專利名稱：利用人類白血球抗原(hla)篩檢預(yù)測藥物不良反應(yīng)的方法
利用人類白血球抗原(HLA)篩檢預(yù)測藥物不良反應(yīng)的方法相關(guān)申請的交叉引用本申請主張于2010年4月12日遞交的美國臨時申請No. 61/323，067的優(yōu)先權(quán)。在此通過整體引用該在先申請將其內(nèi)容結(jié)合到本申請中。
背景技術(shù)：
不良藥物反應(yīng)(ADR)仍為臨床上及制藥工業(yè)的主要問題。在許多ADR類型中，以史蒂生-瓊森癥候群(Stevens-Johnson syndrome, SJS)、中毒性表皮壞死溶解(TEN)及過敏癥候群(HSS)最嚴(yán)重且危及生命，其中，SJS及TEN有10-50%的死亡率。參看Roujeau等人，New Engl. J. Med. 333:1600-1607(1995)。盡管 SJS/TEN/HSS 的發(fā)病率低，但這些病狀可能會造成個死亡或?qū)е聡?yán)重殘疾。對于制藥工業(yè)而言，發(fā)生嚴(yán)重藥物過敏是非常不利的；目前有部分的新藥因為會造成嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)，而招致藥品退市的命運(yùn)。參看畫· fda.gov/safety/recalls/default, htm。已發(fā)現(xiàn)某些I型人類白血球抗原(HLA)對偶基因(例如HLA-A及HLA-B對偶基因)及某些II型HLA對偶基因(例如HLA-DR對偶基因)與ADR有關(guān)。參看Hung等人，Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102:4134-4139(2005) ;Daly 等人，Nat. Genet. 41:816-819 (2009)；Hautekeete, Gastroenterology 117 (5) : 1181-6 (1999) ^Dettling M, PharmacogenomicsJ. 7 (5) : 325-32 (2007)。所有這些ADR-HLA對偶基因的關(guān)聯(lián)性，是在測定罹患核準(zhǔn)上市藥物誘發(fā)ADR的患者后被發(fā)現(xiàn)。目前，尚沒有可用于預(yù)測開發(fā)中的候選藥物是否會在人類中產(chǎn)生這些危及生命的病狀(諸如SJS/TEN/HSS)的方法。因為新藥物開發(fā)可能平均耗費(fèi)10億元及10年時間，所以開發(fā)適用于在藥物開發(fā)早期階段預(yù)測候選藥物的安全性概況的篩選方法將具有重大價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及自HLA庫中鑒別出會與化合物結(jié)合的HLA復(fù)合物(若存在)的方法。此方法可依用于預(yù)測化合物是否將誘發(fā)不良藥物反應(yīng)，且若誘發(fā)不良藥物反應(yīng)，在哪一人類群體中誘發(fā)。本發(fā)明方法包括至少4個步驟⑴提供HLA庫(例如I型或II型HLA庫)，其包括位于支撐構(gòu)件上的多個地址處的多種HLA復(fù)合物(例如可溶性HLA復(fù)合物)，各HLA復(fù)合物指定于一獨(dú)特地址，( )使化合物與HLA復(fù)合物接觸，(iii)判定該化合物是否會與庫中的HLA復(fù)合物結(jié)合，且，若結(jié)合，(iv)則基于HLA復(fù)合物的地址鑒別與化合物結(jié)合的HLA復(fù)合物。本文所用的術(shù)語“獨(dú)特地址〃是指支撐構(gòu)件上一種且僅一種類型的HLA復(fù)合物所位于的點。在一個實例中，HLA庫為以微芯片為基礎(chǔ)的庫，其包括連接于支撐構(gòu)件的多種HLA復(fù)合物。在此情形中，判定步驟可通過表面等離子共振(SPR)來執(zhí)行。在另一實例中，HLA庫為以細(xì)胞為基礎(chǔ)的庫，其包括各自表達(dá)特定HLA復(fù)合物的多個細(xì)胞株。各細(xì)胞株可通過表達(dá)HLA復(fù)合物的親本細(xì)胞來制備，該親本細(xì)胞優(yōu)選地缺乏至少一種類型的HLA (例如I型HLA)。在此情形下，判定步驟可通過收集自各地址的HLA復(fù)合物，且通過質(zhì)譜法判定HLA復(fù)
4合物是否與化合物結(jié)合來執(zhí)行。或者，化合物可經(jīng)同位素標(biāo)記且通過檢驗各地址處的放射性來執(zhí)行判定步驟。以下說明書中闡述本發(fā)明一個或多個實施例的細(xì)節(jié)。本發(fā)明的其它特征或優(yōu)點將自以下附圖及實施方式、以及隨附權(quán)利要求書中顯而易知。


圖I為說明獲得能夠與HLA-Β-β 2微球蛋白復(fù)合物結(jié)合的肽的方法的流程圖，其中該復(fù)合物是由穩(wěn)定表達(dá)可溶性HLA-B分子的ClR細(xì)胞中產(chǎn)生。圖2為說明表面等離子共振檢定的流程圖。圖3為顯示在37°C過夜下未脈沖自體性B-LCL細(xì)胞(敞開條)或以25 μ g/ml CBZ,0XC、GAB或媒劑對照脈沖的自體性B-LCL細(xì)胞(封閉框)的特異性溶解圖表。分析三名患者的資料以獲得平均值土SD。* p<0. 05 (未脈沖B-LCL細(xì)胞相對于經(jīng)脈沖B-LCL細(xì)胞)。** p<0. 001 (藥物處理組相對于媒劑處理組)。圖4顯示在固定(封閉條)及未固定(敞開條)B-LCL存在下自體性T細(xì)胞增殖的圖表。通過習(xí)知[3H]胸苷摻入檢定測定T細(xì)胞增殖。* :p〈0.05(藥物處理組相對于媒劑處理組)。圖5為顯示各種濃度下的CBZ及其類似物(62. 5至1000 μ Μ)與涂布于CM5芯片上的可溶性HLA-B*1502結(jié)合的圖表。通過標(biāo)準(zhǔn)DMSO溶劑校正曲線使用TlOO評估軟件自4至7個獨(dú)立實驗計算相對反應(yīng)(R. U.)。圖6為顯示CBZ及其類似物與各種HLA-B分子結(jié)合的圖表。圖表中顯示的數(shù)據(jù)表示4至11個獨(dú)立實驗的平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。
具體實施例方式本文描述使用HLA庫篩選會與化合物(例如小分子藥物或藥物候選物)特異性相互作用的HLA復(fù)合物(若存在)的方法。此方法可用于評估化合物誘發(fā)不良藥物反應(yīng)的機(jī)率，并可用于鑒別會對測試化合物產(chǎn)生藥物過敏的高風(fēng)險人類群體(亦即，帶有此方法中鑒別出的HLA復(fù)合物的人類群體)。因此，此在新藥物開發(fā)中尤其重要，因為其幫助預(yù)測藥物候選物是否可能引起不良藥物反應(yīng)，且若引起不良藥物反應(yīng)，會在哪一患者群體中引起。本發(fā)明方法中使用的HLA庫可為I型庫，其包括一個或多個HLA復(fù)合物子群(例如HLA B庫)。HLA-B對偶基因為最具多形性的基因之一，其具有超過800個變異體。參看Marsh, Marsh, Hum. Immunol. 71(4) :432_6;2010。必要時，HLA-B 庫可包括所有已知的 800種以上不同HLA-B復(fù)合物。HLA庫亦可為II型庫，其包括一個或多個II型HLA復(fù)合物子群(例如HLA-DR庫)?；蛘?，HLA庫可含有I型及II型HLA復(fù)合物兩者。必要時，任何上述庫均可擴(kuò)展以包括新HLA復(fù)合物。I型及II型HLA對偶基因是本領(lǐng)域公知的。舉例而言，這些對偶基因可自GenBank 或由 HUGO 基因命名委員會(HUGO Gene Nomenclature Committee)、EMBL 茵格斯頓分部(EMBL Outstation-Hinxton)、歐洲生物信息研究所(European BioinformaticsInstitute)、英國茵格斯頓劍橋 Wellcome Trust 基因體科學(xué)園 CBlO ISD (Wellcome TrustGenome Campus Hinxton Cambridge CBlO 1SD, UK)(參看http://www. genenames. org/)提供的數(shù)據(jù)庫擷取。本發(fā)明方法可使用以細(xì)胞為基礎(chǔ)或以微芯片為基礎(chǔ)的HLA庫執(zhí)行。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的HLA庫以細(xì)胞為基礎(chǔ)的HLA庫含有多個細(xì)胞株，其各自產(chǎn)生獨(dú)特的HLA復(fù)合物。各細(xì)胞株可經(jīng)由已知的重組技術(shù)，將親本細(xì)胞(優(yōu)選為哺乳動物細(xì)胞)進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)(a)I型HLAa鏈及視情況選用的β 2-微球蛋白(若親本細(xì)胞不表達(dá)內(nèi)源性β 2-微球蛋白)，或(b)II型HLAa鏈及II型HLAii鏈來制備。用于構(gòu)建庫的親本細(xì)胞優(yōu)選缺乏至少一種類型的HLA對偶基因，例如I型HLA、II型HLA或其子群。此種細(xì)胞株包括(但不限于)ATCCCRL-1933 (ClR)、ATCC CRL-2309 (KerTr)、ATCC CRL-1992 (T2)、ATCC CRL-2134 (LS513)、ATCC CRL-2158(LS1034)、ATCC CRL-2159 (LS411N)、ATCC CRL-2547 (Pane 10. 05)、ATCCCRL-255l(Panc 08. 13)、ATCC CRL-2553(Pane 02. 03)、ATCC CRL-2549(Pane 03. 27)、ATCCCRL-2554(Pane 02.13)、ATCC CRL-2555(Panc04. 03)及 ATCC CRL-2557(Pane 05.04)。在此清單中，前兩個細(xì)胞株缺乏I型HLA而其余細(xì)胞株缺乏II型HLA。可經(jīng)由例行程序來選擇可穩(wěn)定表達(dá)所欲HLA分子的經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞?？蛇x擇產(chǎn)生高含量I型HLA復(fù)合物(由I型HLA α鏈及β 2_微球蛋白構(gòu)成)或II型復(fù)合物(由II型HLAa鏈及II型HLAii鏈構(gòu)成)的穩(wěn)定細(xì)胞株作為以細(xì)胞為基礎(chǔ)的HLA庫的成員。在一個實例中，所選細(xì)胞株表達(dá)全長HLA分子。在另一實例中，其表達(dá)HLA分子的片段，包括其胞外域。該種細(xì)胞株產(chǎn)生可溶性HLA復(fù)合物。根據(jù)上文所述的程序，可構(gòu)建表達(dá)多種HLA復(fù)合物的細(xì)胞株，亦即每種細(xì)胞株可產(chǎn)生一種類型HLA復(fù)合物。多種HLA復(fù)合物可包括I型HLA(例如HLA-A、HLA-B, HLA-C,HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K, HLA-L 或其組合)、II 型 HLA(例如 HLA-DP、HLA-DQ, HLA-DR、HLA-DM、HLA-DO或其組合)。這些穩(wěn)定細(xì)胞株形成以細(xì)胞為基礎(chǔ)的HLA庫。各穩(wěn)定細(xì)胞株可安置于支撐構(gòu)件的孔(亦即獨(dú)特地址)中。為了執(zhí)行本文所述的篩選法，將各細(xì)胞株與測試化合物一起培養(yǎng)一適合時段。接著洗滌細(xì)胞以移除該化合物的游離分子，接著檢驗并判定細(xì)胞所表達(dá)的HLA復(fù)合物是否與化合物結(jié)合。參看圖I。在一個實例中，化合物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記，且基于各孔相對于空白對照的放射性程度判定化合物與HLA復(fù)合物間的結(jié)合。若孔中的放射性程度大于空白對照，則表示彼孔中細(xì)胞產(chǎn)生的HLA復(fù)合物能夠與化合物結(jié)合。當(dāng)使用產(chǎn)生可溶性HLA復(fù)合物的細(xì)胞株時，可以下示方式判定其與測試化合物的結(jié)合。在細(xì)胞以測試化合物處理之后，收集各孔中的上清液且使用含有HLA特異性試劑(例如能夠結(jié)合于所有類型的I型或II型HLA的抗體)的親和力管柱純化可溶性HLA復(fù)合物。含有經(jīng)純化HLA復(fù)合物的樣品在適合溫度(例如70°C )下加熱10分鐘，以解離化合物(可連接于肽)與HLA復(fù)合物之間的結(jié)合。例如使用離心過濾器(3-1^^截斷,4111；[(3011Ultra-4, Millipore)收集含有低分子量組分(例如<3_kDa)的部分,且進(jìn)行液相層析聯(lián)合質(zhì)譜分析法以判定其是否含有測試化合物。已知抗原呈遞細(xì)胞(APC)對某些藥物(例如阿巴卡韋(abacavir)及青霉素(penicillin))的呈遞為加工依賴性(processing-dependent)的。亦即，在進(jìn)入細(xì)胞之后，這些化合物共價結(jié)合于載體蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)接著經(jīng)加工且由APC細(xì)胞呈遞。參看Schnyder 等人，J. Clin. Invest. 100:136—141 (1997)及 Naisbitt 等人，J. Allergy Clin.
6Immunol. 111:1393-1403(2003)。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的I型HLA庫尤其適用于篩選對HLA復(fù)合物具特異性的經(jīng)由加工依賴性路徑而由APC呈遞的化合物。以芯片為某礎(chǔ)的HLA庫以芯片為基礎(chǔ)的HLA庫可經(jīng)由常規(guī)的方法將各種HLA復(fù)合物(較佳含有HLA分子的胞外域)各自固定于微芯片的獨(dú)特點上來制備。參看例如Nature Reviews DrugDiscovery. 1:515-528(2002)。各種HLA復(fù)合物可自上文所述的穩(wěn)定細(xì)胞株獲得。為了篩選能夠與測試化合物結(jié)合的HLA復(fù)合物，可在允許化合物與其同源(cognate)HLA復(fù)合物結(jié)合的條件下，將連接于微芯片的各種HLA復(fù)合物與化合物一起培育適合時段。接著洗滌芯片以移除未結(jié)合的化合物分子，接著進(jìn)行SPR量測以鑒別與化合物結(jié)合的HLA復(fù)合物。在發(fā)現(xiàn)HLA復(fù)合物與測試化合物結(jié)合之后，可基于其在芯片上的地址確定其身分。SPR為高產(chǎn)量、無標(biāo)記相互作用分析系統(tǒng)，且用于諸如藥物研發(fā)、抗體表征、蛋白質(zhì)組研究、免疫原性、生物治療劑開發(fā)及制造、及許多生命科學(xué)研究應(yīng)用的領(lǐng)域。表面等離子共振(SPR)檢測緊鄰傳感器芯片的表面層的折射率的變化。共振角的此變化可以共振信號(與質(zhì)量變化成比例)相對于時間的曲線圖形式非侵入性實時監(jiān)測。參見圖2。使用以芯片為基礎(chǔ)的HLA庫可鑒別對經(jīng)由加工獨(dú)立性路徑由APC呈遞(亦即直接結(jié)合于HLA復(fù)合物)的化合物具特異性的HLA復(fù)合物(參看Wu等人，J. Allergy Clin.Tmmunol.118:233-241;2006 及 Marsh, Hum. Tmmunol. 71(4):432-6;2010)。若經(jīng)本發(fā)明方法鑒別，無HLA復(fù)合物與測試化合物結(jié)合的現(xiàn)象，則表明此化合物誘發(fā)ADR的機(jī)率較低。另一方面，若此方法中鑒別出測試化合物與HLA復(fù)合物的結(jié)合，則表明測試化合物誘發(fā)ADR的機(jī)率較高，且在表達(dá)該HLA復(fù)合物的人類中尤其如此。此項技術(shù)中已知某些HLA對偶基因在特定人類種族中出現(xiàn)的頻率比其它種族高。參看WWW. allelefrequencies. net。基于此知識,本發(fā)明方法獲得的結(jié)果可用于預(yù)測哪一種族將對特定藥物或藥物候選物敏感。這將關(guān)于臨床試驗中患者的選擇及銷售決策方面引導(dǎo)藥物開發(fā)。下表I列出高加索人(Caucasians)、亞洲人(Asians)及非裔美國人(AfricanAmericans)中的主要HLA-B對偶基因。表I.高加索人、亞洲人及非裔美國人中的主要HLA-B對偶基因
權(quán)利要求
1.一種鑒別會與化合物結(jié)合的HLA復(fù)合物的方法，其包括提供HLA庫，其包括位于支撐構(gòu)件上的多個地址處的多種HLA復(fù)合物，所述HLA復(fù)合物各自指定于一獨(dú)特地址；使化合物與所述HLA復(fù)合物接觸；判定該化合物是否與所述HLA復(fù)合物中的之一結(jié)合；及當(dāng)該化合物與一個HLA復(fù)合物結(jié)合時，基于該一個HLA復(fù)合物的地址鑒別與該化合物結(jié)合的該一個HLA復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述HLA復(fù)合物為I型HLA復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述I型HLA復(fù)合物為HLA-B復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述HLA復(fù)合物為II型HLA復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述II型HLA復(fù)合物為HLA-DR復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中該HLA-B庫為以微芯片為基礎(chǔ)的庫，其中該多種HLA復(fù)合物連接于該支撐構(gòu)件。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述HLA復(fù)合物為其天然存在的對應(yīng)物的胞外域。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中該判定步驟系通過表面等離子共振來執(zhí)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中該HLA庫為以細(xì)胞為基礎(chǔ)的庫，該庫包括多個表達(dá)該多種HLA復(fù)合物的細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述HLA復(fù)合物為其天然存在的對應(yīng)物的胞外域。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該多個細(xì)胞各自通過在缺乏I型HLA的親本細(xì)胞中表達(dá)I型HLA復(fù)合物來制備。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該多個細(xì)胞各自通過在缺乏II型HLA的親本細(xì)胞中表達(dá)II型HLA復(fù)合物來制備。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該判定步驟通過自各地址收集該HLA復(fù)合物且通過質(zhì)譜法判定該HLA復(fù)合物是否結(jié)合于該化合物來執(zhí)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該化合物具放射性且該判定步驟通過檢驗各地址處的放射性來執(zhí)行。
15.—種評估化合物于施用該化合物的個體中誘發(fā)不良藥物反應(yīng)的風(fēng)險的方法，其包括提供HLA庫，其包括位于支撐構(gòu)件上的多個地址處的多種HLA復(fù)合物，所述HLA復(fù)合物各自指定于一獨(dú)特地址；使化合物與所述HLA復(fù)合物接觸；及判定該化合物是否與所述HLA復(fù)合物之一結(jié)合；其中當(dāng)該化合物與所述HLA復(fù)合物之一結(jié)合時，表示該化合物會于施用該化合物的個體中誘發(fā)不良藥物反應(yīng)的風(fēng)險。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，當(dāng)該化合物與該一個HLA復(fù)合物結(jié)合時，其進(jìn)一步包括基于該一個HLA復(fù)合物的地址鑒別與該化合物結(jié)合的該一個HLA復(fù)合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述HLA復(fù)合物為I型HLA復(fù)合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述I型HLA復(fù)合物為HLA-B復(fù)合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述HLA復(fù)合物為II型HLA復(fù)合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述II型HLA復(fù)合物為HLA-DR復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于自HLA庫鑒別出會與化合物特異性結(jié)合的HLA復(fù)合物的方法。此方法可用于評估化合物是否可能誘發(fā)不良藥物反應(yīng)，且若誘發(fā)不良藥物反應(yīng)，在哪一人類群體中誘發(fā)。
文檔編號C40B40/10GK102918396SQ201180018181
公開日2013年2月6日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者陳垣崇, 洪舜郁, 魏淳郁 申請人:中央研究院