本發(fā)明屬于中藥制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種用于口服給藥來(lái)提高機(jī)體免疫力的多糖膽鹽脂質(zhì)體及其制備方法。
背景技術(shù)：
蟲草、黃精、黃芪、靈芝等補(bǔ)益類中藥具有固本培元、扶正祛邪之功效，能夠提高機(jī)體抗病能力。而某些食物如松花粉、海參等也具備這種增強(qiáng)體質(zhì)的作用。如松花粉被稱為“益壽粉”，食用歷史久遠(yuǎn)，有松花糕、松花酒等諸多傳統(tǒng)食品。松花粉始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，稱松花粉“氣味甘平無(wú)毒，久服輕身益氣延年”。海參不僅是珍貴的食品，也是名貴的藥材，《本草綱目拾遺》中記載“其性溫補(bǔ)，足敵人參”。
現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，上述中藥及食物提高機(jī)體免疫力的主要成分均為多糖，另外還相繼發(fā)現(xiàn)海藻等植物中的多糖也具有相同活性。從這些動(dòng)植物中提取到的多糖具有促進(jìn)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)的作用，從而提高機(jī)體免疫力，是一種廣譜免疫促進(jìn)劑。但是，多糖分子量太大，且具有強(qiáng)親水性，因此口服吸收困難，臨床應(yīng)用難以達(dá)到理想的藥理活性。
脂質(zhì)體是單層或多層磷脂雙分子層形成的封閉球形泡囊，是一種良好的藥物載體。在脂質(zhì)體膜中加入膽鹽形成的脂質(zhì)體為膽鹽脂質(zhì)體，最初主要用于增加藥物的透皮吸收，近幾年來(lái)在增加藥物的口服吸收方面受到重視。膽鹽脂質(zhì)體口服后既可抵抗胃腸道膽汁對(duì)脂質(zhì)體的破壞作用，又具有高度變形性，可透過(guò)比自身尺寸小數(shù)十倍的孔隙。因此，將多糖制成膽鹽脂質(zhì)體，利用其高度變形性和良好的生物相容性可增加多糖的口服吸收，起到提高機(jī)體免疫力的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種用于口服給藥的多糖膽鹽脂質(zhì)體及其制備方法，可促進(jìn)多糖的口服吸收，起到提高機(jī)體免疫力的作用。
本發(fā)明提供的一種口服給藥的多糖膽鹽脂質(zhì)體，藥物為蟲草多糖、海藻多糖、松花粉多糖、黃芪多糖、黃精多糖、靈芝多糖、海參多糖，或其混合物，輔料為磷脂、膽固醇和膽鹽。其中，磷脂為大豆磷脂（spc）、氫化大豆磷脂（hspc）、蛋黃卵磷脂（epc）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（dppc）、二油酰磷脂酰乙醇胺（dope）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（dspe）、磷脂酰乙醇胺（pe），或其混合物；膽鹽為膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛黃膽酸鈉、甘氨膽酸鈉，或其混合物。
本發(fā)明提供的一種口服給藥的多糖膽鹽脂質(zhì)體，磷脂與膽鹽的摩爾比為2:1-10:1，磷脂與多糖的質(zhì)量比為5:1-50:1，磷脂與膽固醇的摩爾比為2:1-8:1。
本發(fā)明提供的一種口服給藥的多糖膽鹽脂質(zhì)體的制備工藝，包括以下步驟：
（1）采用逆向蒸發(fā)法制備多糖膽鹽脂質(zhì)體，取磷脂、膽固醇和膽鹽，溶于有機(jī)溶劑，脂質(zhì)濃度為5-50mg/ml，得有機(jī)相。所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮或混合物；
（2）將多糖溶解于0.01mph7.4磷酸鹽緩沖液，得水相；
（3）將水相注入有機(jī)相中，有機(jī)相和水相體積比3:1-5:1，冰水浴條件下脈沖超聲，形成穩(wěn)定的w/o型乳劑；
（4）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，液體形成粘稠膠質(zhì)狀。加入含1-5%甘露醇的ph6.8磷酸鹽緩沖液，繼續(xù)旋蒸至膠質(zhì)物分散于溶液中，得多糖膽鹽脂質(zhì)體懸液；
（5）將多糖膽鹽脂質(zhì)體懸液脈沖超聲1-5min，高壓勻質(zhì)機(jī)乳勻（壓力200-800bar，循環(huán)2-6次），經(jīng)0.45μm/0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，得到多糖膽鹽脂質(zhì)體溶液；
（6）溶液分裝于西林瓶，經(jīng)過(guò)-70℃預(yù)凍12h，然后壓力30pa、溫度-45℃冷凍干燥24h，25℃干燥8h，即得到多糖膽鹽脂質(zhì)體固體粉末。
將本發(fā)明制得的多糖膽鹽脂質(zhì)體固體粉末加入適宜輔料后，可制成顆粒劑、膠囊劑、片劑（包括口含片、口溶片、分散片、泡騰片、普通片、包衣片等）等口服給藥的劑型。
將本發(fā)明制得的多糖膽鹽脂質(zhì)體固體粉末制成口服劑型，加入的稀釋劑包括但不限于淀粉、預(yù)膠化淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、微晶纖維素等纖維素類、甘露醇等糖醇類、二水硫酸鈣等無(wú)機(jī)鹽類等。
將本發(fā)明制得的多糖膽鹽脂質(zhì)體固體粉末加工制成口服劑型，加入的粘合劑包括但不限于淀粉、預(yù)膠化淀粉、羥丙甲纖維素等纖維素類的衍生物、明膠、阿拉伯膠、聚維酮等。
將本發(fā)明制得的多糖膽鹽脂質(zhì)體固體粉末加工制成口服劑型，加入的崩解劑包括但不限于淀粉、l-hpc、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚維酮、泡騰崩解劑等。
將本發(fā)明制得的多糖膽鹽脂質(zhì)體固體粉末加工制成口服劑型，加入的潤(rùn)滑劑包括但不限于硬脂酸鎂、peg-6000、微粉硅膠、十二烷基硫酸鈉等。
本發(fā)明制得的多糖膽鹽脂質(zhì)體具備以下優(yōu)勢(shì)：多糖膽鹽脂質(zhì)體利用其高度變形性、良好的組織相容性等特點(diǎn)可促進(jìn)多糖的口服吸收；口服給藥后能夠減少膽汁對(duì)脂質(zhì)體的破壞作用，增加脂質(zhì)體在胃腸道中的穩(wěn)定性；制成多糖膽鹽脂質(zhì)體凍干粉能夠增加脂質(zhì)體的體外穩(wěn)定性，并便于制成口服給藥的固體劑型。
本發(fā)明制得的多糖膽鹽脂質(zhì)體通過(guò)口服給藥增加多糖的吸收，主要用于提高機(jī)體免疫力。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述：
實(shí)施例1：
（1）處方組成：大豆磷脂800mg、膽固醇100mg、脫氧膽酸鈉100mg、蟲草多糖80mg。
（2）制備：取大豆磷脂800mg、膽固醇100mg、脫氧膽酸鈉100mg，加入二氯甲烷100ml，溶解形成溶液。取80mg蟲草多糖，溶解于30mlph7.4磷酸鹽緩沖液，注入二氯甲烷溶液中，冰水浴脈沖超聲3min形成穩(wěn)定的w/o型乳劑。30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，液體形成粘稠膠質(zhì)狀。加入3%甘露醇的ph6.8磷酸鹽緩沖液20ml，繼續(xù)旋蒸30min，膠質(zhì)物分散于溶液中，得脂質(zhì)體懸液。將脂質(zhì)體懸液先脈沖超聲5min，然后經(jīng)高壓勻質(zhì)機(jī)乳勻（壓力200bar，循環(huán)3次），經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，得到脂質(zhì)體溶液。濾液分裝于西林瓶，經(jīng)過(guò)-70℃預(yù)凍12h，然后壓力30pa、-45℃冷凍干燥24h，25℃干燥8h，即得到蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體固體粉末。
（3）形態(tài)觀察：取20mg蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體固體粉末加ph6.8磷酸鹽緩沖液1ml，振搖水化，得到膽鹽脂質(zhì)體懸液。加適量磷酸鹽緩沖液稀釋，用2.0﹪的磷鎢酸染色，透射電鏡下觀察蟲草膽鹽脂質(zhì)體形態(tài)為類球形，大小均勻。
（4）粒度分布：用激光粒度分析儀測(cè)定蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體的平均粒徑為339nm，pdi=0.141。
（5）包封率測(cè)定：采用sephadexg-200型葡聚糖凝膠柱分離游離藥物和膽鹽脂質(zhì)體，苯酚硫酸法測(cè)定蟲草多糖含量，按照公式包封率%=（總多糖量-游離型多糖量）/總多糖量*100%計(jì)算包封率，蟲草多糖平均包封率為62.3%。
實(shí)施例2：
（1）處方組成：氫化大豆磷脂800mg、膽固醇100mg、脫氧膽酸鈉100mg、海藻多糖80mg。
（2）制備：取氫化大豆磷脂800mg、膽固醇100mg、脫氧膽酸鈉100mg，加入二氯甲烷100ml，溶解形成溶液。將80mg海藻多糖，溶解于25mlph7.4磷酸鹽緩沖液，注入二氯甲烷溶液中，冰水浴脈沖超聲3min形成穩(wěn)定的w/o型乳劑。30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，液體形成粘稠膠質(zhì)狀。加入3%甘露醇的ph6.8磷酸鹽緩沖液20ml，繼續(xù)旋蒸30min，膠質(zhì)物分散于溶液中，得到脂質(zhì)體懸液。將脂質(zhì)體懸液先脈沖超聲5min，然后經(jīng)高壓勻質(zhì)機(jī)乳勻（壓力200bar，循環(huán)3次），經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，得到脂質(zhì)體溶液。濾液分裝于西林瓶，經(jīng)過(guò)-70℃預(yù)凍12h，然后壓力30pa、-45℃冷凍干燥24h，25℃干燥8h，即得到海藻多糖膽鹽脂質(zhì)體固體粉末。
（3）透射電鏡下觀察海藻多糖膽鹽脂質(zhì)體形態(tài)為類球形，平均粒徑為307nm，pdi=0.133，海藻多糖平均包封率為56.1%。
實(shí)施例3：
（1）處方組成：大豆磷脂800mg、膽固醇100mg、甘氨膽酸鈉100mg、松花粉多糖100mg。
（2）制備：取大豆磷脂800mg、膽固醇100mg、甘氨膽酸鈉80mg，加入氯仿100ml，溶解形成溶液。取100mg松花粉多糖，溶解于30mlph7.4磷酸鹽緩沖液，注入氯仿溶液中，冰水浴脈沖超聲5min形成穩(wěn)定的w/o型乳劑。30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，液體形成粘稠膠質(zhì)狀。加入3.2%甘露醇的ph6.8磷酸鹽緩沖液25ml，繼續(xù)旋蒸30min，膠質(zhì)物分散于溶液中。脈沖超聲5min，高壓勻質(zhì)機(jī)乳勻（壓力200bar，循環(huán)3次），經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，得到脂質(zhì)體溶液。濾液分裝于西林瓶，經(jīng)過(guò)-70℃預(yù)凍12h，然后壓力30pa、-45℃冷凍干燥24h，25℃干燥8h，即得到松花粉多糖膽鹽脂質(zhì)體固體粉末。
（3）透射電鏡下觀察松花粉多糖膽鹽脂質(zhì)體形態(tài)為類球形，平均粒徑為296nm，pdi=0.127，松花粉多糖平均包封率為64.0%。
實(shí)施例4：
（1）處方組成：大豆磷脂800mg、膽固醇80mg、甘氨膽酸鈉80mg、蟲草多糖60mg。
（2）制備：取大豆磷脂800mg、膽固醇80mg、甘氨膽酸鈉80mg，加入氯仿100ml，溶解形成溶液。取60mg蟲草多糖，溶解于25mlph7.4磷酸鹽緩沖液，注入氯仿溶液中，冰水浴脈沖超聲3min形成穩(wěn)定的w/o型乳劑。30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，液體形成粘稠膠質(zhì)狀。加入3%甘露醇的ph6.8磷酸鹽緩沖液25ml，繼續(xù)旋蒸30min，膠質(zhì)物分散于溶液中。脈沖超聲5min，高壓勻質(zhì)機(jī)乳勻（壓力200bar，循環(huán)3次），經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，得到脂質(zhì)體復(fù)合物溶液。濾液分裝于西林瓶，經(jīng)過(guò)-70℃預(yù)凍12h，然后壓力30pa、-45℃冷凍干燥24h，25℃干燥8h，即得到脂質(zhì)體復(fù)合物固體粉末。
（3）透射電鏡下觀察蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體形態(tài)為類球形，平均粒徑為290nm，pdi=0.130，蟲草多糖平均包封率為71.5%。
實(shí)施例5：
（1）處方組成：氫化大豆磷脂800mg、膽固醇120mg、膽酸鈉80mg、蟲草多糖75mg。
（2）制備：取氫化大豆磷脂800mg、膽固醇120mg、膽酸鈉80mg，加入氯仿100ml，溶解形成溶液。取75mg蟲草多糖，溶解于30mlph7.4磷酸鹽緩沖液，注入氯仿溶液中，冰水浴脈沖超聲5min形成穩(wěn)定的w/o型乳劑。30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，液體形成粘稠膠質(zhì)狀。加入4%甘露醇的ph6.8磷酸鹽緩沖液25ml，繼續(xù)旋蒸30min，膠質(zhì)物分散于溶液中。脈沖超聲5min，高壓勻質(zhì)機(jī)乳勻（壓力200bar，循環(huán)3次），經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，得到脂質(zhì)體復(fù)合物溶液。濾液分裝于西林瓶，經(jīng)過(guò)-70℃預(yù)凍12h，然后壓力30pa、-45℃冷凍干燥24h，25℃干燥8h，即得到蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體固體粉末。
（3）透射電鏡下觀察蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體形態(tài)為類球形，平均粒徑為309nm，pdi=0.146，蟲草多糖平均包封率為67.7%。
實(shí)施例6：
以實(shí)施例1制得的的蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體為例，考察外壓作用下通過(guò)0.22μm微孔濾膜的性能，評(píng)價(jià)蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體的變形性。
在0.5mpa壓力下，5ml水通過(guò)0.22μm微孔濾膜的時(shí)間為t水，相同體積的蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體懸液通過(guò)時(shí)間為t脂質(zhì)體，按照公式p=t脂質(zhì)體/t水計(jì)算相對(duì)透過(guò)率，蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體的相對(duì)透過(guò)率達(dá)80.3%，說(shuō)明其具備良好變形能力。
實(shí)施例7：
以實(shí)施例1制得的蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體為例，考察蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體對(duì)免疫低下小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響，評(píng)價(jià)蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體口服給藥后的免疫調(diào)節(jié)作用。
動(dòng)物分組及給藥：取昆明種小鼠70只，隨機(jī)分為ns對(duì)照組、模型組、蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體低、中、高劑量組（劑量分別為100,200,400mg/kg）、蟲草多糖溶液組（400mg/kg）和蟲草多糖普通脂質(zhì)體組（400mg/kg），每組10只。腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液（100mg/kg）建立小鼠免疫低下模型。對(duì)照組和模型組用同體積磷酸鹽緩沖液灌胃，每天灌胃給藥，連續(xù)給藥10d。末次給藥的次日，稱重，處死，取胸腺和脾臟并稱重，計(jì)算胸腺/脾臟重量（mg）與體重（g）的比值即為胸腺指數(shù)/脾臟指數(shù)，結(jié)果見表1。
表1蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體對(duì)小胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響（
注：與ns對(duì)照組比較，a：p<0.01；與模型組比較，b：p<0.01
由表1可見，蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均高于ctx模型組，其中，中劑量和高劑量組與模型組有顯著性差異（p<0.01）。蟲草多糖溶液組與模型組的胸腺和脾臟指數(shù)無(wú)顯著性差異，說(shuō)明蟲草多糖口服后吸收較差，對(duì)免疫系統(tǒng)功能影響較小。蟲草多糖普通脂質(zhì)體組的胸腺和脾臟指數(shù)高于與同等劑量的多糖組，說(shuō)明脂質(zhì)體可促進(jìn)蟲草多糖的吸收，而與蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體組有顯著性差異，證明將蟲草多糖制成膽鹽脂質(zhì)體可顯著促進(jìn)蟲草多糖的吸收，提高免疫低下小鼠的免疫系統(tǒng)功能。
實(shí)施例8：
以實(shí)施例1制得的的蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體為例，考察蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體對(duì)免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響。
將實(shí)施例7中各組小鼠在無(wú)菌條件下分離脾臟，置于研缽中研磨，加生理鹽水混懸后過(guò)濾，濾液1000r/min離心5min，加入紅細(xì)胞裂解液，裂解10min。4℃離心棄去上清，用磷酸鹽緩沖液洗滌，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制成脾淋巴細(xì)胞懸液（5×106個(gè)/ml）。取100μl接種于96孔板，加入終濃度為5μg/ml的cona，于37℃5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。吸除上清，每孔分別加入prmi1640培養(yǎng)液90μl和cck8試劑10μl，繼續(xù)培養(yǎng)1h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的od值，依據(jù)刺激指數(shù)（si）=刺激孔o(hù)d值/對(duì)照孔o(hù)d值，結(jié)果見表2。
表2蟲草多糖膽鹽脂質(zhì)體對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響（
注：與ns對(duì)照組比較，a：p<0.05；與模型組比較，b：p<0.05
由表2可見，模型組脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于對(duì)照組（p<0.05）。中劑量和高劑量膽鹽脂質(zhì)體組脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)與模型組有顯著差異（p<0.05），證明將蟲草多糖制成膽鹽脂質(zhì)體可促進(jìn)蟲草多糖的吸收，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用，提高細(xì)胞免疫應(yīng)答。