專利名稱：禽白細(xì)胞干擾素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑，具體是用于緊急預(yù)防和治療家禽病毒性傳染病如禽流感、新城疫、禽傳染性支氣管炎、小鵝瘟、鴨瘟等病的禽白細(xì)胞干擾素。
背景技術(shù)：
目前對(duì)家禽的病毒性傳染病控制，常規(guī)使用疫苗、化學(xué)藥品和抗生素。然而，化學(xué)制品和抗生素的廣泛應(yīng)用，尤其是食物鏈中耐藥菌的出現(xiàn)，已經(jīng)引起人們對(duì)環(huán)境和人類健康的擔(dān)憂。細(xì)胞因子如干擾素作為機(jī)體免疫應(yīng)答的自然介質(zhì)抗病毒作用，相對(duì)于傳統(tǒng)的治療方式，提供了令人興奮的選擇余地。干擾素是在特定的誘生劑作用下，由細(xì)胞產(chǎn)生的一組具有多種功能的免疫活性蛋白，主要是糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)三大功能。干擾素的研究是現(xiàn)代獸醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代生物學(xué)中比較活躍的一個(gè)新領(lǐng)域。
至今市場(chǎng)上未見有一種價(jià)格合理，療效顯著的禽白細(xì)胞干擾素制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在本室具有制備人α型白細(xì)胞干擾素(interferon，IFN)成功的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)上，研制和開發(fā)的禽白細(xì)胞干擾素制品，為禽類抗病毒性疾病用生物制品市場(chǎng)注入新的治療用品。
本發(fā)明技術(shù)方案如下禽白細(xì)胞干擾素的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)、無(wú)菌采集禽的新鮮抗凝血、分離收集白細(xì)胞懸液；(2)、禽白細(xì)胞懸液中加入啟動(dòng)用粗純制禽白細(xì)胞干擾素進(jìn)行短時(shí)啟動(dòng)超誘導(dǎo)培養(yǎng)；(3)、加入誘導(dǎo)劑——雞新城疫病毒(NDV)及含有禽血清或血漿的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行誘生培養(yǎng)18-24小時(shí)；(4)、收集上清液，滅活雞新城疫病毒等，濾過(guò)除菌；(5)分裝好的禽白細(xì)胞干擾素粗制品，冷凍保存。
上述的禽白細(xì)胞干擾素的制備方法，其特征在于(1)、以800rpm～2500rpm離心裝有新鮮抗凝血瓶30min，收集血灰黃層，得到富含禽全血白細(xì)胞懸液，用已預(yù)溫的培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液濃度稀釋成1×107/ml細(xì)胞懸液；(2)、在已稀釋好的細(xì)胞懸液中加入少量粗純制禽白細(xì)胞干擾素，使其最終濃度為100單位/ml，置于37℃水浴搖床攪拌培養(yǎng)2小時(shí)；(3)、在啟動(dòng)后的禽白細(xì)胞懸液中加入NDV，使其最終濃度為100～150血凝單位/ml，并同時(shí)在白細(xì)胞懸液中加入原全血1～1.5倍體積量的含10％禽血清或禽血漿的RPMI 1640營(yíng)養(yǎng)液，加入終濃度為10μg/ml的卡那霉素，調(diào)懸液酸堿度至pH7.4，37℃搖床攪拌培養(yǎng)18～24小時(shí)；(4)、經(jīng)2000rpm～3000rpm離心30min，取上清液，加入6N HCl調(diào)至pH 2.0，置4℃4～5天，每日振搖2～3次。再用6N NaOH調(diào)至pH7.2，即得到禽白細(xì)胞干擾素粗制品。
本發(fā)明中“預(yù)溫的培養(yǎng)液”是指把保存在4℃ RPMI 1640等置室溫或水浴鍋中加熱到接近37℃；“過(guò)夜”在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)通常指在4℃或37℃放置12小時(shí)～18小時(shí)；PB是含0.5M KCNS溶液；本發(fā)明所稱的“禽”包括雞、鵝、鴨等。
本發(fā)明制備的禽白細(xì)胞干擾素，經(jīng)分離純化后，制成凍干粉針劑，規(guī)格為干擾素效價(jià)≥2萬(wàn)單位/瓶；2～8℃或室溫≤25℃保存。使用時(shí)，加2ml無(wú)菌雙蒸水后，能迅速溶解為均勻懸濁液，輕輕搖勻后可進(jìn)行肌肉注射。幼禽500～1000單位/只/天；成年禽10000～20000單位/只/天。每日注射1次，一個(gè)療程3～5次。
本發(fā)明成功地解決了禽新鮮血源來(lái)源及污染等問題，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格田間實(shí)驗(yàn)和區(qū)域?qū)嶒?yàn)證實(shí)，無(wú)可見不良反應(yīng)。禽白細(xì)胞干擾素注入動(dòng)物機(jī)體后，治療禽流感、新城疫、禽傳染性支氣管炎、小鵝瘟、鴨瘟等病毒性疾病，具有療效好、安全可靠、無(wú)毒副作用和不污染環(huán)境等特點(diǎn)。
在治療已發(fā)病禽的同時(shí)，應(yīng)及時(shí)隔離未發(fā)病禽，并給予等量藥物預(yù)防注射。使用本發(fā)明制備的禽白細(xì)胞干擾素時(shí)，應(yīng)同時(shí)實(shí)施環(huán)境的消毒等綜合預(yù)防辦法，防止再感染或疫病的復(fù)發(fā)。
具體實(shí)施例方式
禽白細(xì)胞干擾素制備工藝一、配制抗凝劑(每支12500單位的肝素鈉加Hank's液10ml，每毫升為1250單位)及抗生素(卡那霉素，使用時(shí)終濃度為100μg/ml)。
二、在事先已加有抗凝劑和抗生素的無(wú)菌容器中，無(wú)菌采集禽全血，搖勻，在4℃冰箱放置備用。
三、制備雞新城疫病毒(F系)，并滴定其效價(jià)。
四、按產(chǎn)品說(shuō)明書規(guī)定溶解RPMI 1640粉劑，經(jīng)蔡氏濾器加壓過(guò)濾，無(wú)菌檢測(cè)后在4℃冰箱放置備用。
五、粗制品干擾素制備(1)、以800rpm～2500rpm離心裝有新鮮抗凝血瓶30min，收集灰黃層，得到富含白細(xì)胞的懸液，用已預(yù)溫的培養(yǎng)液稀釋成1×107/ml細(xì)胞懸液；(2)、在已稀釋好的細(xì)胞懸液中加入少量粗純禽白細(xì)胞干擾素，使其最終濃度為100單位/ml，置于37℃水浴搖床攪拌培養(yǎng)2小時(shí)；(3)、在啟動(dòng)后的禽白細(xì)胞懸液中加入NDV，使其最終濃度為100～150血凝單位/ml，并同時(shí)在白細(xì)胞懸液中加入原全血1～1.5倍體積量的含10％禽血清或禽血漿的RPMI 1640營(yíng)養(yǎng)液，加入終濃度為10μg/ml的卡那霉素，調(diào)整該懸液酸堿度至pH7.4，37搖床攪拌培養(yǎng)18～24小時(shí)；(4)、經(jīng)2000rpm～3000rpm離心30min，取上清液，加入6N HCl調(diào)至pH2.0，4℃放置4～5天，每日振搖2～3次。再用6N NaOH調(diào)至pH7.2，即得到禽白細(xì)胞干擾素粗制品。留取樣品進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、余毒檢驗(yàn)等。
將上述粗制白細(xì)胞干擾素在4℃下經(jīng)2000rpm～3000rpm離心30min，取上清液用蔡氏濾器加壓過(guò)濾，無(wú)菌收集濾液，再取樣進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、余毒檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)和效價(jià)測(cè)定等均合格后，加入終濃度含5％無(wú)菌脫脂牛奶、5％GS和10％禽血清(或血漿)作為凍干保護(hù)劑混勻后，置入凍干機(jī)保存。
干擾素粗制品依下列步驟精制(硫氰酸鉀鹽析純化)(1)、在粗制干擾素中加1/10量4℃預(yù)冷的5M KCNS，慢加攪拌，加完后用4℃預(yù)冷2N HCl調(diào)pH至3.5(慢加3ml/min)4℃過(guò)夜。
(2)、棄去上清，取沉淀，4℃ 2000rpm 20min。
(3)、棄上清，沉淀中加1/15量-20℃預(yù)冷95％酒精。先加少量酒精，組織勻漿器快檔研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl調(diào)至pH4.0。
(4)、4℃2500rpm 20min，棄沉淀。
(5)、上清用1N NaOH調(diào)至pH5.0～5.5。
(6)、4℃2000rpm 20min，棄沉淀。
(7)、上清用0.1N NaOH調(diào)至pH5.6。
(8)、4℃ 2000rpm 20min離心，棄沉淀。
(9)、上清用1N NaOH調(diào)至pH8.0。
(10)、4℃ 2000rpm 20min離心，棄上清。
(11)、沉淀物中加入原體積1/10～1/15量pH8.00.1M PB(含0.5MKCNS)。
(12)、電磁攪拌過(guò)夜，使之充分溶解。
(13)、4℃ 2000rpm 20min離心，棄沉淀。
(14)、上清用2N HCl調(diào)至pH3.0。
(15)、4℃ 2000rpm 20min離心，棄上清。
(16)、沉淀物中加入1/100量pH8.0 0.1M PB溶解用pH7.6 PB透析，除去CNS-。
(17)、用HNO3、0.1N AgNO3檢測(cè)CNS-，直至透析除盡為止。
(18)、30000×g離心1h，棄沉淀。
(19)、測(cè)定干擾素效價(jià)及比活性，比活性≥1×105國(guó)際單位/mg蛋白為合格。
(20)、無(wú)菌分裝，-70℃保存。此即為禽白細(xì)胞干擾素實(shí)驗(yàn)室參比標(biāo)準(zhǔn)品。
權(quán)利要求
1.禽白細(xì)胞干擾素的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)、無(wú)菌采集禽的新鮮抗凝血、分離收集白細(xì)胞懸液；(2)、禽白細(xì)胞懸液中加入啟動(dòng)用粗純制禽白細(xì)胞干擾素進(jìn)行短時(shí)啟動(dòng)超誘導(dǎo)培養(yǎng)；(3)、加入誘導(dǎo)劑——雞新城疫病毒(NDV)及含有禽血清或血漿的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行誘生培養(yǎng)18-24小時(shí)；(4)、收集上清液，滅活雞新城疫病毒等，濾過(guò)除菌；(5)分裝好的禽白細(xì)胞干擾素粗制品，冷凍保存。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的禽白細(xì)胞干擾素的制備方法，其特征在于(1)、以800rpm～2500rpm離心裝有新鮮抗凝血瓶30min，收集血灰黃層，得到富含禽全血白細(xì)胞懸液，用已預(yù)溫的培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液濃度稀釋成1×107/ml細(xì)胞懸液；(2)、在已稀釋好的細(xì)胞懸液中加入少量粗純制禽白細(xì)胞干擾素，使其最終濃度為100單位/ml，置于37℃水浴搖床攪拌培養(yǎng)2小時(shí)；(3)、在啟動(dòng)后的禽白細(xì)胞懸液中加入NDV，使其最終濃度為100～150血凝單位/ml，并同時(shí)在白細(xì)胞懸液中加入原全血1～1.5倍體積量的含10％禽血清或禽血漿的RPMI 1640營(yíng)養(yǎng)液，加入終濃度為10μg/ml的卡那霉素，調(diào)懸液酸堿度至pH7.4，37℃搖床攪拌培養(yǎng)18～24小時(shí)；(4)、經(jīng)2000rpm～3000rpm離心30min，取上清液，加入6N HCl調(diào)至pH2.0，置4℃4～5天，每日振搖2～3次。再用6N NaOH調(diào)至pH7.2，即得到禽白細(xì)胞干擾素粗制品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽白細(xì)胞干擾素的制備方法，其特征在于對(duì)禽白細(xì)胞干擾素粗制品依下列步驟精制(1)、在粗制干擾素中加1/10量4℃預(yù)冷的5M KCNS，慢加攪拌，加完后用4℃預(yù)冷2N HCl調(diào)pH至3.5(慢加3ml/min)4℃過(guò)夜；(2)、棄去上清，取沉淀，4℃2000rpm 20min；(3)、棄上清，沉淀中加1/15量-20℃預(yù)冷95％酒精。先加少量酒精，組織勻漿器快檔研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl調(diào)至pH4.0；(4)、4℃2500rpm 20min，棄沉淀；(5)、上清用1N NaOH調(diào)至pH5.0～5.5；(6)、4℃2000rpm 20min，棄沉淀；(7)、上清用0.1N NaOH調(diào)至pH5.6；(8)、4℃2000rpm 20min離心，棄沉淀；(9)、上清用1N NaOH調(diào)至pH8.0；(10)、4℃2000rpm 20min離心，棄上清；(11)、沉淀物中加入原體積1/10～1/15量pH8.00.1M PB(含0.5MKCNS)；(12)、電磁攪拌過(guò)夜，使之充分溶解；(13)、4℃2000rpm 20min離心，棄沉淀；(14)、上清用2N HCl調(diào)至pH3.0；(15)、4℃2000rpm 20min離心，棄上清；(16)、沉淀物中加入1/100量pH8.00.1M PB溶解用pH7.6PB透析，除去CNS-；(17)、用HNO3、0.1N AgNO3檢測(cè)CNS-，直至透析除盡為止；(18)、3萬(wàn)g離心1h，棄沉淀；(19)、測(cè)定干擾素效價(jià)及比活性，比活性≥1×105國(guó)際單位/mg蛋白為合格；(20)、無(wú)菌分裝，-70℃保存，此即為禽白細(xì)胞干擾素實(shí)驗(yàn)室參比標(biāo)準(zhǔn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種禽白細(xì)胞干擾素的制備方法，使用雞新城疫病毒(NDV)作為誘生劑誘導(dǎo)健康禽白細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、滅活病毒、除菌、分離、純化等工藝，制成禽白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑。本發(fā)明成功利用了禽新鮮全血作為原料，制備工藝簡(jiǎn)便及經(jīng)凍干后易運(yùn)送和保藏，產(chǎn)品質(zhì)量可靠。禽白細(xì)胞干擾素注射禽機(jī)體后，具有療效好、安全可靠和無(wú)毒副作用等特點(diǎn)?？捎糜谥委熐萘鞲小⑿鲁且?、禽傳染性支氣管炎、小鵝瘟、鴨瘟等病毒性疾病。
文檔編號(hào)A61K38/21GK1712065SQ20051003833
公開日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2005年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月5日
發(fā)明者王明麗 申請(qǐng)人:王明麗