本發(fā)明涉及海參廢棄物資源化利用領(lǐng)域，具體涉及從海參內(nèi)臟中提取海參肽和海參多糖的方法。

背景技術(shù)：

海參(seacucumber)為棘皮動(dòng)物門(mén)(echinodermata)海參綱(holothurioider)動(dòng)物的總稱(chēng)，是重要的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，全世界約有1100多種，我國(guó)海域約有140余種，海參同人參、燕窩、魚(yú)翅齊名，被列為八大珍品之一。中醫(yī)認(rèn)為，海參性味甘、咸、溫，入心、腎精，有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)血潤(rùn)燥之功效。海參體內(nèi)含有海參多肽、海參多糖、脂肪、海參皂苷、維生素、腦苷脂等活性組分，具有延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗凝血等活性，具有較高的藥用價(jià)值和醫(yī)用價(jià)值。

一般人們食用的海參都是海參體壁，而非海參內(nèi)臟。在海參加工過(guò)程中，有大量的海參內(nèi)臟作為下腳料被遺棄，然而海參內(nèi)臟也含有豐富的蛋白質(zhì)和多糖及其他多種活性成分。研究表明，海參多糖是海參體內(nèi)最重要的活性物質(zhì)之一，且具有抗凝血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、降血脂等多種生物活性。lee等分別比較紅海參和灰海參內(nèi)臟中氨基酸的組成及含量，發(fā)現(xiàn)海參蛋白中含有17種氨基酸，8種必需氨基酸和9種非必需氨基酸，由此說(shuō)明海參內(nèi)臟可以為海參肽的制備提供優(yōu)質(zhì)的蛋白來(lái)源。

海參多肽具有良好的穩(wěn)定性及溶解性，食用安全，易消化吸收，且具有降血壓、抗疲勞、提高免疫力、抗氧化等多種生物活性。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，海參肽的生物活性與其分子量密切相關(guān)，房堃等將酶解得到的海參肽通過(guò)超濾進(jìn)行分離并研究其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)分子量在3000da以下及3000da以上的海參肽均具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子的活性，而3000da以下的海參肽具有更強(qiáng)的清除羥自由基活性，說(shuō)明不同分子量段的海參肽具有不同的生物活性。因此，從海參內(nèi)臟中提取活性組分，將大大提高海參的綜合開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，降低海參資源的浪費(fèi)，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

目前，國(guó)內(nèi)外專(zhuān)利對(duì)于海參內(nèi)臟的開(kāi)發(fā)均有所涉及。(1)專(zhuān)利ep20110840702公開(kāi)了一種海參復(fù)合制劑的制備方法，其效果好于單一制劑；(2)專(zhuān)利cn201210101836公開(kāi)了一種以海參內(nèi)臟為原料，采用生物酶解技術(shù)提取海參多糖、海參多肽的方法；(3)專(zhuān)利cn104137996a提供了一種海參內(nèi)臟的處理加工方法，制成低分子、高活性的海參肽粉，可應(yīng)用于食品及保健品領(lǐng)域；(4)專(zhuān)利cn104207088a公開(kāi)了一種海參內(nèi)臟蛋白制備海鮮調(diào)味品的方法，制得的產(chǎn)品具有獨(dú)特的鮮味和香氣，且富含必需氨基酸和活性多肽等營(yíng)養(yǎng)成分，易于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸；(5)專(zhuān)利cn105177095a公開(kāi)了一種高效制備海參抗氧化活性肽的方法，所得海參多肽的羥自由基清除能力和總還原力明顯高于目前廣泛使用的抗氧化劑。

目前，專(zhuān)利中未見(jiàn)以海參內(nèi)臟為原料，制備海參多糖和海參肽，同時(shí)實(shí)現(xiàn)海參多肽的分級(jí)分離的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理的從海參內(nèi)臟中同時(shí)提取海參肽和海參多糖的方法，充分利用海參加工時(shí)被丟棄的海參內(nèi)臟，減少對(duì)環(huán)境的污染，達(dá)到變廢為寶的目的。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，其技術(shù)方案如下列步驟所述：

一種海參內(nèi)臟制備海參肽和海參多糖的方法，包括如下步驟：

⑴預(yù)處理：將海參內(nèi)臟清洗后，進(jìn)行冷凍干燥，并進(jìn)行粉碎，采用篩網(wǎng)過(guò)濾得到海參內(nèi)臟粉；

⑵酶解：稱(chēng)取海參內(nèi)臟粉并配置成溶液，溶液中海參內(nèi)臟粉的質(zhì)量濃度為0.5-10.0％，溶液溫度25-55℃，加酶量10-100u/mg，調(diào)節(jié)溶液的ph為6.5-8.5，進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間5.0-10h；

⑶滅酶：滅酶溫度在85-95℃，滅酶時(shí)間5-20min，滅酶后冷卻至室溫；

⑷離心分離：將步驟(3)所得到的料液進(jìn)行離心分離，得到上清液和濾渣，取上清液進(jìn)行濃縮得到濃縮液；

⑸醇沉：將步驟(4)所得的濃縮液，按濃縮液與乙醇體積比為1:1-1:6配比加入乙醇進(jìn)行醇沉，靜置2-12h；

⑹離心分離：將步驟(5)所得的已分層的物料離心分離，所得沉淀物為海參粗多糖，上清液進(jìn)行濃縮和冷凍干燥，得到海參肽粗粉；

⑺納濾：將步驟(6)所得的海參肽粗粉按海參肽粗粉按1-2％的濃度溶解，采用截留分子量為100da的納濾膜進(jìn)行納濾，壓力為0.5-2.5mpa，收集濃縮液；

⑻超濾：將步驟(7)得到的濃縮液，采用截留分子量為2000da的超濾膜進(jìn)行超濾，壓力為1.5-2.5mpa，分別收集濃縮液和透過(guò)液，分別進(jìn)行冷凍干燥，分別得到海參多肽(分子量為2000-5000da)和寡肽(分子量<2000da)；

⑼除蛋白：將步驟(6)得到的海參粗多糖采用sevage法除蛋白，萃取后，取上層液體冷凍干燥得到海參多糖。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述步驟(1)冷凍干燥后的海參內(nèi)臟采用粉碎機(jī)粉碎，用90目篩網(wǎng)過(guò)濾。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述步驟(2)酶解時(shí)，采用復(fù)合酶進(jìn)行水解，采用蒸餾水調(diào)節(jié)海參內(nèi)臟粉的質(zhì)量濃度為0.5-10.0％。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述復(fù)合酶為中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶中的兩種或多種的混合物。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，各步驟中涉及的冷凍干燥中，制冷溫度-78℃，壓力為4-6pa，冷凍時(shí)間24-48h。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述步驟(7)納濾時(shí)進(jìn)料溫度為30℃。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述步驟(8)超濾時(shí)，進(jìn)料溫度為10-30℃。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述步驟(9)除蛋白時(shí)，采用sevage法除蛋白，sevage試劑中氯仿與正丁醇的體積比為4:1；sevage試劑與海參粗多糖溶液的體積比為1:4-1:6，萃取6-8次。

本發(fā)明涉及的技術(shù)方案具有以下優(yōu)點(diǎn)：

⑴采用酶法水解，將蛋白質(zhì)水解成小肽，打開(kāi)多糖與蛋白質(zhì)的糖肽鍵，因此，本發(fā)明可以通過(guò)酶解及醇沉同時(shí)得到海參肽及海參多糖。

⑵本發(fā)明采用復(fù)合酶進(jìn)行水解，其水解度能達(dá)到40-52％，海參多肽的收率在28％以上；經(jīng)超濾處理，透過(guò)液中分子量小于2000da的寡肽含量達(dá)到了70％以上。海參粗多糖經(jīng)除蛋白后，其提取率在16.56％-20.70％。

⑶海參肽采用膜分離技術(shù)進(jìn)行分級(jí)分離，從而得到不同分子量范圍的活性肽，有利于開(kāi)發(fā)出不同活性的功能肽產(chǎn)品。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。

實(shí)施例1：

⑴預(yù)處理：將海參內(nèi)臟清洗干凈，采用冷凍干燥技術(shù)凍干，溫度-80℃，壓力5pa。將凍干的海參內(nèi)臟粉碎，采用90目篩網(wǎng)過(guò)濾，得到海參內(nèi)臟粉。

⑵酶解：稱(chēng)取2g海參內(nèi)臟粉，加入100ml的蒸餾水，加入中性蛋白酶與菠蘿蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶水解，酶添加量均為12.5u/mg，調(diào)節(jié)ph至7.0，升溫至47℃，酶解時(shí)間為5h。

⑶滅酶：在90℃下滅酶，時(shí)間10min。

⑷離心分離：離心機(jī)轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間15min。采用三氯乙酸沉淀法測(cè)定其水解度，其水解度為48.90％。取上清液進(jìn)行減壓濃縮。

⑸醇沉：按濃縮液：乙醇(1:2，體積比)加入乙醇進(jìn)行醇沉，靜置12h。

⑹離心分離：離心機(jī)轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間10min。得到沉淀為粗多糖。取上清液濃縮，冷凍干燥，溫度-80℃，壓力5pa，得到粗海參肽，其收率為28.36％。

⑺納濾：取步驟(6)所得海參肽粗粉按底物((指海參肽粗粉))濃度2％溶解，采用截留分子量為100da的納濾膜進(jìn)行納濾，壓力為2.0mpa，收集濃縮液，此處的濃縮液為被納濾膜截留的溶液。

⑻超濾：將步驟(7)所述的濃縮液，采用截留分子量為2000da的超濾膜進(jìn)行超濾，壓力為2.0mpa，分別收集濃縮液和透過(guò)液，分別冷凍干燥，分別得到海參多肽和寡肽，此處的濃縮液為被超濾膜截留的溶液。

⑼將制得的海參多肽和寡肽進(jìn)行液相分析，液相條件如下：色譜柱：srtsec-100，φ7.8×300mm；流動(dòng)相:乙腈:水:三氟乙酸＝20:80:0.1(體積比)；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；流速：0.5ml/min。以細(xì)胞色素c(mw12500)，胰蛋白酶抑制劑(mw6511.44)，桿菌肽(mw1422.69)，val-tyr-val(mw379.5),gly-tyr(mw238.2)作為標(biāo)品。透過(guò)液中分子量小于2000da的寡肽含量為92％左右；而在濃縮液中，寡肽含量為54％左右，分子量為2000-5000da的多肽含量為45％左右。

⑽除蛋白：將步驟(6)得到的粗多糖用蒸餾水進(jìn)行溶解形成海參粗多糖溶液，采用sevage法除蛋白，sevage試劑中氯仿與正丁醇的體積比為4:1；sevage試劑與海參粗多糖溶液的體積比為1:4。萃取8次，取上層清液，冷凍干燥得到海參多糖，其提取率為17.56％。

實(shí)施例2：

⑴預(yù)處理：將海參內(nèi)臟清洗干凈，采用冷凍干燥技術(shù)凍干，溫度-80℃，壓力5pa。將凍干的海參內(nèi)臟粉碎，采用90目篩網(wǎng)過(guò)濾得到海參內(nèi)臟粉。

⑵酶解：稱(chēng)取15g海參內(nèi)臟粉，加入1500ml的蒸餾水，加入胰蛋白酶與堿性蛋白酶，添加量均為15u/mg，調(diào)節(jié)ph至8.2，升溫至40℃，水解6h。

⑶滅酶：滅酶溫度90℃，時(shí)間10min。

⑷離心分離：離心機(jī)轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間15min。采用三氯乙酸沉淀法測(cè)定其水解度，其水解度為49.16％。取上清液進(jìn)行減壓濃縮。

⑸醇沉：按濃縮液：乙醇(1:4，v/v)加入乙醇進(jìn)行醇沉，靜置12h。

⑹離心分離：轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間15min。得到沉淀為粗多糖。取上清液濃縮，冷凍干燥，溫度-80℃，壓力5pa，得到粗海參肽，其收率為30.73％。

⑺納濾：取步驟(6)所得海參肽粗粉按1.5％的底物(指海參內(nèi)臟粉)濃度溶解，采用截留分子量為100da的納濾膜進(jìn)行納濾，壓力為1.5mpa，收集濃縮液。

⑻超濾：將步驟(7)得到的濃縮液，采用截留分子量為2000da的超濾膜進(jìn)行超濾，壓力為2.0mpa，分別收集濃縮液和透過(guò)液，分別冷凍干燥，分別得到海參多肽和寡肽。

⑼將制得的海參多肽和寡肽進(jìn)行液相分析，液相條件如下：色譜柱：srtsec-100，φ7.8×300mm；流動(dòng)相：乙腈:水:三氟乙酸＝20:80:0.1(體積比)；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；流速：0.5ml/min。透過(guò)液中分子量小于2000da的寡肽含量為71％左右；而在濃縮液中，寡肽含量為50％左右，分子量為2000-5000da的多肽含量為49％左右。

⑽除蛋白：將步驟(6)得到的粗多糖用蒸餾水進(jìn)行溶解形成海參粗多糖溶液，采用sevage法除蛋白，sevage試劑中氯仿與正丁醇的體積比為4:1；sevage試劑與海參粗多糖溶液的體積比為1:6。萃取8次，取上層清液，冷凍干燥得到海參多糖，其提取率為20.70％。

實(shí)施例3：

⑴預(yù)處理：將海參內(nèi)臟清洗干凈，采用冷凍干燥技術(shù)凍干，溫度-80℃，壓力5pa。將凍干的海參內(nèi)臟粉碎，采用90目篩網(wǎng)過(guò)濾得到海參內(nèi)臟粉。

⑵酶解：稱(chēng)取10g海參內(nèi)臟粉，加入1000ml的蒸餾水，加入菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶與木瓜蛋白酶，添加量均為10u/mg，調(diào)節(jié)ph至6.7，升溫至53℃，水解8h。

⑶滅酶：滅酶溫度90℃，時(shí)間10min。

⑷離心分離：轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間15min。采用三氯乙酸沉淀法測(cè)定其水解度，其水解度為50.12％。取上清液進(jìn)行減壓濃縮。

⑸醇沉：按濃縮液：乙醇(1:4，v/v)加入乙醇進(jìn)行醇沉，靜置12h。

⑹離心分離：轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間15min。得到沉淀為粗多糖。取上清液濃縮，冷凍干燥，溫度-80℃，壓力5pa，得到粗海參肽，其收率為30.49％。

⑺納濾：取步驟(6)所得海參肽粗粉按2％的底物濃度溶解，采用截留分子量為100da的納濾膜進(jìn)行納濾，壓力為2.0mpa，收集濃縮液。

⑻超濾：將步驟(7)所述的濃縮液，采用截留分子量為2000da的超濾膜進(jìn)行超濾，壓力為2.0mpa，分別收集濃縮液和透過(guò)液，分別冷凍干燥，分別得到海參多肽和寡肽。

⑼將制得的海參多肽和寡肽進(jìn)行液相分析，液相條件如下：色譜柱：srtsec-100，φ7.8×300mm；流動(dòng)相：乙腈:水:三氟乙酸＝20:80:0.1(體積比)；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；流速：0.5ml/min。透過(guò)液中分子量小于2000da的寡肽含量為75％左右；而在濃縮液中，寡肽含量為48％左右，分子量為2000-5000da的多肽含量為51％左右。

⑽除蛋白：將步驟(6)得到的粗多糖用蒸餾水進(jìn)行溶解形成海參粗多糖溶液，采用sevage除蛋白，sevage試劑中氯仿與正丁醇的體積比為4:1；sevage試劑與海參粗多糖溶液的體積比為1:6。萃取8次，取上層清液，冷凍干燥得到海參多糖，其提取率為19.22％。