專利名稱：在減少副作用的條件下用干擾素治療疾病的方法和制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用交感人類的白細(xì)胞干擾素治療疾病的方法，本發(fā)明還涉及適于治療疾病的交感人類白細(xì)胞干擾素的藥物制劑。
干擾素是具有抗病毒和抗增殖兩種活性的胞質(zhì)分裂體(cytokines)的一個(gè)亞綱。按生物化學(xué)和免疫特性區(qū)分，人類干擾素分為三類干擾素-α(白細(xì)胞)、干擾素-β(成纖維細(xì)胞)和干擾素-γ(免疫細(xì)胞)。通過對(duì)表征這些多肽的DNA進(jìn)行分離和排序，現(xiàn)已至少鑒定出14種具有特定的氨基酸順序的α干擾素(分類為亞型A-H)。由于α干擾素具有抗病毒和抗腫瘤生長(zhǎng)抑制作用，它已受到人們廣泛的注意，人們已考慮把它作為可能的治療藥劑。
美國(guó)專利4503035中描述了對(duì)從全血的血沉棕黃層部分中分離出的人類白細(xì)胞干擾素進(jìn)行純化的方法，按這個(gè)方法制備的人類白細(xì)胞干擾素含有不同的人類白細(xì)胞干擾素氨基酸順序的混合物。當(dāng)在MDBK牛細(xì)胞系上試驗(yàn)時(shí)，該純化材料的特異活性為0.9x108-4x108單位/mg蛋白質(zhì)，而當(dāng)在Ag1732人類細(xì)胞系上試驗(yàn)時(shí)，特異活性為2x106-7.6x108單位/mg蛋白質(zhì)。美國(guó)專利4241174中公開了用親細(xì)胞效應(yīng)抑制檢驗(yàn)法來測(cè)定干擾素抗病毒活性的方法。用國(guó)家衛(wèi)生研究所(the National Institutes of Health)提供的人類白細(xì)胞干擾素作為參考標(biāo)準(zhǔn)來校正所測(cè)得的干擾素活性。
美國(guó)專利4530901中公開了重組DNA質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)(所述的質(zhì)粒含有代表至少部分人類白細(xì)胞干擾素的順序)以及在具有人類白細(xì)胞干擾素免疫或生物活性的一多肽在E.coli中的表達(dá)。
美國(guó)專利4414150，4456748和4678751中公開了包含不同亞型順序(如A和D、A和B以及A和F)結(jié)合的雜種α干擾素基因的結(jié)構(gòu)。
美國(guó)專利4695623和4897471公開了多種具有氨基酸順序的新的人類白細(xì)胞干擾素多肽，它們具有包括在自然界出現(xiàn)α干擾素亞型多肽中每個(gè)位置找到的一般的或占優(yōu)勢(shì)的氨基酸順序，并被稱作交感人類白細(xì)胞干擾素(IFN-Con)。所公開的IFN-Con氨基酸順序指定為IFN-Con1，IFN-Con2，cIFN-Con3。所述的專利中還公開了對(duì)基因進(jìn)行編碼的IFN-Con的制備方法和所述基因在E.coli的表達(dá)。
Klein等人在J.Chromatog.454，205-215(1988)中描述了在E.coli中制造IFN-con1的純化方法，據(jù)報(bào)道，用這種方式純化的IFN-con1在用T98G人類細(xì)胞系檢驗(yàn)親細(xì)胞效應(yīng)抑制檢驗(yàn)法中測(cè)量時(shí)，具有3x109單位/mg蛋白質(zhì)特異活性(Fish et al. J. Interferon Res. 9 97-114(1989))。用等電聚集法測(cè)定時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，純化的IFN-con1包括三個(gè)異構(gòu)型，分別為甲硫氨酰IFN-con1，脫甲硫氨酰IFN-con1以及N末端被乙酰基阻斷了的脫甲硫氨酰IFN-con1(Klein等人，Arch.Biochem.Biophys.276 531-537(1990))。
美國(guó)和一些其他國(guó)家已批準(zhǔn)α-干擾素用于治療多毛細(xì)胞白血病、性病濕疣，卡波濟(jì)氏肉瘤(Kaposi'sSarcoma，一種AIDS病人容易感染的癌癥)，以及慢性非-甲非乙肝炎。α干擾素的兩種變體已被批準(zhǔn)用于治療用途干擾素-α-2a，商標(biāo)為Roferon-A以及干擾素α-2b，商標(biāo)為INTRON-A。Roferon-A和INTRON-A的氨基酸順序除在一個(gè)位置不同外，在其它位置與α干擾素亞型2(亞型A)的氨基酸順序完全相同。
除了標(biāo)明的指示外，α干擾素在多種其他細(xì)胞增生失調(diào)癥中可以單獨(dú)使用或被評(píng)價(jià)，或與化學(xué)治療劑配合使用，所述的細(xì)胞增生失調(diào)癥包括慢性骨髓血白病、多樣骨髓病、表面膀胱癌，皮膚癌(基細(xì)胞癌和惡性黑素瘤)、腎細(xì)胞癌、卵巢癌、低級(jí)淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤。α干擾素與其他化學(xué)治療劑結(jié)合可以有效地治療由肺癌、結(jié)腸直腸癌和乳房癌引起的硬腫瘤(見Rosenberg等人的“PrincipleandApplicationsofBiologicTherapy”incancerPrincipleandPracticesofOncology，3rded.，Devita等人，eds.pp.301-547(1989)，BalmerDICP，AnnPharmacother24，761-768(1990))。
現(xiàn)已知道，α干擾素影響多種細(xì)胞功能，包括在正常和異常細(xì)胞中的DNA復(fù)制、RNA和蛋白質(zhì)合成。這樣，干擾素不但對(duì)腫瘤或病毒感染的細(xì)胞有細(xì)胞毒性，而且這種細(xì)胞毒性在正常的健康細(xì)胞中也有所表現(xiàn)。結(jié)果，在干擾素治療中，特別在需要高劑量時(shí)會(huì)出現(xiàn)不良的副作用。施用干擾素可能導(dǎo)致骨髓抑制，從而減少紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的水平。高劑量干擾素通常會(huì)引起類似流行性感冒的癥狀(如發(fā)燒、疲勞、頭痛和發(fā)冷)，胃腸道混亂(如缺乏食欲、惡心和腹瀉)，目眩和咳嗽。在不減少干擾素治療優(yōu)點(diǎn)的情況下，減少或消除這種治療的不良的副作用將是有用的。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對(duì)干擾素治療敏感疾病的治療方法，其中與現(xiàn)行的實(shí)際治療方法相比，通常由α-干擾素治療法引起的不良的副作用被顯著降低或完全抑制掉。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，與現(xiàn)行的實(shí)際治療方法相比，提高用干擾素治療疾病的治療效果并不會(huì)相應(yīng)地增加不良的副作用的頻率或嚴(yán)重程度。
本發(fā)明包括對(duì)一種干擾素療法敏感的疾病的治療方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物(最好是人)施用具有療效量的交感人類白細(xì)胞干擾素(IFN-con)。本發(fā)明是基于這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即IFN-con在病人中引起的副作用不象α干擾素那樣大。本發(fā)明可以治療的疾病一般都對(duì)α干擾素治療法敏感。換句話說，IFN-con有助于治療那些用α干擾素(如IntronA)治療的同樣疾病，這些疾病例如可以包括(但不限于)細(xì)胞增生失調(diào)和病毒感染。IFN-con有助于治療與癌癥經(jīng)常有關(guān)的細(xì)胞增生失調(diào)癥。這種失調(diào)包括(但不限于)多毛細(xì)胞白血病和卡波濟(jì)氏肉瘤。IFN-con可以單獨(dú)使用，或與其他用于治療癌癥和其他增生失調(diào)治療手段結(jié)合使用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，IFN-con與具有療效量的一個(gè)或多個(gè)刺激骨髓細(xì)胞增殖或分化的因子(例如粒性白細(xì)胞群體刺激因子(G-CSF)粒性白細(xì)/巨噬細(xì)胞群體刺激因子(GM-CSF)、內(nèi)白細(xì)胞殺菌素-1(IL-1)、內(nèi)白細(xì)胞殺菌素-3(IL-3)、內(nèi)白細(xì)胞殺菌素-6(IL-6)、紅血球生成素、以及干細(xì)胞因子(SCF)組合使用。G-CSF是與IFN-con共同使用的優(yōu)選因子。
用IFN-con可治療的病毒疾病包括(但不限于)甲型肝炎、丙型肝炎、其他非甲非乙肝炎、乙型肝炎、皰疹病毒(EB、CML、單純性皰疹)、乳頭狀瘤、痘病病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、鼻病毒，HTLVⅠ、HTLVⅡ、以及人體旋轉(zhuǎn)病毒(rotavirus)。
雖然早已了解上述疾病可以用α干擾素治療，但伴隨這種治療的副作用嚴(yán)重限制了這種治療的總的有效作用。在某些情況中，例如Epstein-Barr感染(非洲淋巴細(xì)胞瘤感染)，伴隨α干擾素治療的副作用實(shí)際上排除了用α干擾素治療的可能性。因此，就本發(fā)明而言，用IFN-con可治療的疾病包括這樣一些疾病，在這些疾病中，α干擾素治療表現(xiàn)一些效果，但它不能用已知的干擾素治療，因?yàn)樨?fù)的副作用勝過該治療的效果?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)(并且在此公開)，與α干擾素治療法相比，用選自交感人類細(xì)胞干擾素(IFN-con)的非天然存在的干擾素治療可以大大降低或完全消除副作用。不論所治療的是何種疾病，都希望降低或消除副作用。
已有技術(shù)的報(bào)道結(jié)果不可能來預(yù)言減少或消除對(duì)于IFN-con所發(fā)現(xiàn)的副作用。實(shí)際的臨床結(jié)果清楚地證明，不但與α干擾素同樣劑量水平的IFN-con可以降低或消除副作用，而且施用3-5倍的IFN-con也不引起極限劑量的副作用。
此外，下面將表明，IFN-con的活性類似于或高于上面描述中所指出的INTRONA的活性。特別是IFN-con的抗增生活性比INTRONA高。因此，與其他目前使用的干擾素療法相比，用IFN-con治療細(xì)胞增殖混亂的效果和安全性更高，與目前實(shí)際方法相比，施用具有療效量的IFN-con治療細(xì)胞增殖混亂癥的效果更快、更徹底，而且不會(huì)相應(yīng)地增加不良的副作用的出現(xiàn)頻率或嚴(yán)重程度。此外，IFN-con的療效量可能比目前實(shí)際使用方法中所用的干擾素的量更低。結(jié)果，在某些情形中，較少劑量的IFN-con可以得到與較高劑量的其他干擾素相同的療效，而且降低或消除了目前使用的與干擾素療法有關(guān)的不良副作用。
IFN-con是一種具有抗增殖活性的非天然存在的多肽。優(yōu)選的情形是，IFN-con是一具有IFN-Con1、IFN-con2或IFN-con3氨基酸順序的多肽，IFN-con的氨基酸順序最好為IFN-con1。
本發(fā)明還涉及一種藥物制劑，該制劑包含具有療效量的IFN-con，以及適當(dāng)?shù)南♂寗?、佐劑、載體、防腐劑和/或增溶劑。


圖1-7示出了IFN-con1和對(duì)照材料INTRONA當(dāng)分別按0.1、0.5、1，5、10、50以及100ngs/ml加干擾素到ESKo1細(xì)胞懸浮液中時(shí)對(duì)Esko1(一種多毛細(xì)胞白血病細(xì)胞系的抗增殖活性。
圖8示出了用INTRON-A、IFN-con或IFN-CON1和r-metGCSF治療卡波濟(jì)氏肉瘤病人所得到的第一中值或當(dāng)前中值。
在此處，交感人類白細(xì)胞干擾素(IFN-con)指一種非天然存在的多肽，它包括絕大多數(shù)與所有天然存在的人類白細(xì)胞干擾素亞型順序相同的氨基酸殘基，并且包括在一個(gè)或多個(gè)不與所有亞型相同的氨基酸的位置上包括一種主要屬于該位置的氨基酸，并且絕不會(huì)包括在至少一種天然存在亞型中不在該位置殘存的任何氨基酸殘基。IFN-con包括(但不限于)公開在共同擁有的美國(guó)專利4695623和4897471的命名為IFN-con1、IFN-con2以及IFN-con3的氨基酸順序，在此引入這些公開內(nèi)容經(jīng)供參考?？梢杂蒙鲜龅膶＠蚱渌鼧?biāo)準(zhǔn)方法來合成標(biāo)記DNA順序的IFN-con。
IFN-con多肽最好是轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)菌宿主(特別是E.Coli.)中的所制造的DNA順序的表達(dá)產(chǎn)物。也就是說，IFN-con是重組IFN-con在E.Coli.中制備的IFN-con最好是用在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法純化的，而對(duì)于IFN-con1，通常按Kleinetal，Supra(1988)所述的用于IFN-con1的方法來純化。純化的IFN-con可以包括多種異構(gòu)體的一種混合物，比如純化的IFN-con1由甲硫氨?；鵌FN-con1、脫甲硫氨?；鵌FN-con1以及帶有一個(gè)阻斷的末端的脫甲氨?；幕旌衔锝M成(Klein等人，Supra(1990))。另一方面，IFN-con可包括一特異的離析的異構(gòu)體。可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的等電聚集這樣的技術(shù)來使IFN-con異構(gòu)體彼此分離。
本主題發(fā)明提供一種治療一種可用用α-干擾素治療的疾病的方法，該方法同時(shí)可減少或消除了通常與α干擾素治療法有關(guān)的一種或多種副作用，它包括給病人施用具有療效量的IFN-con。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例是一種治療方法，包括施用具有療效量的IFN-con1、IFN-con2或IFN-con3，最好施用具有療效劑量的IFN-con1。
短語(yǔ)“減少或消除與施用干擾素有關(guān)的一種個(gè)或多種副作用”相信對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是清楚的，并且是可以理解的。通常可以用測(cè)量干擾素療法所帶來的副作用的數(shù)目和嚴(yán)重程度的各種方法中的任何一種來確定，一種干擾素與另一種個(gè)干擾素的副作用圖是否不同。用于與交感干擾素比較的一種合適的干擾素是Schering-Plough出售的IntronA(干擾素α-2b)。
定級(jí)副作用嚴(yán)重程度的一般方法是采用標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)度(如世界衛(wèi)生組織(WHO)承認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)度)。這個(gè)臨床醫(yī)師現(xiàn)在廣泛使用的標(biāo)度所使用的副作用等級(jí)水平如下一級(jí)，溫和的;二級(jí)，中等的;三級(jí)，嚴(yán)重的;四級(jí)，生命危險(xiǎn)的。雖然在這個(gè)分級(jí)法中有一些主觀性因素，如果同一臨床醫(yī)師把病人分組，用這種標(biāo)度比較在兩種藥之間副作用的結(jié)果可能還是有效的，并且可為醫(yī)生。為進(jìn)行比較，醫(yī)生常常想知道施用給定劑量水平的一種給定的藥是否會(huì)帶來極限劑量毒性(DLT)。當(dāng)病人認(rèn)為副作用無法忍受時(shí)，便認(rèn)為達(dá)到了極限劑量毒性(DLT)。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，醫(yī)生可以減少劑量(對(duì)施用IntronA或交感干擾素的情況一般每次減少3百萬(wàn)單位)或停病人一個(gè)時(shí)期的藥，以后繼續(xù)服同樣劑量或較低劑量的藥。在任何情況下，當(dāng)出現(xiàn)DLT時(shí)，可以認(rèn)為所達(dá)到的結(jié)果是低于最佳效力的次佳治療結(jié)果。這樣，表示副作用減少的其他途徑是在一給定劑量水平DLT的減少次數(shù)。在例3中，對(duì)IntronA和交感干擾素的DLT進(jìn)行了比較，雖然可使用副作用圖的其他測(cè)量法，結(jié)果是相同與其他干擾素(特別是α干擾素，例如IntronA和Roferon(HoffmannLaRoche))相比，交感干擾素帶來的DLT較低，并且一般來說，在所有用于治療疾病的劑量水平上，病人感覺都較好。
適于用IFN-con治療的疾病包括各種細(xì)胞增殖失調(diào)，特別是各種癌癥。這種失調(diào)包括(但不限于)多毛細(xì)胞白血病、卡波濟(jì)氏肉瘤、慢性骨髓白血病、多骨髓瘤、表面膀胱癌、皮膚癌(基細(xì)胞癌和惡性黑素瘤)、腎細(xì)胞癌、卵巢癌、低級(jí)淋巴細(xì)胞和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
其他適于用IFN-con治療的疾病包括各種病毒疾病，這些疾病包括(但不限于)甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、非甲非乙肝炎(而不是乙型肝炎或丙型肝炎)、Epstein-Bar病毒感染、HIV感染、皰疹病毒(EB、CML、單純性皰疹)、乳頭狀瘤、痘病病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、腺病毒、鼻病毒、HTLVⅠ、HILVⅡ，以及人類旋轉(zhuǎn)病毒(humanrotavirus)。
可以單獨(dú)用IFN-con或與其他治療藥物共同使用以治療此處所述的多種疾病。例如，IFN-con可以與具有療效量的一種或多種化學(xué)治療劑結(jié)合施用。這些治療劑如白血福恩、5-氟尿嘧啶(5-FU)、zidovuline(AZT)、甲酰四氫葉酸、米爾法蘭，支氫可的松環(huán)磷酰胺、decarbazine、順鉑(cisplatin)，以及潘生丁。IFN-con也可以與細(xì)胞激動(dòng)素(例如內(nèi)白細(xì)胞殺菌素-2(IL-2))結(jié)合施用。
可以把具有療效量的IFN-con與具有療效量的一種或多種因子結(jié)合施用，所述的這類因子在干擾素治療期間能刺激骨髓分化，以克服所觀察到的骨髓抑制效應(yīng)。這些試劑包括(但不限于)G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-3、IL-6、紅血球生成素，以及SCF。干細(xì)胞因子(SCF)刺激早期造血祖代細(xì)胞的增殖，并在申請(qǐng)?zhí)枮?73616的美國(guó)專利申請(qǐng)中已有描述，在此引入其公開內(nèi)容以供參考。一種優(yōu)選的試劑是G-CSF。
下面給出的例1-3中表明，IFN-con1是對(duì)多毛細(xì)胞白血病和與AIDS有關(guān)的卡波濟(jì)氏肉瘤的一種有效的抗增殖試劑。
例1中示出了IFN-con1和INTRON A對(duì)Eskol細(xì)胞(一多毛細(xì)胞白血病細(xì)胞系)的抗增殖活性。它表明在一寬的濃度范圍內(nèi)，IFN-con1具有比INTRON A較大的抗增殖活性。在IFN-con1與Rofefon A比較時(shí)也能得到類似結(jié)果。這些結(jié)果表明，當(dāng)施用濃度與INTRON A相同時(shí)，IFN-con1的療效較高。換句話說，較低濃度的IFN-con1多獲得與Intron A相同的療效。
例2描述了IFN-con1和INTRON-A治療與AIDS中的一個(gè)比較研究。它表明，接受IFN-con1的病人達(dá)到了比接收INTRON-A病人較高單位的劑量。此外，接受兩者和IFN-con1以及G-CSF的病人比僅接受IFN-con1那些病人達(dá)到了較高劑量的IFN-con1(見圖8)。在這項(xiàng)研究中，所有病人都接受AZT，作為他們治療HIV感染手段的一部分。單獨(dú)施用AZT對(duì)卡波濟(jì)氏肉瘤是無效的。
當(dāng)施用IFN-con1時(shí)，用根據(jù)3級(jí)毒性的頻率的降低可以斷定，IFN-con1比INTRON-A更安全。與INTRON-A治療法相比，用IFN-con1治療時(shí)發(fā)生中性白細(xì)胞減少癥和肝功能障礙的機(jī)會(huì)有所降低，而用IFN-con1和r-met GCSF治療完全消除了3級(jí)毒性(見表2)。
例3給出了從包括肝炎感染的病人的臨床試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)。
本發(fā)明還提供了由具有療效量的IFN-con與可作為藥物的載體、佐劑、稀釋劑、防腐劑和/或增溶劑一起組成的藥物制劑。IFN-con的藥物制劑包括各種緩沖劑具有一定的PH和離子強(qiáng)度范圍的稀釋劑(如Tris-Hce、乙酸鹽、磷酸鹽)的稀釋劑、載體(如人類血清清蛋白)、增溶劑(如吐溫、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯)以及防腐劑(如硫汞撒、芐醇)。通常，藥物制劑的組分可以從與干擾素以及其他抗增殖或抗病毒劑一起使用的物質(zhì)中選擇，而這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的。所提供的IFN-con的藥物制劑以一種可注射的溶液或一種注射前在適當(dāng)?shù)南♂寗┲性偕睦鋬龈稍锓邸?br> 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)所制備的IFN-con的半壽命、施用的過程以及待試驗(yàn)的是何種疾病來確定IFN-con的療效量。通常，對(duì)治療細(xì)胞增殖失調(diào)，IFN-con的療效量為每個(gè)病人每星期施用幾次，每次的劑量在2×106-60×106單位之間。用該范圍內(nèi)較低部分的劑量可有效地在治療多毛細(xì)胞白血病，而用該范圍內(nèi)較高部分的的劑量可有效地治療卡波濟(jì)氏肉瘤。在至少六個(gè)月的療程內(nèi)，用具有療效量的IFN-con，對(duì)不同類型的腫瘤，可使腫瘤重量減輕20%-80%。通常，對(duì)治療一病毒疾病，每周每個(gè)病人類施用幾次(例如2-7，最好3次)所用的IFN-con的療效量在3×106-30×106單位之間，最好在6×106-15×106單位之間。
給藥方式最好是把區(qū)物注射到哺乳動(dòng)物的血液中，注射可以是靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、皮下或病灶內(nèi)注射。也可以通過口服或鼻途徑來施用藥物。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，對(duì)給定的藥物制劑，顯然應(yīng)采用給定的施用方式。
所提供的下列例子更充分地說明了本發(fā)明，但這些例子并未限制本發(fā)明的范圍。
例1IFN-con1和Intron A的抗增殖活性試驗(yàn)IFN-con1和Intron A對(duì)Eskol細(xì)胞系(由Dr. E. School在the Indiana University Medical Sch ool分離的多毛細(xì)胞白血病細(xì)胞系)的抗增殖活性。在37℃下，在含5%CO2的10%的胎兒腓腸血清的RPMI介質(zhì)(Gibco)中培養(yǎng)3毫升ESKOL細(xì)胞的培養(yǎng)物。將IFN-con1或INTRO A(干擾素α-2b;Schering Corp.)加入到10微升在最終蛋白質(zhì)濃度為0.1-100ngs/ml的介質(zhì)中去。用Bradford蛋白質(zhì)試驗(yàn)法(Bradford，Anal.Biochem. 72，248-254(1976))來測(cè)定IFN-con1的蛋白質(zhì)濃度，Intron A的濃度是由制造者提供的特異活性(2×108國(guó)際單位/mg蛋白質(zhì))和單位濃度而計(jì)算出的。在每隔24小時(shí)用臺(tái)盼藍(lán)(Sigma)排斥法測(cè)定存活細(xì)胞的數(shù)目。每隔24小時(shí)加入100微升IFN-con1或Intron A直至所標(biāo)明的最終濃度。存活細(xì)胞計(jì)數(shù)值是四次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值，每次獨(dú)立試驗(yàn)都復(fù)制樣品。細(xì)胞計(jì)數(shù)值從在24-48小時(shí)的大約5%到較長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的大約2%之間變化。圖1-7中示出的結(jié)果是在不同時(shí)間時(shí)存在或不存在干擾素時(shí)存活細(xì)胞計(jì)數(shù)值的百分比。
通過把3H-胸苷結(jié)合到在IFN-con1或INTRON-A存在的條件下Eskol培養(yǎng)的細(xì)胞中的情況來證實(shí)存活細(xì)胞計(jì)數(shù)值。在120小時(shí)培養(yǎng)期以后，提取200微升細(xì)胞懸浮液在有5μCi/ml3H-胸苷(Amersham)的條件下在37℃下培養(yǎng)3小時(shí)。用-Cambridge細(xì)胞收集器(Cambridge Technology)收集這些細(xì)胞，以蒸餾水洗7次，再用95%的乙醇洗2次，用液體閃爍計(jì)數(shù)法來測(cè)定結(jié)合的3H-胸苷的量。所觀察到的在存在IFN-con1或INTRON-A的條件下培養(yǎng)120小時(shí)的Escol細(xì)胞攝入3H-胸苷的攝入量正比于細(xì)胞存活數(shù)。
例2帶卡波濟(jì)氏肉瘤(KS)的病人施用IFN-con1的安全性、耐藥性和效率。
著手做一個(gè)隨機(jī)取樣的公開的放射性同位素示蹤研究，來評(píng)價(jià)IFN-con1和Intron A的安全性和耐藥性，并確定IFN-con1和Intron A的最大耐藥劑量(MTD)。對(duì)感染AIDS的KS病人施用IFN-con1和Intron A以及Zidovudine(AZT)一起。此外，當(dāng)與AZT和用E. Coli產(chǎn)生的在多肽(r-met G-CSF)的氨基酸末端具有一蛋氨酸殘基的重組粒性白細(xì)胞群體刺激因子一起施用時(shí)，測(cè)定IFN-con1的安全性、耐藥性以及最大耐藥劑量(MTD)。在這項(xiàng)研究中的三個(gè)治療組為
(1)IntronA+AZT(2)IFN-con1+AZT(3)IFN-con1，AZT+r-met G-CSF每個(gè)治療組至少包括12個(gè)可供研究的病人。
A.產(chǎn)品說明用在美國(guó)專利4695623和4897471中描述的方法在E.Coli中生產(chǎn)IFN-con1。通常用Klein等人在supra(1988)中描述的步驟來純化IFN-con1，在本研究中，用在磷酸鈉緩沖劑中無菌蛋白溶液的con1來皮下施用IFN-con1，如果需要的話，把制劑稀釋在無菌鹽水中。
Zidovudine(AZT)可從Burroughs-WellcomeCo.購(gòu)買，并按包裝說明書上的說明使用。
IntronA可以是從ScheringCorp購(gòu)買的無菌冷凍干燥劑型產(chǎn)品，該試劑可按包裝說明書上的說明重新懸浮在稀釋劑中。
r-met G-CSF是用在美國(guó)專利4810643所述的方法在E.Coli中生產(chǎn)的，該專利在此引入以供參考。所制備的r-met G-CSF是一種在10mM醋酸鈉5%甘露醇和0.004%吐溫80中，PH為4.0，濃度為0.3mg/ml的無菌蛋白質(zhì)溶液。如果需要的話，將溶液放入5%的無菌葡萄糖水溶液(D5W)中進(jìn)行稀釋。
B.劑量和程序表AZT，對(duì)所有病人按100mg的固定劑量施用AZT，每四小時(shí)口服一次，同時(shí)，清醒的病人每天共給藥5次，共500mg。
r-metG-CSF對(duì)包括r-metG-CSF的治療組中隨機(jī)選定的病人，按每天每公斤體重1μg/kg的劑量以一次團(tuán)塊注射的方式皮下施用r-met G-CSF。如果需要的話，該劑量可以1μg/kg天(不超過6μg/kg/天)的增量增加或以0.5μg/kg/天或更小的減量減小，選擇適當(dāng)?shù)膭┝?，以使絕對(duì)中性白細(xì)胞計(jì)數(shù)值(ANC)在5000-15000/mm3的目標(biāo)范圍之中。
干擾素根據(jù)劑量逐步提高的方案，使病人或者接受IFN-con1，或者接受Intron A。劑量的選擇應(yīng)基于每一種干擾素的等單位(equal units)。但是，因?yàn)閮煞N干擾素的特異活性不同(按美國(guó)專利4695623所述的抗病毒細(xì)胞病試驗(yàn)法的測(cè)定值，對(duì)Intron A的特異活性為是2×108IU/mg，而對(duì)IFN-con1的特異活性至少為1×109IU/mg)，對(duì)于Intron A和IFN-con1的任何給定劑量，蛋白質(zhì)的重量值(以mg為單位)將是不同的。下面的表1給出了所采用的劑量逐步提高方案。在表1中還給出了對(duì)每種干擾素相應(yīng)于用IU表示的每個(gè)劑量水平的，以蛋白質(zhì)的毫克數(shù)為單位的劑量水平。
表Ⅰ.Intron A和IFN-con1劑量逐步提高程序表劑量水平劑量×106用毫克蛋白質(zhì)表示的劑量INTRON A IFN-con1130.0150.003290.0450.0093120.0600.0124150.0750.0155180.0900.0186210.1050.0217240.1200.024
8270.1350.0279300.1500.030對(duì)上面給出的三個(gè)治療組中每一組中的病人施用IFN-con1或INTRON-A，開始的第一周每天的劑量為1級(jí)，然后逐步提高到下一個(gè)高劑量水平。在第8、15、22、29、36、43、50和57天提高劑量。劑量的逐步提高一直持續(xù)到每個(gè)病人接受了一MTD或每天30×106IU干擾素的最大劑量。對(duì)于單個(gè)病人，MTD指低于出現(xiàn)極限劑量毒性的那個(gè)劑量水平。毒性用世界衛(wèi)生組織嚴(yán)格確定并由Miller等人Cancer 47，210-221(1981)中進(jìn)一步描述的分級(jí)法可以分為0級(jí)(無毒性)到4級(jí)(急性毒性)。極限劑量毒性指確定為至少可能與干擾素有關(guān)的3級(jí)或4級(jí)有害事件。不能用持續(xù)時(shí)間少于24小時(shí)的發(fā)燒和發(fā)冷、疲勞、頭痛、或2級(jí)或更低級(jí)的毒來確定MTD，除非可以確定某個(gè)病人已無法容受該劑量。
在劑量逐步提高至最高時(shí)，對(duì)病人們每日一次繼續(xù)施用MTD或30×106IU最大劑量(如果達(dá)到的話)以進(jìn)行維持治療。維持治療一直持續(xù)疾病發(fā)展或者達(dá)到其他可以將病人從該項(xiàng)研究中除去的標(biāo)準(zhǔn)。
在維持治療期間，由于毒性的原因，允許干擾素的劑量降低兩次。在劑量降低兩次后，不允許進(jìn)一步改變干擾素的劑量，而需要進(jìn)一步降低劑量的病人需從該項(xiàng)研究中撤出。對(duì)這個(gè)步驟的一個(gè)例外是極限劑量毒性造成了中性白細(xì)胞減少癥(在大約一周時(shí)間內(nèi)有兩天ANC≤1000/mm3)。在這種情況下，允許該病人留在該研究中而不進(jìn)一步減少干擾素劑量，但須對(duì)不接受r-met G-CSF病人皮下給藥以進(jìn)行r-met G-CSF治療，開始時(shí)的用藥量為每天每公斤體重1微克。對(duì)已在r-metG-CSF治療組的病人，施用的r-metG-CSF劑量將逐步提高到下一個(gè)較高水平(1微克/kg體重/天)。
C.病人的選擇在這項(xiàng)研究中共登記了49個(gè)病人。在這項(xiàng)研究每個(gè)人必須滿足所有包括的和非排除的判據(jù)才能給予登記。重量的包括判據(jù)有血清診斷證明的HIV感染、病理組織證實(shí)的具有可測(cè)出的皮膚或口腔損害的卡波濟(jì)氏肉瘤、可接受的免疫功能(用CD4淋巴細(xì)胞水平測(cè)量)以及在AZT治療的時(shí)間少于1年。
從這項(xiàng)研究中撤出一個(gè)病人的理由為在劑量逐步提高過程中第二次出現(xiàn)3級(jí)或更高級(jí)的毒性、在已確定病人出現(xiàn)MTD后第三次出現(xiàn)極限劑量毒性，并且病人在接受維持治療，或者KS在進(jìn)一步發(fā)展。
D.IFN-con1和Intron A的MTD的確定在開始研究的第1-9周采用上面的劑量逐步提高方案，然后進(jìn)行維持治療，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候減少劑量，對(duì)三個(gè)治療組確定INTRON-A和IFN-con1的第一和當(dāng)前的MTD，結(jié)果在圖8中示出。每個(gè)組由15個(gè)病人組成。第1組(Intron A和AZT)在劑量以9×106IU逐步提高期間得到第一MTD，并在劑量以6×106IU逐步提高時(shí)得到一當(dāng)前MTD;第2組(IFN-con1和AZT)當(dāng)劑量以15×106IU逐步提高時(shí)得到第一和當(dāng)前MTD;而第3組(IFN-con1、r-met G-CSF和AZT)分別在24×106IU和21×106IU的條件下得到第一和當(dāng)前MTD。
E.Intron A和IFN-con1治療的安全性評(píng)價(jià)Intron A和IFN-con1治療的安全性用需要減少干擾素劑量的負(fù)作用的嚴(yán)重程度來確定。這些結(jié)果匯總在表2中。
表2.在三個(gè)治療組中毒性促使的劑量減少出現(xiàn)頻率(%)出現(xiàn)頻率(%)Intron A IFN-con1IFN-con1和r-metG-CSF*2級(jí)耐量207065(類似流感綜合癥)3級(jí)中性40100白細(xì)胞減少癥3級(jí)肝功能試驗(yàn)30100＊對(duì)IFN-con1，以及IFN-con1和r-met GSCF治療組百分比不能達(dá)到100%，因?yàn)樵谶@些組中有些病人在達(dá)到30×106IU的最大劑量時(shí)沒有出現(xiàn)負(fù)作用。
因?yàn)檫@項(xiàng)研究是開創(chuàng)性的，沒有病人由于施用Intron A或IFN-con1明顯引起的毒性結(jié)果撤出。
F.IFN-con1和INTRON-A治療效率的確定抗腫瘤響應(yīng)在治療四個(gè)月以后用theAIDSClinicalTrials，Group(ACTG)OncologyCommittee的標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)判據(jù)評(píng)價(jià)抗腫瘤響應(yīng)(Krown等人，J.Clin.Oncol.1，1201-1207(1989))。
免疫功能在評(píng)價(jià)病人對(duì)HIV感染的免疫響應(yīng)研究中，在6個(gè)月中的每個(gè)月對(duì)CD4淋巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
在所有三個(gè)治療組中，卡波濟(jì)氏肉瘤損傷響應(yīng)和CD4淋巴細(xì)胞水平是相當(dāng)?shù)摹?br> 例3
對(duì)患丙型肝炎(HCV)的病人施用IFN-con1的安全性、耐藥量以及效力。
改進(jìn)劑量耐性用第一類干擾素治療會(huì)引起幾種副作用，這些副作用對(duì)患一特殊疾病的病人而言將限制其可能接受的絕對(duì)劑量。這些副作用包括流感類綜合癥、腹瀉、骨髓抑制、試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的肝功能的提高、以有精神狀態(tài)失調(diào)。這些毒性是根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ級(jí)(溫和的)，Ⅱ級(jí)(中等的)，Ⅲ級(jí)(嚴(yán)重的)以及Ⅳ級(jí)(有生命危險(xiǎn))來評(píng)定的。由第一類干擾素治療的毒性可從Ⅰ級(jí)-Ⅳ級(jí)，如果病人或醫(yī)生認(rèn)為劑量已大到病人無法忍受在第一類干擾素治療過程中引起的任何毒性醫(yī)生將減少劑量或改變劑量施用方案。施用劑量的這種改變使治療方式并非最佳方式，得到的結(jié)果也低于最佳效果。使用交感干擾素可使施用量達(dá)到最佳劑量，并在整個(gè)治療過程保持該劑量而不會(huì)引起任何給別的極限劑量毒性。
進(jìn)行用交感干擾素治療慢性丙型肝炎感染的臨床試驗(yàn)，以便研究該藥幾個(gè)劑量的施用效果。把用交感干擾素治療病歷與患類似疾病的病人的病歷及人口統(tǒng)計(jì)特性的資料、同一主要研究者用干擾素-α-2a(Roferon)或干擾素-α-2b(IntronA)進(jìn)行治療的資料進(jìn)行比較。
研究計(jì)劃這項(xiàng)研究包括至少30個(gè)受HCV感染后而使丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT一肝酶)水平出現(xiàn)升高的病人(至少高于正常上限1.5倍)。在這項(xiàng)研究中正常的上限是35毫單位/毫升(35mμ/ml)。此外，IFN-con1的效力可以用RCR分析法測(cè)定抗病毒活性及測(cè)定治療過程中ALT值來加以評(píng)價(jià)。最后，將用其他重組的α干擾素(特別是重組干擾素α-2a(Roferon)以及α-2b-(IntronA)的HCV臨床研究的過去的資料與引起研究中的資料進(jìn)行比較。
在表3中總結(jié)了登記在IFN-con1劑量組之一的適當(dāng)?shù)牟∪恕?br> 表3IFN-con1劑量(百萬(wàn)單位,MU) 劑量/7天(周*) 病人數(shù)33563593512351535＊至少48小時(shí)后才可區(qū)別出劑量的不同。
順序選擇幾個(gè)劑量組，各劑量組之間有兩周的間隔。具體地說，5個(gè)病人進(jìn)入第一組，如果沒有觀察到可歸于IFN-con1的Ⅲ級(jí)或更高級(jí)的毒性，則對(duì)其在兩周安全期的表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，5個(gè)病人進(jìn)入下一組(6MU)。但是，如果觀察到有病人出現(xiàn)可歸因于IFN-con1的Ⅲ級(jí)或更高級(jí)的毒性反應(yīng)，再追加3個(gè)病人進(jìn)入該第一組，并且評(píng)價(jià)其兩周的表現(xiàn)。如果沒有發(fā)現(xiàn)可歸因于IFN-con1的額外的Ⅲ級(jí)或更高級(jí)的毒性，再把這些病人編入下一組(6MU)。但是，如果觀察到任何額外的可歸因于IFN-con1的Ⅲ級(jí)或更高級(jí)級(jí)的毒性，則這些病人不能進(jìn)入下一較高劑量組(6MU)。按照上述將病人逐步編入9、12、15、18以及24MU組。此外，如果發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)或更多的病人任何劑量水平出現(xiàn)可歸因于IFN-con1的Ⅲ級(jí)或更高級(jí)的毒性，就不應(yīng)追加病人進(jìn)入該組，而且對(duì)已經(jīng)編入該組進(jìn)行研究治療的病人或者正接受更高劑量水平治療的病人，應(yīng)把劑量減少到出現(xiàn)2個(gè)或更多個(gè)Ⅲ級(jí)或更高級(jí)毒性水平的劑量水平之下。然而，可以繼續(xù)把其他病人追加進(jìn)出現(xiàn)兩個(gè)或更多個(gè)Ⅲ組或更高毒性的劑量水平的組(追加病人的總數(shù)最多為10個(gè))。
如果在開始評(píng)價(jià)的兩周內(nèi)或兩周以后在任何組中發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)可歸因于IFN-con1的Ⅲ級(jí)毒性反應(yīng)的病人，應(yīng)暫停施用IFN-con1，直到毒性減少到Ⅱ級(jí)或更低。然后把劑量恢復(fù)到略低的劑量水平上繼續(xù)治療。如果病人出現(xiàn)Ⅲ級(jí)毒性反應(yīng)時(shí)正接受3MU劑量的治療，治療隨后應(yīng)在2MU水平上繼續(xù)進(jìn)行。如果發(fā)現(xiàn)有病人出現(xiàn)可歸因于IFN-con1的Ⅳ級(jí)毒性，應(yīng)把該病人從此項(xiàng)研究中撤出。在整個(gè)研究治療過程中，允許病人的劑量減少3次(但減少后的劑量不應(yīng)低于2MU的劑量水平)。任何因毒性反應(yīng)需將劑量減少四次的病人都應(yīng)從研究治療中撤出。出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間少于24小時(shí)的發(fā)熱和發(fā)冷、疲勞、頭痛或者出現(xiàn)Ⅱ級(jí)或更低級(jí)毒性時(shí)不應(yīng)認(rèn)為達(dá)到了極限劑量毒性，除非確定該病人也無法忍受。藥物可以由病人自己在家施用，或者由第三者(經(jīng)全面的培訓(xùn)合格后)幫助施用。
評(píng)價(jià)病人對(duì)ALT劑量水平變化的響應(yīng)，應(yīng)觀察三個(gè)月。
結(jié)果將病人編入上述組中。在最初的2周內(nèi)，對(duì)于3、6、9及12MU劑量組，沒有發(fā)現(xiàn)任何病人出現(xiàn)極限劑量毒性。在施用藥物的最初2周內(nèi)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)接受15MU治療的病人出現(xiàn)極限劑量毒性反應(yīng)。所觀察到的毒性是無法忍受的Ⅱ級(jí)“流感類綜合癥”。將該病人的劑量降低到12MU。
對(duì)每個(gè)組，在12周治療期間極限劑量毒性和歷史IFN-con-α2的病人如下表4IFN-con1劑量(MU) DLT的百分比毒性n=430-n=560-n=590-n=51220%"流感類"n=51520%"流感類"n=193MUIFN-α232%"流感類"如上表所述，每周接受3次3至15MU劑量之間的IFN-con1的病人比接受IFN-α2的病人出現(xiàn)極限劑量毒性的次數(shù)少。因?yàn)樵谶@項(xiàng)研究中，IFN-α2的劑量只能到3MU，所以無法與更高劑量水平的IFN-α2進(jìn)行臨床比較。但是可以預(yù)計(jì)，對(duì)接受更高的劑量水平IFN-α2治療的病人，出現(xiàn)極限劑量毒性反應(yīng)的數(shù)量會(huì)大大進(jìn)高。
表5治療12周后的反應(yīng)IFN-con1(百萬(wàn)單位)反應(yīng)率*n=4325%n=5660%n=5980%n=51260%
n=41575%n=193MUIFN-α247%＊完全加部分反應(yīng)如由上表所述，每周接受3次3至15MU之間劑量的IFN-con1的病人的ALT反應(yīng)率至少與用3MU的IFN-α2治療時(shí)所觀察到的指標(biāo)相同。
上述結(jié)果證明，與IFN-α2療法相比，IFN-con1療法的效力率更高，同時(shí)耐藥性也更好。
雖然上面已以實(shí)施例的形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了敘述，可以理解，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以對(duì)之進(jìn)行各種變化和改進(jìn)。因此，希望下面所附的權(quán)利要求能覆蓋所有這些與本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍等效的變化。
權(quán)利要求
1.一個(gè)治療用一種干擾素可以治療的疾病的方法，可以降低或消除與施用干擾素有關(guān)的一種或更多種副作用，包括對(duì)所述患者施用一種具有療效量的交感白細(xì)胞干擾素。
2.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述疾病是一種細(xì)胞增殖失調(diào)或一種病毒疾病。
3.一種如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述疾病是甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎或δ型肝炎。
4.一種如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述病毒疾病是選自人類免疫缺陷病毒、皰疹病毒、乳頭狀瘤、痘病病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、腺病毒、鼻病毒，，HTLVⅠ、HTLVⅡ以及人類旋轉(zhuǎn)病毒。
5.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的副作用是選自頭痛、發(fā)燒、發(fā)冷、惡心、食欲缺乏、抑郁、以及失眠。
6.一種如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于細(xì)胞增殖失調(diào)是多毛細(xì)胞白血病或慢性骨髓白血病。
7.一種如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于細(xì)胞增殖失調(diào)是卡波濟(jì)氏肉瘤。
8.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述交感人類白細(xì)胞干擾素是選自IFN-con1、IFN-con2、以及IFN-con3。
9.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述交感人類白細(xì)胞干擾素是IFN-con1。
10.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述交感人類白細(xì)胞干擾素是一外原DNA順序的原核生物表達(dá)產(chǎn)物。
11.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于施用具有療效量的藥物的方式為口服、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、皮下、鼻內(nèi)、或損害部位內(nèi)施用。
12.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于交感人類體白細(xì)胞干擾素的療效量為每病人2×106-30×106單位。
13.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于交感人類體白細(xì)胞干擾素的療效量為每病人6×106-15×106單位。
14.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于患者是一個(gè)人。
15.一種如權(quán)利要求1所述的方法，還包括施用一種具有療效量的化學(xué)治療劑。
16.一種如權(quán)利要求1所述的方法，還包括施用具有療效量的G-CSF。
17.一種制劑，包括具有療效量的交感人類體白細(xì)胞干擾素以及一種可作為藥物的稀釋劑、佐劑、載體、防贅劑或增溶劑。
18.一種如權(quán)利要求17所述的制劑，其特征在于交感人類體白細(xì)胞干擾素是選自IFN-con1、IFN-con2、以及IFN-con3。
19.一種如權(quán)利要求17所述的制劑，其特征在于交感人類體白細(xì)胞干擾素是IFN-con1。
20.一種如權(quán)利要求17所述的制劑，其特征在于交感人類體白細(xì)胞干擾素是一外原DNA順序的原核生物產(chǎn)物。
21.一種如權(quán)利要求17所述的制劑，適于口服、靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或損害部?jī)?nèi)施用。
22.一種如權(quán)利要求17所述的制劑，可以注射溶液或冷凍干燥粉末的劑型使用。
23.一種如權(quán)利要求17所述的制劑，還包括具有療效量的G-CSF。
24.一種用干擾素治療病毒疾病的方法，該方法不會(huì)產(chǎn)生一種或多種極限劑量毒性，包括按病人本身需要對(duì)病人施用具有療效量的交感人類體白細(xì)胞干擾素。
25.一種用于治療細(xì)胞增殖失調(diào)或病毒感染的方法，該方法不會(huì)引起通常與干擾素治療有關(guān)的明顯的副作用，包括按病人本身需要對(duì)病人施用具有療效量的交感人類體白細(xì)胞干擾素。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于治療細(xì)胞增殖失調(diào)、病毒感染以及其他不引起通常與干擾素治療有關(guān)的明顯的副作用的方法，這些方法包括根據(jù)需要施用具有療效量的交感人類體白細(xì)胞干擾素。本發(fā)明還公開了交感人類體白細(xì)胞干擾素的藥物制劑。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1081909SQ9310570
公開日1994年2月16日 申請(qǐng)日期1993年4月15日 優(yōu)先權(quán)日1992年4月15日
發(fā)明者L·M·左拉特, M·W·泰勒 申請(qǐng)人:安姆根有限公司