一種基于酰胺基團(tuán)納米膠乳增強(qiáng)比濁法動(dòng)物c-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫診斷領(lǐng)域，具體涉及一種基于酰胺基團(tuán)納米膠乳增強(qiáng)比濁法 動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] C-反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein，簡稱為CRP)是由Tillet和Francis在 1930首先發(fā)現(xiàn)，因其能與肺炎鏈球菌細(xì)胞壁的C多糖起沉淀反應(yīng)而命名。CRP作為一種 急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，是在白介素-6的介導(dǎo)下主要由肝臟產(chǎn)生，同時(shí)受白介素-1、腫瘤壞死 因子a等的調(diào)節(jié)和刺激，在動(dòng)脈粥樣硬變處、腎臟、神經(jīng)元及空泡巨噬細(xì)胞中也有CRP合 成。在動(dòng)物體內(nèi)，也同樣存在著CRP，如在狗、豬、兔、鱟、河蚌等中均發(fā)現(xiàn)過，狗的CRP是一種 環(huán)狀正五聚蛋白，分子量約為100kD，由5個(gè)亞單位組成，每個(gè)亞單位的分子量為20kD，其 中的2個(gè)亞單位是糖基化的。CRP無論在人或動(dòng)物體內(nèi)均是急性時(shí)相反應(yīng)蛋白中重要的蛋 白之一，是一種敏感的炎癥標(biāo)志物，在急性創(chuàng)傷和感染時(shí)其血濃度急劇升高。正常動(dòng)物血清 CRP含量很低，但在感染、炎性、手術(shù)及腫瘤等情況下，幾個(gè)小時(shí)迅速升高，在狗體內(nèi)24~48 小時(shí)可達(dá)高峰。病變消退后，CRP可迅速下降至正常。在我國，獸用抗生素在獸醫(yī)臨床和動(dòng) 物飼養(yǎng)方面應(yīng)用廣泛、不可或缺，為了達(dá)到既能促進(jìn)生長又能防病治病的目的，大量的種類 繁多的抗生素被應(yīng)用與畜禽生產(chǎn)的許多環(huán)節(jié)。而CRP-般在病毒感染時(shí)不增高或增高不明 顯，在細(xì)菌感染后會(huì)迅速增高，所以可作為動(dòng)物細(xì)菌和病毒感染的一個(gè)首選指標(biāo)，防止抗生 素濫用和減少食品帶來的健康問題。
[0003] 1977年Sternberg創(chuàng)建了速率散射比濁法，是以測(cè)定的溶液對(duì)光的散射程度來判 斷樣品中抗原的含量。一定波長的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復(fù)合物可導(dǎo)致光散 射，散射強(qiáng)度與抗原抗體免疫復(fù)合物的含量成正比。但免疫比濁法由于檢測(cè)靈敏度達(dá)不到 臨床的要求，于是出現(xiàn)了膠乳增強(qiáng)免疫比濁法。其基本原理是首先將抗體吸附在一種膠乳 顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)的抗原時(shí)，抗原抗體結(jié)合而出現(xiàn)膠乳凝集。單個(gè)膠乳顆粒的大小在入射 光波長之內(nèi)，光線可透過。當(dāng)兩個(gè)以上膠乳顆粒凝集可阻礙光線透過，使透射光減少，其減 少程度與膠乳凝集的程度成正比，亦與抗原成反比。但目前市面上暫未出現(xiàn)用于膠乳增強(qiáng) 免疫比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)問題，提出了一種基于酰胺基團(tuán)納米膠乳增強(qiáng)比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。具體，本發(fā)明的技術(shù)方案為： 一種基于酰胺基團(tuán)納米膠乳增強(qiáng)比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)試劑盒，包括Rl試劑 和R2試劑； 所述Rl試劑的組分包括：10~50mmol/L的第一緩沖液、0. 2%~2. 5%w/v的促凝劑、 0?l~2%w/v表面活性劑、0? 01%~0.l%w/v的第一防腐劑； 所述的R2試劑的組分包括：0. 5%~2%w/v標(biāo)記C-反應(yīng)蛋白抗體交聯(lián)酰胺基團(tuán)納米膠 乳、0. 2~2%w/v的穩(wěn)定劑、10~50mmol/L的第二緩沖液、0. 01~0.l%w/v的第二防腐劑。
[0005] -種基于酰胺基團(tuán)納米膠乳增強(qiáng)比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)方法，包括以下 步驟： 51、 將校準(zhǔn)品放置于本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒中，測(cè)量分析后得到濃度-吸光度差值 校準(zhǔn)曲線； 52、 取出校準(zhǔn)品，放入待測(cè)品，根據(jù)步驟Sl得到的濃度-吸光度差值校準(zhǔn)曲線計(jì)算得到 所述待測(cè)品中的C-反應(yīng)蛋白的濃度。
[0006] 本發(fā)明提供的基于酰胺基團(tuán)納米膠乳增強(qiáng)比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)試劑 盒，首先填補(bǔ)了目前市面上用于膠乳增強(qiáng)免疫比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)試劑的空白， 彌補(bǔ)現(xiàn)在國內(nèi)獸醫(yī)臨床檢測(cè)的不足。其次，采用本發(fā)明提供的基于酰胺基團(tuán)納米膠乳增強(qiáng) 比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，結(jié)合均相免疫的透射比濁或散射比濁 法進(jìn)行試驗(yàn)，具有操作簡單、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0007] 圖1是實(shí)施例1中的濃度-吸光度差值校準(zhǔn)曲線。
[0008] 圖2是實(shí)施例2中的濃度-吸光度差值校準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 本發(fā)明提供了一種基于酰胺基團(tuán)納米膠乳增強(qiáng)比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)試 劑盒，包括Rl試劑和R2試劑； 所述Rl試劑的組分包括：10~50mmol/L的第一緩沖液、0. 2%~2. 5%w/v的促凝劑、 0?l~2%w/v表面活性劑、0? 01%~0.l%w/v的第一防腐劑； 所述的R2試劑的組分包括：0. 5%~2%w/v標(biāo)記C-反應(yīng)蛋白抗體交聯(lián)酰胺基團(tuán)納米膠 乳、0. 2~2%w/v的穩(wěn)定劑、10~50mmol/L的第二緩沖液、0. 01~0.l%w/v的第二防腐劑。
[0010] 如前所述，本發(fā)明提供的基于酰胺基團(tuán)納米膠乳增強(qiáng)比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的 檢測(cè)試劑盒，首先填補(bǔ)了目前市面上用于膠乳增強(qiáng)免疫比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)試 劑的空白，彌補(bǔ)現(xiàn)在國內(nèi)獸醫(yī)臨床檢測(cè)的不足。其次，采用本發(fā)明提供的基于酰胺基團(tuán)納米 膠乳增強(qiáng)比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，結(jié)合均相免疫的透射比濁或 散射比濁法進(jìn)行試驗(yàn)，具有操作簡單、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0011] 本發(fā)明中，所述R2試劑中的標(biāo)記C-反應(yīng)蛋白抗體交聯(lián)酰胺基團(tuán)納米膠乳可以通 過如下方法制備得到，具體地，包括如下步驟：將含有酰胺基團(tuán)的膠乳加入活化緩沖液中， 再加入活化交聯(lián)劑進(jìn)行活化，然后加入C-反應(yīng)蛋白多克隆抗體進(jìn)行交聯(lián)，最后加入膠乳封 閉液，封閉殘留活化位點(diǎn)。
[0012] 其中，所述活化緩沖液為l~10mmol/L、pH=4~6的2-嗎啉乙磺酸緩沖液。所述，所 述活化交聯(lián)劑中含有1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽和N羥基琥珀酰胺，且 所述活化交聯(lián)劑中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為0. 01~0.l%w/ v，所述N羥基琥珀酰胺的濃度為0. 01~0.l%w/v。所述膠乳封閉液中含有0. 2~2%w/v的第 二穩(wěn)定劑、l〇~50mmol/L的第三緩沖液、0. 01~0.l%w/v的第三防腐劑，但不局限于此。
[0013] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，按照上述步驟制備所述標(biāo)記C-反應(yīng)蛋白抗體 交聯(lián)酰胺基團(tuán)納米膠乳時(shí)，所述的活化時(shí)間為1~2小時(shí)；所述的交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為2~4小時(shí)， 但不局限于此。
[0014] 需要說明地是，在加入活化交聯(lián)劑進(jìn)行活化完成后，在加入C-反應(yīng)蛋白多克隆抗 體進(jìn)行交聯(lián)的步驟之前，優(yōu)選地，還需先通過離心分離的步驟去掉體系中殘留的活化交聯(lián) 劑。
[0015] 另外，所述活化和交聯(lián)的步驟均優(yōu)選在37°C下進(jìn)行。
[0016] 本發(fā)明中，各原料中所采用的緩沖液可采用本領(lǐng)域常見的各種緩沖液，其可以相 同，也可以不同。具體地，所述第一緩沖液、第二緩沖液和第三緩沖液各自獨(dú)立地選自磷酸 鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液和HEPES緩沖液中 的一種；且所述第一緩沖液、第二緩沖液和第三緩沖液的pH值各自獨(dú)立地為6. 5~8. 0。 [0017] 所述Rl試劑中，所述促凝劑為不同聚合度的聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮中的一 種或兩種。所述表面活性劑為陽離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑或非離子型表面 活性劑中的一種或多種。所述表面活性劑的親水親油平衡值(簡稱為HLB值）大于8. 0。
[0018] 本發(fā)明中，各原料體系中所采用的防腐劑可以相同，也可以不同。具體地，所述第 一防腐劑、第二防腐劑和第三防腐劑各自獨(dú)立地為疊氮鈉、硫柳汞、Proclin-300中的一種 或多種。
[0019] 本發(fā)明中，各原料體系中所采用的穩(wěn)定劑可以相同，也可以不同。具體地，所述第 一穩(wěn)定劑、第二穩(wěn)定劑各自獨(dú)立為蛋白質(zhì)、糖或無機(jī)鹽中的一種或多種。所述穩(wěn)定劑中，所 述蛋白質(zhì)為BSA、NBS、Tripton、Casein或明膠中的一種或多種。所述穩(wěn)定劑中，所述糖為 鹿糖、海藻糖或甘露糖中的一種或多種。所述穩(wěn)定劑中，所述無機(jī)鹽為氯化鈉、氯化鉀的一 種或兩種。
[0020] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述R2試劑中的C-反應(yīng)蛋白抗體交聯(lián)酰胺基 團(tuán)納米膠乳的顆粒直徑在40~300nm之間。
[0021] 作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述C-反應(yīng)蛋白抗體交聯(lián)酰胺基團(tuán)納米膠 乳中所述納米膠乳通過表面的酰胺基與C-反應(yīng)蛋白抗體的氨基或羧基共價(jià)結(jié)合。在此種 優(yōu)選情況下，酰胺基團(tuán)納米膠乳與抗體的結(jié)合是通過其表面的酰胺基與抗體的氨基或羧基 共價(jià)結(jié)合，在微球與抗體之間有一個(gè)橋聯(lián)化學(xué)臂，降低了位阻效應(yīng)，不但提高了抗體的結(jié)合 率，還為抗體提供合適的三維空間立體結(jié)構(gòu)，有效地保護(hù)了抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域，提 高反應(yīng)的靈敏度。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種基于酰胺基團(tuán)納米膠乳增強(qiáng)比濁法動(dòng)物C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè) 方法，包括以下步驟： 51、 將校準(zhǔn)品放置于本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒中，測(cè)量分析后得到濃度-吸光度差值 校準(zhǔn)曲線； 52、 取出校準(zhǔn)品，放入待測(cè)品，根據(jù)步驟Sl得到的濃度-吸光度差值校準(zhǔn)曲線計(jì)算得到 所述待測(cè)品中的C-反應(yīng)蛋白的濃度。
[0023] 采用本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行配制校準(zhǔn)品，然后根據(jù) 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，得到濃度-吸光度差值校準(zhǔn)曲線。然后，再取出校準(zhǔn)品，而放入待 測(cè)品，即可根據(jù)測(cè)量結(jié)果和前述濃度-吸光度差值校準(zhǔn)曲線，從而得到所述待測(cè)品中的-反 應(yīng)蛋白的濃度。
[0024] 其中校準(zhǔn)品的配制方法沒有特殊要求，對(duì)于校準(zhǔn)品的具體數(shù)量和濃度設(shè)置可采用 本領(lǐng)域常規(guī)設(shè)計(jì)。
[0025] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，具體地，本發(fā)明中，所述校準(zhǔn)品包括若干支不同 濃度的C-反應(yīng)蛋白基質(zhì)，所述C-反應(yīng)蛋白基質(zhì)中優(yōu)選含有天然C-反應(yīng)蛋白和稀釋液。所 述稀釋液中含有l(wèi)Ommol/L的第四緩沖液、疊氮鈉0. 01~0.l%w/v、牛血清白蛋白0. 5~3%w/v。 其中，所述第四緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
[0026] 更進(jìn)一步地，所述校準(zhǔn)品可包括6支不同濃度的C-反應(yīng)蛋白基質(zhì)。6支不同濃度 的C-反應(yīng)蛋白基質(zhì)中的天然C-反應(yīng)蛋白的濃度可以自行設(shè)定。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí) 施方式，所述6支C-反應(yīng)蛋白基質(zhì)中的天然C-反應(yīng)蛋白的濃度可以依次為Omg/L、20mg/L、 40mg/L、80mg/L、120mg/L、200mg/L。作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述6支C-反應(yīng) 蛋白基質(zhì)中的天然C-反應(yīng)蛋白的濃度可以依次為Omg/L、30mg/L、60mg/L、90mg/L、150mg/ L、200mg/L，但不局限于此。
[0027] 本發(fā)明中，步驟SI中測(cè)量分析后得到濃度-吸光度差值校準(zhǔn)曲線中的吸光度采用 透射比濁或散射比濁蛋白分析儀測(cè)量得到。
[0028] 本發(fā)明中，所述待測(cè)品可以為各種動(dòng)物血清或血漿，包括但不局限于各種豬、狗的 血清或血漿。
[0029] 為了使本發(fā)明所解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 實(shí)施例，對(duì)本