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雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的制備方法與流程

文檔序號:12615738閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種用LMH細胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法,其特征在于,包括以下步驟:

(1)傳代細胞系LMH細胞的制備:將LMH細胞用胰酶-EDTA消化液進行消化分散傳代,加入DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至形成生長良好的細胞單層,再用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗細胞3次,用于雞傳染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒接種;

(2)種毒繁殖:分別將雞傳染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒毒種按終體積為1:50~1:500接種到步驟(1)制備的單層細胞,并在37℃吸附30~60分鐘后吸棄病毒液,加入細胞維持液于37℃、5%CO2單獨培養(yǎng)58±2小時,直至細胞病變CPE達80%以上,分別收獲雞傳染性法氏囊細胞病毒液和禽腺病毒4型細胞病毒液;

(3)病毒收集、濃縮和純化:分別將收獲的雞傳染性法氏囊細胞病毒液和禽腺病毒4型細胞病毒液置于-20℃反復凍融兩次,5000rpm,4℃離心10min后收集上清液,然后分別使用50K中空纖維柱進行濃縮,即為雞傳染性法氏囊制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液;

(4)將上述兩種病毒的制苗病毒液進行滅活后,等體積混合,乳化制成乳劑型滅活疫苗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用LMH細胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法,其特征在于,所述步驟(1)中的DMEM培養(yǎng)液中含5~10%(v/v)新生牛血清、1.0~1.2%(v/v)雙抗和0.5~2.5%(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸,所述的雙抗為含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的鏈霉素溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用LMH細胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法,其特征在于,所述步驟(1)中胰酶-EDTA消化液為含有0.025%(m/v)的胰酶,0.02%(m/v)EDTA的Hank’s溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用LMH細胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法,其特征在于,所述步驟(2)的細胞維持液為包含有0.5~1.5%(v/v)新生牛血清、0.2~0.5%(m/v)谷氨酰胺、1.0~1.2%(v/v)雙抗、1~3%(v/v)脂質(zhì)體復合物和1~2%(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培養(yǎng)液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用LMH細胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法,其特征在于,所述的脂質(zhì)體復合物為內(nèi)部包含過氧化氫酶的復合物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用LMH細胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法,其特征在于,所述的脂質(zhì)體復合物的制備為:

(1)稱取0.2g磷脂酰膽堿、0.08g膽固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺,混合,溶于50mL乙醇,超聲處理5min;

(2)然后在28℃,0.1MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),除去乙醇,靜置30min,加入100mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液,在35℃水浴中振蕩水化反應(yīng)約1h,得脂質(zhì)體懸浮液;

(3)使用注射器式濾器調(diào)整脂質(zhì)體懸浮液的粒徑至150~200nm,得到內(nèi)部包含有過氧化氫酶的脂質(zhì)體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用LMH細胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法,其特征在于,所述步驟(2)中pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中含0.2~0.6%(m/v)過氧化氫酶。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用LMH細胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法,其特征在于,所述步驟(2)的細胞維持液還包含有0.05~0.2%(m/v)硫辛酸。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用LMH細胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法,其特征在于,所述步驟(4)中兩種病毒的制苗病毒液等體積混合后,使0.1ml水相中雞傳染性法氏囊含量≥108.0TCID50,禽腺病毒4型病毒含量≥108.2TCID50。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用LMH細胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法,其特征在于,所述步驟(4)將疫苗抗原乳化制成乳劑型滅活疫苗具體為:

(1)油相制備:取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份,硬脂酸鋁2份,司盤-80 4份,先將白油緩慢加溫,加入司盤-80和硬脂酸鋁,邊攪邊加溫,直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止,高壓滅菌備用;

(2)水相制備:取滅活后的雞傳染性法氏囊抗原和禽腺病毒4型各48份,加入滅菌后的吐溫-80 4份,開始攪拌,使吐溫-80完全溶解為止,制成水相;

(3)乳化:將水相加入到油相中,利用IKA乳化劑進行乳化,16000rpm,乳化5分鐘即可;

(4)分裝:將制備的疫苗按照每瓶250mL進行分裝。

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