μg/kg體重，并且能夠一次或多次服用。但是，應當明白該活性成分的實際給藥量必須取決于各種相關因素如待治療的疾病，所選擇的給藥途徑，不同患者的年齡和體重以及患者癥狀的嚴重程度；所以，上述劑量不是用于限定本發(fā)明的范圍。
下面的制備例和實施例用來更詳細地說明本發(fā)明但不限定其范圍；除非有其他說明，本文實施例中所用的試驗方法是按照下文中所給出的參考文件實施例進行實施的。
而且，除非作其他特別說明，下面所給出的固體和固體混合物，液體和液體以及固體和液體混合物的百分比分別以wt/wt，vol/vol和wt/vol為準。制備例粉防己提取物的制備把4.0千克左右的粉防己完全干燥的根切細并用5升左右的甲醇提取兩天。把該提取步驟重復三次并減壓濃縮合并的提取液獲得224克左右的甲醇提取物(提取物A)，產率為5.6％。
用500毫升的90％甲醇和500毫升的正己烷萃取200克的提取物A。分離出90％的甲醇相層并減壓濃縮除去甲醇。用0.1M的氫氧化銨把殘余物的pH值調到10并用600毫升的蒸餾水和二氯甲烷的混合物(1∶1(v/v))萃取。然后，分離出二氯甲烷相層，即生物堿組分并減壓濃縮獲得25克左右的提取物B，產率為0.6％。
另一方面，按如下制備用于在一次檢測中治療矽肺的提取物C。把1千克的粉防己干燥根粉碎，過篩(60目)，然后以100mg/ml的濃度懸浮于蒸餾水中。把所獲得的懸浮液在100℃加熱6小時并過濾。減壓濃縮濾液獲得80克粉防己的水提取物(提取物C)，產率為8％。然后，在-20℃貯存。
為了制備用于在一次檢測中治療肝硬變試驗的提取物C，把1113.5克的粉防已干燥根放入加有2升蒸餾水的、安裝有冷卻裝置的3升園底燒瓶中，在95℃把該混合物加熱12小時，然后過濾。把濾液用一臺旋轉真空蒸發(fā)器(Buchi 451)中減壓濃縮，用一臺深度冷凍器(SANYO，日本)在-84℃冷凍3小時，然后用冷凍干燥器(EYELA，日本)冷凍干燥4小時獲得56.55克粉末狀提取物C，產率為5.1％。
進一步地，在室溫下用1.5升甲醇將500克粉防己干燥根提取3天。把該提取步驟重復三次并減壓濃縮合并的提取物獲得13克粉防己的乙醇提取物，產率為2.6％。參考實施例1用于檢測的細胞的分離(1)人單核細胞，巨噬細胞和嗜中性細胞的分離把正常人的外周血進行肝素處理并用等量的Hank氏平衡鹽溶液(HBSS無Ca2+和Mg2+)稀釋。把稀釋的血液放入一離心管中，該離心管中含有堆積在密度為1.119的Ficoll-Hypaque(Sigma，St.Louis，MO，U.S.A.)層上的密度為1.077的Ficoll-Hypaque(Sigma，St.Louis，MO，U.S.A.)層，然后在700xg離心30分鐘從密度為1.077的Ficoll-Hypaque層和血清層之間獲得單核細胞，并且從密度為1.077的Ficoll-Hypaque部分和密度為1.119的Ficoll-Hypaque層之間獲得嗜中性細胞。使用4℃HBSS(無Ca2+和Mg2+)將分離出的細胞并將洗滌兩次其懸浮于含有10％牛胎血清(FBS，Hyclone，Logan，UT，U.S.A.)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，GrandIsland，NY，U.S.A.)中。把該懸浮液加入24孔培養(yǎng)平板(Costar，Cambridge，MA，U.S.A.)的孔中并在37℃溫育2小時獲得單核細胞，巨噬細胞和嗜中性細胞。(2)成纖維細胞的分離使用如下對Phan，S.H.等在J.Clin.Invest.，76，241(1985)中所述的方法的改良方法從大鼠中分離成纖維細胞。
把大鼠用乙醚麻醉并在無菌工作臺上分離肺。把肺切成2-4mm大小的小片并懸浮于含有膠原酶和0.5％胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，在37℃把該組織消化2小時。用無菌紗布過濾該懸浮液除去，如沒消化的組織。使用PBS把分離出的細胞洗滌兩次或三次并懸浮于含有10％牛胎血清(FBS，Hyclone，Logan，UT，U.S.A.)的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY，U.S.A.)中。把該懸浮液加入培養(yǎng)板的孔中并在5％二氧化碳培養(yǎng)器(Lunaire Environ，Inc.，Pennsylvania，U.S.A.)中37℃溫育1-2小時。使用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌該平板以除去不能附著在平板上的細胞。向平板中加入新鮮的培養(yǎng)基并繼續(xù)溫育直到形成融合層。在下面試驗中使用不超過5次傳代培養(yǎng)的細胞。
在如上所述的相同條件下在含有10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)NIH3T3成纖維細胞(ATCC CRL 1658)。(3)從風濕性關節(jié)炎患者中分離滑膜細胞使用涼的PBS把患有風濕性關節(jié)炎患者的滑膜洗滌三次并用無菌剪刀將其剪成2mm大小的小片，然后將其懸浮于含有膠原酶A(5mg/ml，BM，Indianpolis，IN，U.S.A.)和I型脫氧核糖核酸酶(0.15mg/ml，Sigma)的DMEM(Sigma，U.S.A.)中并在5％二氧化碳培養(yǎng)器中37℃溫育2小時。然后，向其中加入0.5％胰蛋白酶-0.2％EDTA，繼續(xù)溫育30分鐘。把消化的組織使用PBS洗滌兩次，使用DMEM洗滌一次，把分離出的細胞懸浮于含有10％FBS(DMEM-10％FBS)的DMEM中并溫育一周。
此后，使用胰蛋白酶-EDTA分離粘著的滑膜細胞，使用EDTA洗滌，然后以105個細胞/毫升懸浮于DMEM-5％FBS。把該懸浮液以1毫升/每孔的量加入24孔培養(yǎng)板的孔中并在37℃溫育24小時。把所獲得的培養(yǎng)基在-20℃貯存以用于下列試驗，把一部分進行傳代并以冷凍狀態(tài)貯存在液氮箱中。(4)使用粉防己提取物處理這些細胞以各種不同的濃度把粉防己提取物加入5×105/ml上述步驟獲得的細胞中，在5％二氧化碳培養(yǎng)器中把細胞在37℃下預溫育1小時。然后，向其中加入硅(100μg/ml)和含有2％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基各1毫升并且在如上述相同條件下把細胞培養(yǎng)48小時。收集培養(yǎng)的上清液并以1,500rpm離心分離10分鐘除去這些細胞和硅。把所獲得的上清液進行透析除去PBS并用0.2um的過濾注射器過濾，然后，把濾液在-20℃貯存。參考實施例2粉防已提取物細胞毒性的測定采用下列步驟測定粉防己提取物的細胞毒性。
按照參考實施例1(4)的步驟，分別使用在制備例中獲得的并在相同條件下溫育的0.1，1和10μg/ml的提取物A和B處理在參考實施例1(1)中所獲得的各5×105個細胞/毫升的單核細胞和巨噬細胞。根據Alley，M.C.，等在Cancer Res.，48，598(1988)中所描述的方法，把該培養(yǎng)物以1毫升/孔的量加入培養(yǎng)平板的孔中并向各孔加入0.5mg的3-4，5-二甲基噻唑-2，5-二苯基-四唑溴(MTT，Sigma)。在37℃溫育4小時后，把培養(yǎng)基離心分離除去上清液。把各100μl酸化異丙醇(在異丙醇中有0.04NHCl)加入各孔的細胞中以洗脫由活細胞產生的甲，并且使用一臺ELISA讀數器(Titertek mμltiskan Mcc/340)在540nm測定光密度(O.D.)(圖1)。
圖1顯示了當以沒有使用提取物A或B處理的對照組的光密度看作100％時，樣品光密度與提取物A或B的濃度的相對值。當由于粉防己提取物的細胞毒性而使單核細胞和巨噬細胞的存活率下降時，能夠引起光密度下降的甲的產生也在減少。直到提取物A的濃度達到10μg/ml，使用提取物A處理過的樣品與對照組也沒有顯著性差異，并且，使用提取物B處理過的樣品也顯示了相似的結果。所以，可以確認以低于10μg/ml的濃度使用的提取物A和B沒有細胞毒性，本文以后全部試驗都是在這個濃度范圍內進行的。以100μg/ml的濃度使用時提取物A和B都顯示出細胞毒性。
另一方面，使用大鼠也確定了提取物C和D的細胞毒性。把提取物C和D各40mg對大鼠一周兩次口服給藥17周，結果，對大鼠沒有顯示出毒性(死亡，體重減輕等)。實施例1粉防己提取物對人單核細胞和巨噬細胞中IL-6產生的抑制使用0.1-10μg/ml的提取物A或B溫育參考實施例1(1)中獲得的單核細胞/巨噬細胞1小時并使用100μg/ml的硅處理48小時。把培養(yǎng)物離心分離獲得上清液，然后，將上清液在PBS中透析。使用IL-6依賴的B9雜交瘤細胞系測定其中IL-6的活性。
把B9細胞系(Df.Kishimoto，T.，Osaka Unversity，日本)在含有10％FBS并又加入2U/ml的重組人IL-6的RPMI 1640培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并且用無血清的培養(yǎng)基把細胞洗滌三次。再將細胞以5×104個細胞/毫升的濃度懸浮于含有10％的FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，把該懸浮液以100μl/孔的量加入一個96孔培養(yǎng)平板皿的孔中。然后，在37℃5％二氧化碳下把平板溫育68小時。把0.5μCi的3H-胸苷以50μl/孔的量加入孔中并繼續(xù)溫育4小時。溫育完成后，使用多細胞收集器(Inotech)把細胞收集在玻璃纖維濾器中并使用液體閃爍計數器(Beckman，Somerset，NJ，U.S.A.)測定摻入的3H-胸苷的量。
圖2顯示了當以沒有使用提取物A或B處理的對照組中摻入的3H-胸苷的量看作是100％時，摻入的3H-胸苷的量與提取物A或B的濃度的相對值。從圖2可以看到，粉防己提取物A或B是以依賴濃度的方式抑制單核細胞/巨噬細胞中IL-6的產生的，并且使用10μg/ml的粉防己提取物A或B能夠抑制50％。實施例2粉防已提取物對大鼠肺泡巨噬細胞中IL-6產生的抑制把大鼠用氯胺酮麻醉并向大鼠的氣管鰓中插入一只無菌的薄管再用一只30ml的注射器重復注射三次并吸取10mlRPMI 1640培養(yǎng)基獲得大鼠的肺泡巨噬細胞。把所獲得的細胞以400xg離心分離5分鐘，懸浮于50ml含有10％的FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，然后在37℃溫育2小時使這些細胞粘著在培養(yǎng)平板上。用PBS把該平板洗滌兩次除去肺泡淋巴細胞(漂浮的細胞)并獲得肺泡巨噬細胞。
把肺泡巨噬細胞以2×105個細胞/孔的量加入24孔培養(yǎng)平板的孔中并用100μg/ml的硅和10μg/ml的提取物A處理3天。離心分離培養(yǎng)基獲得上清液，然后在PBS中透析。按照實施例1中所述的步驟使用IL-6依賴的B9雜交瘤細胞系測定其中的IL-6的活性。
結果發(fā)現(xiàn)，提取物A也抑制大鼠肺泡巨噬細胞中IL-6的產生(圖3)。在圖3中，培養(yǎng)液，Si和Si+EXT.A分別表示沒有處理的對照組，硅刺激的樣品和硅刺激又提取物A處理的樣品。實施例3提取物C對IL-6產生的抑制為了制備試驗用的矽肺模型，把每治療組五只體為150g左右的Sprague-Dawley大鼠的肺泡打開并注射溶于0.5mlPBS中的500mg硅。
注射硅一周后，給大鼠每周兩次口服40mg的提取物C或者靜脈內或腹膜內注射250μg鼠IL-6抗體(MIL-6Ab，Immunex，Seatle，U.S.A.)17周。按照實施例1中所述的相同步驟測定血清(圖4)中和參考實施例1(2)中所獲得的肺成纖維細胞培養(yǎng)物(圖5)中的IL-6的活性。
從圖4和圖5中可以看到，在這兩種情況下提取物C都能抑制IL-6的活性，這表明粉防己提取物對矽肺動物模型具有抑制作用。在圖4和圖5中，正常組，Si和Si+EXT.C和Si+MIL-6 Ab分別表示用PBS處理的對照組，硅刺激的樣品和硅刺激又提取物C處理的樣品，以及硅刺激又MIL-6 Ab刺激的樣品。實施例4粉防己提取物對IL-6基因表達的抑制為了確認粉防已提取物抑制IL-6的基因表達，如下測定該提取物對從由于IL-6的過量產生而引起的類風濕性關節(jié)炎患者中獲得的滑膜細胞(Hirano，T.等，Eur.J.Immunol.，18，1797(1988))的作用。
把在參考實施例1(3)中分離出的滑膜細胞以1.5×106個細胞/孔的量加入培養(yǎng)平板的孔中并在37℃5％二氧化碳下把平板溫育24小時使其粘著在孔中。把1μg/ml或10μg/ml的提取物A加入該孔并在37℃5％二氧化碳下把平板溫育3天。溫育完成后，離心分離培養(yǎng)液除去上清液并將沉淀的細胞用PBS洗滌，加入500μl變性溶液(4M硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，pH7.0，0.1M2-巰基乙醇，0.5％肌氨酸)并且輕輕吸取進行細胞破裂。把所獲得的溶液轉入一只試管中并向其中加入50μl的2M檸檬酸鈉(pH4.0)和500μl水飽和的苯酚，完全混合。然后，向該混合物中加入兩倍體積的氯仿，把所獲得的混合物在冰中貯存10分鐘，以12,000rpm離心分離以獲得上清液，向上清中加入1ml的異丙醇并將得的混合物在-20℃貯存2小時，然后以12,000rpm離心20分鐘獲得沉積的片狀沉淀物。把該片狀沉淀物用70％的甲醇洗滌，干燥，然后溶于20μl的0.1％焦碳酸二乙酯-水到最終濃度為10μg/ml。
為了從上述獲得的RNA合成單股cDNA，如下使用M-MLV逆轉錄酶(Promega，U.S.A.)進行逆轉錄反應。向反應試管中加入5μl的5x反應緩沖液(250mM的Tris-HCl，pH8.3，375mM的KCl，15mM的MgCl2，50mM的DTT)，2μl的5μM dNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP和dTT各5μM)，1μl(0.2μg)的引物NotI-dT(5-dCGCCGGCG(T)1s-3’)，1μl的蒸餾水，10μl的該細胞RNA和1μl(200U)的M-MLV逆轉錄酶(Promega，U.S.A.)，把所獲得的溶液充分混合，然后，在42℃反應30分鐘。在90℃把溶液加熱5分鐘來終止該反應。
使用上述所獲得的溶液，進行聚合酶鏈反應(PCR)來擴增cDNA。
把20μl逆轉錄反應所獲得的溶液，8μl的10x聚合酶鏈反應的緩沖液(100mM的Tris-HCl，pH8.3，400mM的KCl，10mM的DTT，15mM的MgCl2，5μg/ml的BSA)，1μl(20pmol)的5’-末端引物(5’ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3’)，1μl(20pmol)的3’-末端引物(5’-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3’)，69μl的蒸餾水和1μl(2.5U)的Taq DNA聚合酶(Promega，U.S.A.)完全混合并將該混合物在9℃下貯存5分鐘來抑制其他不需要的酶。聚合酶鏈反應的進行是把由95℃1.5分鐘；55℃1分鐘；72℃1.5分鐘組成的熱循環(huán)重復30次，最后，把該反應混合物在95℃反應1.5分鐘；在55℃反應1分鐘和在72℃反應5分鐘。
在1.0％瓊脂糖凝膠上100伏特電壓下把10μl聚合酶鏈反應產物電泳30分鐘。把該凝膠用EtBr溶液染色10分鐘，用蒸餾水洗滌并且攝影(圖6)。從圖6可以看到，提取物B沒有影響用作對照組的一直表達的腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(APRT)RNA的表達，同時濃度為10μg/ml的提取物B顯著性地抑制了IL-6 RNA的表達。結果表明粉防己提取物能夠抑制IL-6基因的表達。在圖6中，泳道M是標準DNA大小標記，而10，1和0表示單位為μg/ml的提取物B的濃度。實施例5粉防己提取物對滑膜細胞增生的抑制按照參考實施例1(4)所述的步驟，使用0.1-100μg/ml濃度范圍的提取物A處理人單核細胞/巨噬細胞并對這些細胞進行培養(yǎng)。在PBS中透析培養(yǎng)物，向透析液中加入1×104個滑膜細胞，然后把細胞培養(yǎng)五天。在PBS中向培養(yǎng)基中加入3H-胸苷后，再把細胞培養(yǎng)4小時，使用液體閃爍計數器測定細胞中摻入的3H-胸苷的量(圖7)。從圖6可以看到，在10μg/ml濃度時提取物A能夠顯著性地抑制滑膜細胞的增生。實施例6粉防己提取物對膠原合成的抑制我們已知IL-6是一種能夠引起大鼠成纖維細胞的纖維發(fā)生和誘發(fā)成纖維細胞的膠原合成細胞因子(Kang，H.S.等，Korean.J.Immunol.，14，193(1992))。為了證實粉防己提取物對IL-6這類功能的能力，測定它對大鼠肺成纖維細胞和肺泡組織中膠原合成的抑制作用。采用抑制間接ELISA方法測定大鼠肺成纖維細胞的培養(yǎng)物中所產生的膠原量，通過測定羥脯氨酸的濃度并使用內部對照組的標準曲線計算其中膠原的量來決定肺泡培養(yǎng)物中所產生的膠原量。
為了測定大鼠肺成纖維細胞培養(yǎng)物中所合成的膠原量，把作為內部對照組的膠原(Sigma，I型)完全溶于含有1mg/ml胃蛋白酶的1M乙酸中，并使用包被緩沖液(0.05M碳酸鹽，pH9.6)把該溶液在1μg-16pg濃度范圍內連續(xù)稀釋5倍。把稀釋的溶液以100μl/孔的量加入平底微滴平板(Dynatech，Cantilly，VA，U.S.A.，Immμl lon 2)的孔中。
另一方面，使用快速真空干燥器(Savant，Hicksville，NY，U.S.A.)把1ml參考實施例1(2)中所獲得的大鼠肺非成纖維細胞的培養(yǎng)物上清液濃縮10-20倍并溶于100μ1包被緩沖液(0.1M NaHCO3，0.02％NaN3；。用Na2CO3把pH調節(jié)到9.6)，以100μl/孔的量把該溶液加入孔中，然后在4℃貯存過夜。
用洗滌緩沖液(PBS，0.05％Tween 20，pH7.4)把平板洗滌三次，并且把1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)以100μl/孔的量加入孔中。在室溫下把平板溫育2小時來封閉未包被部分。用上述相同的緩沖液把平板洗滌三次，然后以100μl/孔的量向孔中加入用稀釋緩沖液(0.05M Tfis-HCl，1mM MgCl26·H2O，0.15M NaCl，0.02％NaN3，1％BSA，0.05％Tween20，pH8.1)稀釋了1,000倍的堿性磷酸酶-結合的鼠抗山羊IgG(Cappel，Dunham，NC，U.S.A.)。
在37℃下把平板溫育2小時，然后用上述相同的緩沖液把平板洗滌三次。以100μ1/孔的量向孔中加入用底物緩沖液(0.05MNaHCO3，10mM MgCl2·6H2O，pH9.8)稀釋到1mg/ml濃度的對硝基苯基磷酸鹽，并且用一臺ELISA讀數器在405nm測定培養(yǎng)液的O.D.。由O.D.值與內部對照組的OD值計算出所產生的膠原量。結果發(fā)現(xiàn)，在37℃用10μl/ml的提取物A預處理1小時并用100μl/ml的硅處理48小時后的大鼠肺成纖維細胞培養(yǎng)物中合成的膠原量顯著下降(圖8)。在圖8中，Si+PBS和Si+EXT.A分別表示用硅刺激的樣品和提取物A處理又硅刺激的樣品。
而且，為了按照實施例3的步驟測定大鼠肺泡組織中所合成的膠原量，把大鼠的支氣管打開并注射500mg的硅，給大鼠一周兩次口服溶于1％DMSO的40mg提取物C或只口服1％DMSO 17周，然后，如下測定羥脯氨酸的量。
在一只Pyrex試管(Corning，Rochestor，NY，U.S.A.)中把0.1-0.2g的大鼠肺泡組織與1ml的PBS混合，然后將其粉碎。用一臺超聲發(fā)生器(Heat system，W-380)破碎所獲得的組織提取物，向其中加入1ml鹽酸并把該混合物在120℃的干燥烘箱中干燥過夜。用冰箱冷凍所獲得的物質，在冷凍干燥器(labconco)中凍干并向其中加入1ml蒸餾水完全溶解。把50μl所獲得溶液加入一只微量離心試管中并向其中加入50μl蒸餾水稀釋該溶液。作為內部對照組，把順式-γ-羥基-L-脯氨酸(Sigma)稀釋到20μg-150pg的濃度范圍內，并且把100μl的各種稀釋溶液加入微量離心試管中。
向試管中加入0.9ml的由1.41g的氯胺-T(N-氯-P-甲苯磺胺鈉)溶于10ml的正丙醇制得的溶液和10ml蒸餾水，將其在室溫下貯存20分鐘。然后，向所獲得的混合物中加入1ml醛/高氯酸溶液，該溶液是由15g對二甲基氨基苯甲醛溶于62ml正丙醇，然后向其中加入26ml60％的高氯酸使總體積為100ml而制成，把所獲得的溶液完全混合。將該微量離心試管放入65℃的水浴15分鐘使之顯色，在650nm測定樣品的O.D.，使用內部對照組的標準曲線計算樣品中羥脯氨酸的量。
從圖9的結果可以看到，當把正常大鼠肺泡組織(正常)所產生的膠原量當作100％時，只用硅處理(Si)或用硅和磺酸二甲酯處理(Si+DMSO)的大鼠肺泡組織中所合成的膠原量顯著升高，同時，用硅，DMSO和提取物C處理(Si+EXT.C)的大鼠肺泡組織中所合成的膠原量下降50％。上述結果表明粉防己提取物具有抗纖維產生的能力。實施例7粉防己提取物對活性氧產生的抑制我們知道炎性反應是包括從被各種刺激物刺激的免疫細胞中分泌各種細胞因子如IL-6；由該細胞因子刺激的其他免疫細胞產生磷脂酶A2，溶媒體酶，反應氧類等等；和由上述產物誘發(fā)的組織壞死這些串聯(lián)反應(Pruzanski，W.和Vadas，P.，Immunol.Today，12，143(1991))。通過測定粉防己提取物對活性氧如H2O2和O2-產生的抑制活性來證實粉防已提取物阻斷炎性反應的能力。
如下使用一臺具有96孔微平板的微型測量器來測定H2O2的量。向含有RPMI 1640培養(yǎng)基的各孔中加入5×105個嗜中性細胞，并且再向各孔中加入25μl的辣根過氧化物酶(500μg/ml；II型，Sigma)和75μl的酚紅(1mg/ml)。此后，把細胞使用10，20和50μg/ml的提取物A處理1小時，用10M十四酰佛波乙酸酯(PMA)刺激細胞，然后在37℃60分鐘。溫育完成后，把3M的NaOH以25μl/孔的量加入這些孔中來終止反應并使用ELISA讀數器(DynatechLab.Inc)測定620nM處的O.D.來判定與酚紅氧化相關的顏色變化。使用由稀釋的H2O2(Sigma)制得的標準曲線來測定H2O2的量。
為了測定所產生的O2-的量，把懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基中濃度為1×106個細胞/800μl的嗜中性細胞加入24孔平板的一部分孔中并向空余的孔中加入10μg/ml過氧化物歧化酶(SOD，Sigma)。把該平板在37℃貯藏2分鐘，并且把細胞色素C(3mg/ml，Sigma)以100μl/孔的濃度加入這些孔中。用10，20和50μg/ml的提取物A把細胞處理1小時并加入10-7M的PMA促進劑在37℃下反應20分鐘。向這些孔中加入1mm的N-乙基順丁烯二酰亞胺(Sigma)來終止反應并在1,600xg把培養(yǎng)基離心分離10分鐘獲得一種上清液。使用一臺紫外可見分光光度計(Kontron Instrument，Nilano，Italy)測定550nm處的由細胞色素C的還原引起的上清液的顏色變化。所產生的O2-的量可以使用SOD的濃度來表示，SOD能夠抑制在1×106個細胞中細胞色素C的還原20分鐘，或者使用細胞色素C的消光系數(E＝1.83×104mM-1cm-1)來表示。從表I可以看到，50μg/ml提取物A能夠抑制50％的H2O2的產生，和25％O2-的產生。這種結果表明提取物A對炎性反應具有強抑制活性。
表I粉防己提取物A對人嗜中性細胞中反應氧類產生的抑制作用
另一方面，重復上述相同的步驟測定由5×105個細胞的人單核細胞/巨噬細胞所產生的H2O2和O2-的量，其中的人單核細胞/巨噬細胞使用10μg/ml的提取物A在37℃下處理了1小時，然后用100μg/ml的硅進行刺激。從圖10可以看到，在硅刺激的和提取物A處理的單核細胞/巨噬細胞(Si+EXT.A)與僅用硅處理的對照組(Si+MED)相比H2O2和O2-的量顯著降低。實施例8粉防己提取物對肝硬變的抑制肝硬變(肝硬化)特征是整個肝臟產生纖維，纖維間隔把肝臟的實質細胞全部破碎以及再生瘤形成。它們多數源于慢性肝炎或慢性酒精中毒，但是，準確的原因還不清楚。在肝硬變患者細胞因子如參與在發(fā)炎和纖維產生中的IL-6的量處于增長狀態(tài)；所以，通過抑制IL-6的活性可以測定粉防己提取物對肝硬變的抑制。
為了在四周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠誘發(fā)試驗性肝硬變(Nakataukasa，H.，等，J.Clin.Invest.，85，1833-1843(1990))，給大鼠一周兩次腹膜內注射1.0ml/100g體重的四氯化碳溶液(50％四氯化碳+50％玉米油)，并且在注射四氯化碳的同時給大鼠一周兩次口服提取物A，B，C和D各0.2ml。開始試驗13周后，把每只大鼠用乙醚麻醉并從心臟中獲得血液樣品來測定血清谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(sGOT)值和血清谷氨酸丙酮酸轉氨酶(sGPT值)(圖11)。
從圖11可以看到，當與從使用CCl4，DMSO和作為對照組的PBS處理的大鼠中獲得的血液樣品進行比較時，從使用提取物A或C處理的大鼠中獲得的血液樣品的sGOT值沒有降低，但是，從使用提取物D或B處理的大鼠中獲得的血液樣品的sGOT值分別下降了20％和40％。而且，從使用提取物B處理的大鼠中獲得的血液樣品的sGPT值下降了60％以上。
為了從上述大鼠分離出的肝臟的病理組織學檢查，把肝臟在10％的中性福爾馬林水溶液固定，切成4mm厚，然后包埋在石蠟中。把包埋的組織切成5mm厚的片，用蘇木精曙紅和Nasson氏三色染色，然后在顯微鏡下觀察(圖12)。
從圖12可以看到，在只使用四氯化碳的大鼠的肝臟中(B)，有變厚纖維帶的肝小葉的瘤的形成比正常肝臟(A)更明顯。在使用四氯化碳和提取物B(F)；四氯化碳和提取物C(E)和四氯化碳和提取物D(D)的大鼠的肝臟中，盡管表現(xiàn)出了肝硬變的癥狀，但是，肝小葉瘤周圍的纖維帶比從只使用四氯化碳處理的大鼠中獲得的肝臟的肝小葉瘤周圍的纖維帶更薄，與從只使用四氯化碳處理的大鼠中獲得的肝臟的瘤相比，許多不完整形成，并且與從只使用四氯化碳處理的大鼠中獲得的肝臟的肝細胞的再生變化相比，肝細胞的再生變化下降。在使用四氯化碳和提取物A(C)的大鼠的肝臟中，對肝硬變的抑制作用低于D，E和F組。
下列制劑例僅用于詳細說明而不是對本發(fā)明范圍的限定。制劑例使用下列組分制備硬明膠膠囊用 量(mg/膠囊)活性成分 20干淀粉 160硬脂酸鎂 20總量 200mg把上述組分混合并以每個單位膠囊200mg的量填充到硬明膠膠囊中。
在上述具體實施例描述本發(fā)明的同時，我們應該清楚可以作出的各種改良和變化并且它們也屬于下列權利要求所限定的本發(fā)明保護范圍內。
權利要求
1.一種粉防己根的提取物，它可以用于治療因白介素-6的過量產生而引起的免疫疾病。
2.權利要求1的提取物，其是用甲醇，乙醇，二氯甲烷，水或其混合物提取的。
3.權利要求2的提取物，其是用這樣一種方法制得的，該方法包括下列步驟把甲醇加入粉防己根中；在50-70℃的溫度范圍內把該混合物加熱6-12小時；過濾加熱過的混合物獲得濾液；濃縮濾液獲得提取物A。
4.權利要求2的提取物，其是用這樣一種方法制得的，該方法包括下列步驟用甲醇和己烷把權利要求3中獲得的提取物A進行萃取獲得甲醇部分；濃縮該甲醇部分；把濃縮液的pH調到9-11的范圍內；用蒸餾水和二氯甲烷萃取pH調好的濃縮液獲得二氯甲烷部分；濃縮該二氯甲烷部分獲得提取物B。
5.權利要求2的提取物，其是用這樣一種方法制得的，該方法包括下列步驟以50-200mg/ml的濃度把粉防己根的粉末懸浮于一種水溶液中；在80-100℃的溫度范圍內把該懸浮液加熱4-12小時；過濾加熱過的懸浮液；濃縮濾液獲得提取物C。
6.權利要求2的提取物，其是用這樣一種方法制得的，該方法包括下列步驟把水加入粉防己根中；在80-100℃的溫度范圍內把該混合物加熱4-12小時；過濾加熱過的混合物；濃縮濾液；把該濾液在-70到-90℃下貯存2-10小時；并且將其冷凍干燥4-8小時獲得提取物C。
7.權利要求2的提取物，其是用這樣一種方法制得的，該方法包括下列步驟把乙醇加入粉防己根中；在60-90℃的溫度范圍內把該混合物加熱至少4小時；過濾加熱過的混合物；并濃縮濾液獲得提取物D。
8.一種藥物組合物，它含有治療有效量的權利要求1的提取物和藥物可接受的載體。
全文摘要
各種能夠抑制白介素-6的產生的粉防已根提取物，及其制備方法和用于治療因白介素-6的過量產生而引起的免疫疾病的含有所述提取物的藥物組合物。
文檔編號A61K36/18GK1150389SQ95193509
公開日1997年5月21日 申請日期1995年6月5日 優(yōu)先權日1994年6月9日
發(fā)明者邊光浩, 崔仁杓, 姜馨植, 李晶埈, 金榮鎬 申請人:韓國科學技術研究院