本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法。
背景技術(shù)：
雞傳染性法氏囊病是呼腸弧病毒引起的一種雛雞急性、接觸性傳染病。由于該病發(fā)病突然、病程短、死亡率高，且可引起雞體免疫抑制，目前仍然是養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一?，F(xiàn)在市場上法氏囊病毒的免疫有活疫苗和滅活疫苗兩類疫苗。活疫苗毒力弱的免疫效果差，毒力較強(qiáng)的對法氏囊有傷害且影響免疫效果；滅活疫苗保留了完整的病毒結(jié)構(gòu)在不影響免疫效果的同時(shí)大大提高了安全性能。
禽I群腺病毒是家禽常見的感染病原體，呈世界性分布，目前發(fā)現(xiàn)所有年齡的家禽均易感，只是鑒于家禽的品種、年齡所形成的致病力不同。目前發(fā)現(xiàn)禽I群腺病毒對雞具有強(qiáng)致病性，主要病變表現(xiàn)為包涵體肝炎及心包積液-肝炎綜合征，該病可直接引發(fā)養(yǎng)雞場20～40天齡雞只出現(xiàn)30％以上的死亡率，此外其臨床上也常常與傳染性支氣管炎病毒，呼腸孤病毒，H9亞型禽流感病毒等并發(fā)感染，導(dǎo)致種蛋雞出現(xiàn)明顯呼吸道病，關(guān)節(jié)炎，及嚴(yán)重的產(chǎn)蛋下降及畸形蛋等問題。因此目前該病已經(jīng)成為嚴(yán)重影響?zhàn)B雞場生產(chǎn)性能的重大疫病之一。
禽I群腺病毒中的禽腺病毒4型(FAV-4)目前是世界上的研究熱點(diǎn)，其具備高致病性，可直接引發(fā)的心包積液-肝炎綜合征(或安卡拉病)，該病于1987年首發(fā)于巴基斯坦，在不到一年的時(shí)間內(nèi)殃及整個(gè)巴基斯坦肉雞養(yǎng)殖企業(yè)，之后在科威特、伊朗、前蘇聯(lián)，日本，中南美洲及墨西哥等地具有發(fā)生，甚至該病在鴿子也曾大面積爆發(fā)。目前已經(jīng)證明，禽I群腺病毒，特別是針對高致病性的FAV-4型可通過滅活疫苗進(jìn)行有效防控，其中巴基斯坦采取感染雞的肝臟勻漿制備的甲醛滅活疫苗防控心包積液-肝炎綜合征獲得了顯著成功。
現(xiàn)有技術(shù)對禽I群腺病毒滅活疫苗的制備多采用雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)、雞胚腎細(xì)胞(CEK)、雛雞腎細(xì)胞(CK)、雞胚肝細(xì)胞(CEL)4種原代細(xì)胞分離和增殖病毒。但原代肝腎細(xì)胞制備繁瑣、易污染、不易轉(zhuǎn)染，且在制備細(xì)胞過程中易混入CEF，不利于實(shí)驗(yàn)操作。
雞肝癌細(xì)胞系(LMH細(xì)胞系)是由一位日本學(xué)者在1981年所建立的。通過使用二乙基亞硝胺對雄性來航雞長期進(jìn)行誘導(dǎo)，導(dǎo)致雞體產(chǎn)生肝癌，再從肝癌組織中分離細(xì)胞而得到的。LMH呈典型上皮細(xì)胞特征，該細(xì)胞系保持了雞肝細(xì)胞分化的大量表型特征，主要用于重組腺病毒的構(gòu)建。公開號為CN 105420198 A的中國專利申請“雞肝癌細(xì)胞系作為鴨瘟病毒宿主的應(yīng)用”以雞肝癌細(xì)胞系作為鴨瘟病毒宿主，證明雞肝癌細(xì)胞系適用于病毒培養(yǎng)。
目前沒有利用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案為如下：
本發(fā)明提供一種用LMH細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的方法，其包括以下步驟：
(1)傳代細(xì)胞系LMH細(xì)胞的制備：將LMH細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液進(jìn)行消化分散傳代，加入DMEM培養(yǎng)液在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至形成生長良好的細(xì)胞單層，再用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞3次，用于雞傳染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒接種；
(2)種毒繁殖：分別將雞傳染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒毒種按終體積為1:50～1:500接種到步驟(1)制備的單層細(xì)胞，并在37℃吸附30～60分鐘后吸棄病毒液，加入細(xì)胞維持液于37℃、5％CO2單獨(dú)培養(yǎng)58±2小時(shí)，直至細(xì)胞病變CPE達(dá)80％以上，分別收獲雞傳染性法氏囊細(xì)胞病毒液和禽腺病毒4型細(xì)胞病毒液；
(3)病毒收集、濃縮和純化：分別將收獲的雞傳染性法氏囊細(xì)胞病毒液和禽腺病毒4型細(xì)胞病毒液置于-20℃反復(fù)凍融兩次，5000rpm，4℃離心10min后收集上清液，然后分別使用50K中空纖維柱進(jìn)行濃縮，即為雞傳染性法氏囊制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液；
(4)將上述兩種病毒的制苗病毒液進(jìn)行滅活后，等體積混合，乳化制成乳劑型滅活疫苗。
進(jìn)一步地，上述步驟(1)中的DMEM培養(yǎng)液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)雙抗和0.5～2.5％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸，所述的雙抗為含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的鏈霉素溶液。
進(jìn)一步地，上述步驟(1)中胰酶-EDTA消化液為含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。
進(jìn)一步地，上述步驟(2)的細(xì)胞維持液為包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2～0.5％(m/v)谷氨酰胺、1.0～1.2％(v/v)雙抗、1～3％(v/v)脂質(zhì)體復(fù)合物和1～2％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培養(yǎng)液，所述的雙抗為含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的鏈霉素溶液。
進(jìn)一步地，所述步驟(2)的細(xì)胞維持液還包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。
其中，上述的脂質(zhì)體復(fù)合物為內(nèi)部包含過氧化氫酶的復(fù)合物，所述的脂質(zhì)體復(fù)合物的制備包括以下步驟：
(1)稱取0.2g磷脂酰膽堿、0.08g膽固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超聲處理5min；
(2)然后在28℃，0.1MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙醇，靜置30min，加入100mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液，在35℃水浴中振蕩水化反應(yīng)約1h，得脂質(zhì)體懸浮液；
(3)使用注射器式濾器調(diào)整脂質(zhì)體懸浮液的粒徑至150～200nm，得到內(nèi)部包含有過氧化氫酶的脂質(zhì)體。
進(jìn)一步地，上述步驟(2)中pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中含0.2～0.6％(m/v)過氧化氫酶。
進(jìn)一步地，上述步驟(4)兩種病毒的制苗病毒液在進(jìn)行滅活前需進(jìn)行病毒含量測定，具體為：將制苗病毒液用DMEM培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 5個(gè)稀釋度接種48孔鋪滿單層LMH細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度重復(fù)5孔，同時(shí)設(shè)立陰性對照細(xì)胞孔；每孔0.1mL，37℃吸附30min后，補(bǔ)加細(xì)胞維持液0.3mL于37℃、5％CO2培養(yǎng)120小時(shí)，觀察細(xì)胞病變CPE，計(jì)算TCID50。
本發(fā)明用于制備法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗的兩種病毒的制苗病毒液的滴度必須滿足以下條件，具體為：步驟(4)中兩種病毒的制苗病毒液等體積混合后，使0.1ml水相中雞傳染性法氏囊含量≥108.0TCID50，禽腺病毒4型病毒含量≥108.2TCID50。
進(jìn)一步地，所述步驟(4)中病毒的滅活采用福爾馬林滅活，所述福爾馬林在制苗病毒液的終濃度為0.1％。
進(jìn)一步地，所述步驟(4)將疫苗抗原乳化制成乳劑型滅活疫苗具體為：
(1)油相制備：取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司盤-80 4份，先將白油緩慢加溫，加入司盤-80和硬脂酸鋁，邊攪邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌備用；
(2)水相制備：取滅活后的雞傳染性法氏囊抗原和禽腺病毒4型各48份，加入滅菌后的吐溫-80 4份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，制成水相；
(3)乳化：將水相加入到油相中，利用IKA乳化劑進(jìn)行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即可；
(4)分裝：將制備的疫苗按照每瓶250mL進(jìn)行分裝。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在LMH細(xì)胞單層分別進(jìn)行雞傳染性法氏囊、禽腺病毒4型毒種接毒后，加入常規(guī)的細(xì)胞維持液，LMH細(xì)胞很快出現(xiàn)死亡，導(dǎo)致最終制得的病毒疫苗效價(jià)較低。本發(fā)明人通過大量的試驗(yàn)和篩選對細(xì)胞維持液的配方進(jìn)行改進(jìn)，發(fā)現(xiàn)在低含量新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入一定量的過氧化氫酶脂質(zhì)體復(fù)合物和硫辛酸，可顯著改善LMH細(xì)胞的生長狀態(tài)，避免LMH細(xì)胞過早出現(xiàn)死亡，從而獲得較高病毒滴度的制苗病毒液。經(jīng)接毒后的細(xì)胞培養(yǎng)58±2小時(shí)得到的法氏囊病毒液和禽腺病毒4型病毒液中病毒的含量均可穩(wěn)定達(dá)到107.0-107.5/0.1mL，進(jìn)一步經(jīng)濃縮后，病毒的含量均高達(dá)108.0TCID50以上，取得了意料不到的技術(shù)效果。
此外，采用的LMH細(xì)胞背景清楚，無外源病原，易增殖性，非常適用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，符合未來疫苗生產(chǎn)趨勢，并且細(xì)胞活性高，半抗原高度澄清，容易進(jìn)行濃縮處理，非常適合進(jìn)行高抗原滴度的優(yōu)質(zhì)滅活疫苗生產(chǎn)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：
(1)采用LMH傳代細(xì)胞分別進(jìn)行雞傳染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒增殖，利用Reed-Muench方法測定兩者的TCID50，均可以穩(wěn)定達(dá)到107.0-107.5/0.1mL，病毒滴度是常規(guī)雞胚法及原代細(xì)胞法的10倍以上，如采用生物反應(yīng)器進(jìn)行病毒增殖，其病毒滴度屆時(shí)可以達(dá)到100倍水平，并且得到的抗原高度澄清，容易進(jìn)行濃縮處理，適合進(jìn)行高抗原滴度的優(yōu)質(zhì)滅活疫苗生產(chǎn)。
(2)本發(fā)明提供的二聯(lián)滅活疫苗免疫動(dòng)物后抗體產(chǎn)生快，效價(jià)高，降低了疫病的發(fā)生及蔓延，對雞傳染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒具有完全的免疫保護(hù)作用，且安全性良好，未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，穩(wěn)定有效，保護(hù)期長。
(3)本發(fā)明通過優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)液的配方，創(chuàng)造性地添加過氧化氫酶脂質(zhì)體復(fù)合物和硫辛酸，使分別進(jìn)行雞傳染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒接毒后的LMH細(xì)胞在低含量新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中仍能保持良好的生長狀態(tài)，避免細(xì)胞過早出現(xiàn)死亡，從而提高制毒疫苗的效價(jià)，并在較短的培養(yǎng)時(shí)間58±2小時(shí)，即可收獲滴度較高的病毒液，大大節(jié)約了生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。
具體實(shí)施方式
以下通過具體實(shí)施方式進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實(shí)施例。
實(shí)施例1脂質(zhì)體復(fù)合物的制備
(1)稱取0.2g磷脂酰膽堿、0.08g膽固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超聲處理5min；
(2)然后在28℃，0.1MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙醇，靜置30min，加入100mL pH為7.4含0.5％(m/v)過氧化氫酶的磷酸鹽緩沖溶液，在35℃水浴中振蕩水化反應(yīng)約1h，得脂質(zhì)體懸浮液；
(3)使用注射器式濾器調(diào)整脂質(zhì)體懸浮液的粒徑至150nm，得到內(nèi)部包含有過氧化氫酶的脂質(zhì)體。
實(shí)施例2雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的制備和病毒含量測定
(1)制苗病毒液的制備：
①傳代細(xì)胞系LMH細(xì)胞的制備：將LMH細(xì)胞用質(zhì)量體積比為0.025％的胰酶-0.02％的EDTA消化分散傳代，加入含10％(v/v)新生牛血清、1.0％(v/v)雙抗和2.0％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至形成生長良好的細(xì)胞單層，再用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞3次，用于雞傳染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型接種。
②種毒繁殖：分別將雞傳染性法氏囊毒種按終體積1:100接種到步驟①制備的細(xì)胞，將禽腺病毒4型毒種按終體積1:200接種到步驟①制備的細(xì)胞，并在37℃吸附35分鐘后吸棄病毒液，加入含有1.0％(v/v)新生牛血清、0.4％(m/v)谷氨酰胺、1.0％(v/v)雙抗、2.5％(v/v)脂質(zhì)體復(fù)合物、0.15％(m/v)硫辛酸和2％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5％CO2單獨(dú)培養(yǎng)60小時(shí)，直至細(xì)胞病變CPE達(dá)80％以上，分別收獲雞傳染性法氏囊細(xì)胞病毒液和禽腺病毒4型細(xì)胞病毒液。
③病毒收集、濃縮和純化：分別將收獲的雞傳染性法氏囊細(xì)胞病毒液和禽腺病毒4型細(xì)胞病毒液置于-20℃反復(fù)凍融兩次，5000rpm，4℃離心10min后收集上清液，然后分別使用50K中空纖維柱進(jìn)行濃縮，即為雞傳染性法氏囊制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液。
(2)病毒含量測定
分別將雞傳染性法氏囊制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液用DMEM培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 5個(gè)稀釋度接種48孔鋪滿單層LMH細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度重復(fù)5孔，同時(shí)設(shè)立陰性對照細(xì)胞孔；每孔0.1mL，37℃吸附30min后，補(bǔ)加細(xì)胞維持液0.3mL于37℃、5％CO2培養(yǎng)120小時(shí)，觀察細(xì)胞病變CPE，計(jì)算TCID50。
實(shí)施例3雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的滅活及滅活檢驗(yàn)
(1)雞傳染性法氏囊/禽腺病毒4型的滅活：將病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，加入福爾馬林溶液，充分混合，福爾馬林溶液的最終濃度為0.1％，37℃滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37℃開始計(jì)時(shí))后取出，置6℃保存，應(yīng)不超過1個(gè)月。
(2)雞傳染性法氏囊/禽腺病毒4型病毒滅活檢驗(yàn)：取滅活檢驗(yàn)的樣品，用DMEM營養(yǎng)液以10-1、10-2、10-3三個(gè)比例稀釋待檢樣品，同時(shí)設(shè)立同樣稀釋比例的滅活前病毒樣品用于陽性對照，分別接種于48孔LMH細(xì)胞單層細(xì)胞，每組重復(fù)接種5孔，每孔0.4mL 37℃、5％CO2培養(yǎng)96小時(shí)。滅活樣品各組稀釋度孔中均沒有出現(xiàn)細(xì)胞病變，陽性對照組各稀釋度孔中細(xì)胞病變均明顯，達(dá)80％以上，判定為滅活檢驗(yàn)合格。
實(shí)施例4二聯(lián)滅活疫苗的配制
本發(fā)明可用于配制二聯(lián)滅活疫苗的條件為：每0.1mL雞傳染性法氏囊病毒含量≥108.0TCID50，每0.1mL禽腺病毒4型病毒含量≥108.2TCID50可用于制備疫苗，所述二聯(lián)滅活疫苗的制備具體為：
(1)油相制備：取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司盤-80 4份，先將白油緩慢加溫，加入司盤-80和硬脂酸鋁，邊攪邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌備用；
(2)水相制備：取實(shí)施例2制得的滅活后的雞傳染性法氏囊抗原和禽腺病毒4型各48份，加入滅菌后的吐溫-80 4份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，制成水相；
(3)乳化：將水相加入到油相中，利用IKA乳化劑進(jìn)行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即可；
(4)分裝：將制備的疫苗按照每瓶250mL進(jìn)行分裝。
對比例1、2、3雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的制備和病毒含量測定
對比例1雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的制備步驟與實(shí)施例2基本相同，區(qū)別在于，所述的步驟(2)種毒繁殖中，LMH細(xì)胞接入毒種后，加入的細(xì)胞維持液含有過氧化氫酶，而不是過氧化氫酶脂質(zhì)體，即將過氧化氫酶直接加入到細(xì)胞維持液中。
對比例2雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的制備步驟與實(shí)施例2基本相同，區(qū)別在于，所述的步驟(2)種毒繁殖中，LMH細(xì)胞接入毒種后，加入的細(xì)胞維持液不含過氧化氫酶脂質(zhì)體。
對比例3雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的制備步驟與實(shí)施例2基本相同，區(qū)別在于，所述的步驟(2)種毒繁殖中，LMH細(xì)胞接入毒種后，加入的細(xì)胞維持液不含硫辛酸。
并觀察按對比例1-3所述的方法制備雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液，不同時(shí)間收獲的病毒液TCID50，并與實(shí)施例2的方法制備雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液比較，見下表1和2。
表1不同時(shí)間收獲的雞傳染性法氏囊病毒液TCID50
表2不同時(shí)間收獲的禽腺病毒4型病毒液TCID50
由對比例1可知，將過氧化氫酶直接加入到細(xì)胞維持液中，LMH細(xì)胞在較短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)病變，培養(yǎng)36h后，雞傳染性法氏囊CPE比例達(dá)到60％，48h后達(dá)到90％，而禽腺病毒4型CPE比例達(dá)到65％，48h后達(dá)到95％，兩者的病毒含量遠(yuǎn)低于實(shí)施例2制得病毒液中病毒的含量。由對比例2可知，細(xì)胞維持液中不含過氧化氫酶脂質(zhì)體，LMH細(xì)胞在最短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)病變，培養(yǎng)36h后，雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型CPE均達(dá)到85％，兩者收獲病毒液的病毒的含量最低。由對比例3可知，細(xì)胞維持液中不含硫辛酸，LMH細(xì)胞出現(xiàn)病變的時(shí)間與對比例1相當(dāng)，培養(yǎng)36h后，雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型CPE均達(dá)到60％，48h均達(dá)到85％，兩者的病毒含量遠(yuǎn)低于實(shí)施例2制得病毒液中病毒的含量。以上結(jié)果表明在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入過氧化氫酶脂質(zhì)體和硫辛酸可顯著改善LMH細(xì)胞接毒后的生長狀態(tài)，延緩其出現(xiàn)細(xì)胞病變，提高病毒疫苗的效價(jià)。
實(shí)施例5二聯(lián)滅活疫苗成品檢驗(yàn)
(1)性狀
①外觀：為乳白色乳劑。
②劑型：油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不擴(kuò)散。
③穩(wěn)定性：吸取疫苗10毫升加入離心管中，以3000rpm離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)≤0.5mL。
④粘度：用出口內(nèi)徑為1.2mm的1.0mL吸管，吸取25℃左右1.0mL，令其垂直自然流出，記錄流出0.4mL所需的時(shí)間，應(yīng)不超過8秒。
(2)無菌檢驗(yàn)：取成品接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基小管和酪胨瓊脂各兩支，每支0.2mL，一支置37℃培養(yǎng)，一支置25℃培養(yǎng)，觀察3～5日，應(yīng)純粹，無菌生長。
(3)安全檢驗(yàn)：用7日齡SPF雞10只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗1mL，觀察14日，結(jié)果試驗(yàn)雞均健活，無任何局部和全身不良反應(yīng)。
(4)甲醛含量測定：
①對照品溶液的制備：取已標(biāo)定的甲醛溶液適量，配成每1.0mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0mL置50mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。
②被測樣本的制備：用5.0mL刻度吸管量取被檢品5.0mL，置50mL量瓶中，用20％吐溫-80乙醇溶液10mL，分次洗滌吸管，洗液并入50mL量瓶中，搖勻，加水稀釋至刻度，強(qiáng)烈振搖，靜止分層，下層液如果不澄清，濾過，棄去初濾液，取澄清續(xù)濾液，即得。
③測定法：精密吸取對照品溶液和被檢品溶液各0.5mL，分別加醋酸-醋酸銨緩沖液10mL，乙酰丙酮試液10mL，置60℃恒溫水浴15分鐘，冷水冷卻5分鐘，放置20分鐘后，按紫外-可見分光光度計(jì)法，在410nm的波長處測定吸收度，計(jì)算即得。甲醛含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)，即檢驗(yàn)合格。
(5)裝量檢查：取供試品3個(gè)，使之恢復(fù)至室溫，開啟時(shí)注意避免損失。參照裝量檢查使用量取參考表，用經(jīng)標(biāo)化的吸管、注射器或量筒進(jìn)行裝量檢查。
實(shí)施例6疫苗效力試驗(yàn)
取21日齡SPF雞70只，將四批雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗分別以0.3mL/只胸肌注射，每批滅活疫苗15只SPF雞，剩余10只作為對照組只注射生理鹽水。免疫后7、14、21、28、35、42、49天，連同對照組分別采血，測定其雞傳染性法氏囊中和抗體效價(jià)和21天、35天和49天禽腺病毒4型血清中和抗體效價(jià)，結(jié)果見下表3-4。
表3免疫后不同時(shí)間雞傳染性法氏囊抗體水平
表4免疫后不同時(shí)間禽腺病毒4型抗體水平
結(jié)果表明，采用本發(fā)明的LMH細(xì)胞載體能培養(yǎng)出高病毒滴度的雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型；從SPF雞的免疫效力試驗(yàn)可知，采用本發(fā)明生產(chǎn)的雞傳染性法氏囊和禽腺病毒4型二聯(lián)滅活疫苗免疫SPF雞不僅能產(chǎn)生高水平雞傳染性法氏囊中和抗體而且還能產(chǎn)生高水平的禽腺病毒4型中和抗體，本發(fā)明提供的二聯(lián)滅活疫苗效力較佳。
以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。