本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種針對(duì)PCSK9的抗高血脂蛋白疫苗。

背景技術(shù)：

心血管疾病是影響人類健康的一項(xiàng)重大疾病，每年大約有30％的人死于心血管疾病，WHO 2014年調(diào)查結(jié)果顯示心血管疾病是全球的首要致死原因。高膽固醇血癥與冠心病的發(fā)生有密切的聯(lián)系，其主要表現(xiàn)為血漿低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的增加。高血脂的傳統(tǒng)治療藥物主要是他汀類藥物，但他汀類藥物具有較大的毒副作用，很多患者對(duì)他汀藥物不耐受。

前蛋白轉(zhuǎn)換酶枯草溶菌素9(PCSK9)是新發(fā)現(xiàn)的治療高血脂的新靶點(diǎn)，其致病機(jī)制是：PCSK9的催化域與低密度脂蛋白受體(LDLR)的EGF-A域結(jié)合，阻斷LDLR運(yùn)輸?shù)兔芏戎鞍啄懝檀?LDL-C)的功能，且PCSK9-LDLR復(fù)合物將LDLR運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)，使LDLR降解，而PCSK9從復(fù)合物中分離并重新利用，從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)LDLR水平降低，LDL-C水平上升，引發(fā)高血脂癥。此外，PCSK9的C末端雖然不直接與LDLR結(jié)合，但其可影響PCSK9與LDLR的結(jié)合，從而間接的影響LDLR的功能。圖1為PCSK9的晶體結(jié)構(gòu)及與LDLR的作用位點(diǎn)。近年來(lái)已有多個(gè)靶向PCSK9的單克隆抗體進(jìn)入臨床研究階段，2015年7月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了安進(jìn)的PCSK9抑制劑evolocumab單克隆抗體和賽諾菲與再生元制藥的alirocumab單克隆抗體上市，這標(biāo)志著以PCSK9為靶點(diǎn)的藥物進(jìn)入了新紀(jì)元，開始挑戰(zhàn)他汀類藥物作為治療高血脂傳統(tǒng)藥物的霸位，進(jìn)一步說(shuō)明了PCSK9作為治療高血脂新靶點(diǎn)的可行性和廣闊情景。

抗PCSK9單克隆抗體的作用機(jī)制是在體內(nèi)直接與PCSK9結(jié)合，中和PCSK9的生物學(xué)作用。目前上市和進(jìn)入臨床研究階段的PCSK9單克隆抗體都是通過(guò)封閉PCSK9與LDLR的EGF-A的結(jié)合區(qū)域，即完全封閉PCSK9的功能。但完全抑制PCSK9，將會(huì)導(dǎo)致肝再生能力的下降，因此限制了其對(duì)于肝損傷病人的應(yīng)用。此外單克隆抗體采用真核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)量較低，純化工藝復(fù)雜，成本較高，且作用時(shí)間短，需反復(fù)注射，可能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗抗體而對(duì)藥物耐受。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的是提供一種治療高血脂的新型蛋白疫苗，為治療高血脂提供一種新的有效選擇。

本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供了一種針對(duì)PCSK9的抗高血脂的蛋白疫苗。該疫苗是以PCSK9蛋白催化域片段多肽為主要活性成分。

其中，上述疫苗中的PCSK9蛋白催化域片段多肽的氨基酸序列為SEQ No.1所示。

進(jìn)一步的，上述蛋白疫苗還含有PCSK9的C末端片段多肽為活性成分。

其中，上述疫苗中的PCSK9的C末端片段多肽的氨基酸序列為SEQ No.2所示。

其中，上述疫苗中所述的PCSK9的C末端片段多肽和PCSK9蛋白催化域片段多肽可位于同一包裝中或分別位于獨(dú)立包裝中。

其中，上述疫苗中所述的PCSK9的C末端片段多肽和PCSK9蛋白催化域片段多肽的配比為1︰0.01～100。

進(jìn)一步的，上述疫苗中所述的PCSK9的C末端片段多肽和PCSK9蛋白催化域片段多肽的配比為1︰0.1～10。

更進(jìn)一步的，上述疫苗中所述的PCSK9的C末端片段多肽和PCSK9蛋白催化域片段多肽的配比為1︰0.5～5。

其中，上述疫苗中還含有免疫佐劑。所述的免疫佐劑可為氫氧化鋁佐劑、CpG佐劑或脂質(zhì)體佐劑等本領(lǐng)域常用的免疫佐劑中的至少一種。

此外，本發(fā)明還提供了PCSK9蛋白的催化域多肽片段在制備抗高血脂疫苗中的用途。所述PCSK9蛋白催化域片段多肽的氨基酸序列為SEQ No.1所示。

同時(shí)，本發(fā)明還提供了PCSK9蛋白的C末端多肽片段在抗高血脂疫苗中的用途。所述PCSK9蛋白的C末端多肽片段的氨基酸序列為SEQ No.2所示。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明蛋白疫苗能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，中和PCSK9。本發(fā)明的PCSK9蛋白疫苗治療劑量低，作用時(shí)間持久，無(wú)需反復(fù)注射，可以避免單克隆抗體可能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗抗體而對(duì)藥物耐受和成本高的缺點(diǎn)。本發(fā)明PCSK9疫苗無(wú)PCSK9的生物學(xué)活性，在體內(nèi)不會(huì)與LDLR結(jié)合，避免LDLR被降解。本發(fā)明疫苗可以有效的誘導(dǎo)特異性的免疫反應(yīng)，且產(chǎn)生靶向相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的中和抗體，能有效降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量，在作為高血脂治療性疫苗方面具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1、PCSK9的空間結(jié)構(gòu)以及與與LDLR的作用位點(diǎn)示意圖。

圖2、獲得小鼠催化域和C末端基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳電泳分析的結(jié)果。圖中序號(hào)說(shuō)明：M)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)——10000bp標(biāo)準(zhǔn)；1)催化域PCR產(chǎn)物；2)C末端PCR產(chǎn)物；箭頭顯示催化域和C末端PCSK9基因位置。

圖3、PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白的鑒定及菌株的篩選；(A)表示PCSK9-Ⅰ蛋白；(B)表示PCSK9-Ⅱ蛋白。

圖4、PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白純度的鑒定；

(A)考馬斯亮藍(lán)染色鑒定PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白；

(B)Western blot驗(yàn)證PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白。

圖5、rmPCSK9、PCSK9-I、PCSK9-II、PCSK9-I+PCSK9-II蛋白對(duì)LO2細(xì)胞LDLR和PCSK9的影響。

圖6、免疫后小鼠血清中抗PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白抗體滴度；(A)小鼠血清中抗PCSK9-Ⅰ蛋白抗體滴度；(B)小鼠血清中抗PCSK9-Ⅱ蛋白抗體滴度。

圖7、免疫后小鼠血清中抗體特異性鑒定；圖中序號(hào)說(shuō)明：M)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)—170KD標(biāo)準(zhǔn)；1)PCSK9-Ⅰ蛋白疫苗血清抗rmPCSK9蛋白；2)PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗血清抗rmPCSK9蛋白；3)PCSK9-Ⅰ+PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗血清抗rmPCSK9蛋白。

圖8、蛋白疫苗免疫后產(chǎn)生中和抗體，阻斷PCSK9與LDLR的結(jié)合；1泳道：Control，未進(jìn)行任何處理組；2泳道：rmPCSK9蛋白處理組；3泳道：PCS血清處理組；4泳道：PCSK9-Ⅰ蛋白疫苗血清組；5泳道：PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗血清組；6泳道：PCSK9-Ⅰ+PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗血清組。

圖9、蛋白疫苗免疫后小鼠血清血脂水平的變化情況。血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的變化；血清總膽固醇(TC)的變化；血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的變化；血清甘油三酯(TG)的變化。

具體實(shí)施方式

目前靶向PCSK9的單克隆抗體有2個(gè)已經(jīng)上市，抗PCSK9單克隆抗體的作用機(jī)制是在體內(nèi)直接與PCSK9結(jié)合，中和PCSK9的生物學(xué)作用。目前上市和進(jìn)入臨床研究階段的PCSK9單克隆抗體都是通過(guò)封閉PCSK9與LDLR的EGF-A的結(jié)合區(qū)域，即完全封閉PCSK9的功能。但完全抑制PCSK9，將會(huì)導(dǎo)致肝再生能力的下降，因此限制了其對(duì)于肝損傷病人的應(yīng)用。此外單克隆抗體采用真核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)量較低，純化工藝復(fù)雜，成本較高，且作用時(shí)間短，需反復(fù)注射，可能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗抗體而對(duì)藥物耐受。

本發(fā)明從另一個(gè)思路，考慮疫苗可能通過(guò)主動(dòng)免疫，產(chǎn)生針對(duì)靶分子的中和抗體，可能會(huì)對(duì)肥胖起到預(yù)防和治療的目的；且疫苗與單克隆抗體相比，無(wú)需多次注射，即可達(dá)到治療目的，降低了成本，適用于更多的支付體系。因此，本發(fā)明考慮開發(fā)以PCSK9為靶點(diǎn)的治療性疫苗，考慮利用同源同種抗原不易產(chǎn)生免疫排斥，以及蛋白不同結(jié)構(gòu)域功能不同的性質(zhì)，制備靶向PCSK9催化域和C末端的結(jié)構(gòu)域蛋白疫苗，通過(guò)注射PCSK9不同結(jié)構(gòu)域的多肽片段作為疫苗，產(chǎn)生靶向PCSK9不同結(jié)構(gòu)域的抗體而中和機(jī)體自身的PCSK9，阻斷PCSK9的生物學(xué)功能。

本發(fā)明設(shè)計(jì)并制備了靶向PCSK9不同結(jié)構(gòu)域的蛋白疫苗，包括靶向PCSK9催化域的蛋白疫苗PCSK9-Ⅰ和靶向PCSK9C末端的蛋白疫苗PCSK9-Ⅱ。

同種不同結(jié)構(gòu)域的PCSK9蛋白疫苗主要特點(diǎn)是：它由來(lái)源于免疫對(duì)象的同一種屬的PCSK9蛋白的不同結(jié)構(gòu)域組成，利用同一種屬的蛋白不易發(fā)生免疫排斥，可以避免免疫排斥反應(yīng)；利用PCSK9蛋白不同結(jié)構(gòu)域的功能不同，使機(jī)體產(chǎn)生靶向PCSK9不同結(jié)構(gòu)域的中和抗體，從而達(dá)到治療疾病的目的，并且避免個(gè)體對(duì)完全阻斷PCSK9的不耐受。例如制備靶向小鼠PCSK9催化域和C末端的蛋白疫苗，靶向催化域的PCSK9-Ⅰ蛋白疫苗來(lái)自小鼠PCSK9蛋白催化域，包含296個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為SEQ No.3所示；靶向C末端的PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗來(lái)自小鼠PCSK9蛋白C末端，包含242個(gè)氨基酸，氨基酸序列為SEQ No.3所示。而使用人的靶向催化域的PCSK9-Ⅰ蛋白疫苗來(lái)自人PCSK9蛋白催化域，其氨基酸序列為SEQ No.1所示；靶向C末端的PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗來(lái)自人PCSK9蛋白C末端，氨基酸序列為SEQ No.2所示。

同種不同結(jié)構(gòu)域的PCSK9蛋白疫苗制備方法是：利用cDNA序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成可溶型PCSK9-Ⅰ和PCSK9-ⅡcDNA片段，載入原核表達(dá)載體(如大腸桿菌的表達(dá)載體pET32a等)，測(cè)序鑒定后經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化，得到目的蛋白?？捎玫鞍滓呙缑庖咝∈螅瑱z測(cè)其免疫原性和治療效果。

本發(fā)明還提供了上述蛋白疫苗的用途及體內(nèi)治療效果和安全性評(píng)價(jià)，獲得了很好的結(jié)果

此外，本發(fā)明還提供了上述蛋白疫苗的制備方法。該方法包括如下步驟：

1.構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)域的PCSK9基因的載體

利用cDNA序列進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增PCSK9催化域和C末端的cDNA片段，并通過(guò)核酸內(nèi)切酶酶切和DNA連接酶連接構(gòu)建至表達(dá)載體(pET32a)上，分別記作pET32a-pcsk9-Ⅰ和pET32a-pcsk9-Ⅱ。

2.不同結(jié)構(gòu)域PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白的表達(dá)和純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，分別篩選出高表達(dá)PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白的菌株，重組蛋白蛋白主要以包涵體的形式存在，包涵體蛋白經(jīng)不同濃度的尿素洗滌后得到粗蛋白，進(jìn)一步通過(guò)復(fù)性和離子交換層析純化后得到相對(duì)較純的PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ重組蛋白，經(jīng)免疫印跡鑒定正確。

進(jìn)一步的對(duì)上述PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ重組蛋白進(jìn)行體外生物學(xué)活性檢測(cè)。良好的蛋白疫苗應(yīng)當(dāng)不具有生物學(xué)活性，不能直接與配體結(jié)合，影響配體的功能。

根據(jù)具體情況將上述獲得的蛋白制成疫苗，或者加入本領(lǐng)域常用的各種佐劑制成疫苗。PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ制成疫苗時(shí)，可以制作成在一個(gè)包裝內(nèi)的單一制劑，也可各自制成制劑，分別包裝，一起配合使用。

而實(shí)例中用不同濃度的PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ重組多肽(如2、4、6、8μg/ml)處理高表達(dá)PCSK9蛋白的人正常肝細(xì)胞LO2，檢測(cè)PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ重組蛋白對(duì)細(xì)胞LDLR表達(dá)水平的影響，檢測(cè)重組蛋白在體內(nèi)是否直接與LDLR作用，從而導(dǎo)致有害的介導(dǎo)LDLR的降解。結(jié)果表明PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ重組蛋白對(duì)細(xì)胞LDLR的表達(dá)水平無(wú)影響，

本發(fā)明的研究結(jié)果證實(shí)由同源同種的靶向PCSK9具體結(jié)構(gòu)域的抗體疫苗可以降低免疫排斥反應(yīng)；靶向具體結(jié)構(gòu)域的蛋白疫苗，可以避免完全阻斷PCSK9帶來(lái)的不耐受和毒副作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)上述實(shí)例，有足夠的理由相信在人身上使用人的PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ結(jié)構(gòu)域的蛋白疫苗也能起到同等的抗高血脂的作用。此外，常用的佐劑，如用氫氧化鋁或CpG為佐劑即可刺激免疫反應(yīng)產(chǎn)生中和抗體，達(dá)到降血脂的目的，降低了成本和濫用佐劑帶來(lái)的毒副作用。以下將結(jié)合實(shí)施例和附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案的進(jìn)一步說(shuō)明，并不表明本發(fā)明僅限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1 PCSK9不同結(jié)構(gòu)域基因的獲得和載體的構(gòu)建

圖2顯示了PCSK9催化域和C末端的核苷酸序列及相應(yīng)蛋白氨基酸序列。

以小鼠cDNA序列為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增催化域(pcsk9-Ⅰ)和C末端(pcsk9-Ⅱ)cDNA片段，并通過(guò)核酸內(nèi)切酶酶切和DNA連接酶連接構(gòu)建至表達(dá)載體(pET32a)上，分別記作pET32a-pcsk9-Ⅰ和pET32a-pcsk9-Ⅱ。

其中pET32a-pcsk9-Ⅰ載體的構(gòu)建如下：

以小鼠pcsk9的cDNA為模板，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物。

上游：GGGGTACCAGCATCCCATGGAACCTGGA(SEQ No.7)；下游：CGGTCA ATGGGTGCTGGGGGGC AGTG(SEQ No.8)。其中斜體部分為EK酶位點(diǎn)，下劃線部分為KpnI酶切位點(diǎn)，斜體部分為Xho I酶切位點(diǎn)。經(jīng)PCR反應(yīng)，得到片段的大小與預(yù)期相同(891bp左右)(圖2)。回收PCR產(chǎn)物片段后，插入載體pET32a(+)(購(gòu)于Novagen公司)中，通過(guò)Invitrogen公司測(cè)序后，結(jié)果顯示pET32a-pcsk9-Ⅰ的序列與小鼠催化域的序列(SEQ No.4)一致，證明pET32a-pcsk9-Ⅰ載體構(gòu)建成功。

pET32a-pcsk9-Ⅱ載體的構(gòu)建如下：

以小鼠pcsk9的cDNA為模板，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物。

上游：GGGGTACCGAGACAGGCGGGCAGCTGCT(SEQ No.9)；下游：CGGTCACTGAACCCAGGAGGCCT(SEQ No.10)；其中斜體部分為EK酶位點(diǎn)，下劃線部分為Bgl II酶切位點(diǎn)，斜體部分為Xho I酶切位點(diǎn))，經(jīng)PCR反應(yīng)，得到片段的大小與預(yù)期相同(729bp左右)(圖2)?；厥誔CR產(chǎn)物片段后，插入載體pET32a(+)(購(gòu)于Novagen公司)中，通過(guò)Invitrogen公司測(cè)序后，結(jié)果顯示pET32a-pcsk9-Ⅱ的序列與小鼠C末端的序列(SEQ No.6)一致，證明pET32a-pcsk9-Ⅱ載體構(gòu)建成功。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

本實(shí)施例通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增PCSK9催化域的DNA序列pcsk9-Ⅰ和PCSK9C末端的DNA序列pcsk9-Ⅱ；并成功的插入表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)成pET32a-pcsk9-Ⅰ和pET32a-pcsk9-Ⅱ重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

實(shí)施例2不同結(jié)構(gòu)域PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白的表達(dá)和純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)0.01M IPIG，25℃，220rpm誘導(dǎo)表達(dá)8h，篩選出高表達(dá)PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白的菌株，電泳結(jié)果表明得到的目的蛋白大小與預(yù)計(jì)的相似(圖3)。對(duì)重組蛋白進(jìn)行可溶性鑒定，主要以包涵體的形式存在。包涵體蛋白經(jīng)洗滌、復(fù)性和離子交換層析后得到相對(duì)較純的PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ重組蛋白，經(jīng)免疫印跡鑒定正確(圖4)，且產(chǎn)量可達(dá)1-2mg/ml。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達(dá)出PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ重組蛋白，經(jīng)鑒定以包涵體的形式存在。包涵體蛋白經(jīng)洗滌、復(fù)性和離子交換層析后純化PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ重組蛋白，并經(jīng)蛋白免疫印跡鑒定正確。

實(shí)施例3抗高血脂PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗活性檢測(cè)

以高表達(dá)PCSK9蛋白的人正常肝細(xì)胞LO2為靶細(xì)胞，檢測(cè)PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白的生物學(xué)活性。在高營(yíng)養(yǎng)(DMEM+10％FBS)的條件下培養(yǎng)LO2細(xì)胞密度至80％左右，將培養(yǎng)基更換為含10μM普伐他汀的低營(yíng)養(yǎng)(DMEM+5％FCS)條件下培養(yǎng)18h，誘導(dǎo)細(xì)胞LDLR的表達(dá)。18h后，將培養(yǎng)基更換為高營(yíng)養(yǎng)(DMEM+10％FBS)培養(yǎng)基，同時(shí)加入不同濃度的PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白(2、4、6、8μg/ml)，同時(shí)以6μg/ml商品化的rmPCSK9為陽(yáng)性對(duì)照，以不加蛋白的為空白對(duì)照，孵育8h后，Western blot檢測(cè)細(xì)胞裂解液中LDLR與PCSK9的水平，結(jié)果見(jiàn)圖5。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：rmPCSK9、PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白對(duì)細(xì)胞PCSK9的表達(dá)水平均無(wú)影響。用商品化的rmPCSK9處理LO2細(xì)胞后，細(xì)胞LDLR蛋白水平下降，且?guī)缀跬耆种萍?xì)胞LDLR的表達(dá)；而用自己經(jīng)大腸桿菌表達(dá)復(fù)性的PCSK9重組蛋白對(duì)LDLR的水平無(wú)影響，說(shuō)明其在體外無(wú)生物學(xué)活性。這種無(wú)生物學(xué)活性的蛋白疫苗可以避免PCSK9蛋白進(jìn)去體內(nèi)而發(fā)揮其生物學(xué)作用，與LDLR結(jié)合，從引發(fā)高血脂癥。

實(shí)施例4抗高血脂PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗打破免疫耐受，產(chǎn)生抗體

將6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組，PCSK9-Ⅰ蛋白免疫組、PCSK9-Ⅱ蛋白免疫組、PCSK9-Ⅰ+PCSK9-Ⅱ蛋白免疫組，每組7只。以Al(OH)₃作為佐劑，每只小鼠免疫100ug重組蛋白，500ug Al(OH)₃，其中PCSK9-Ⅰ+PCSK9-Ⅱ蛋白免疫組為50ugPCSK9-Ⅰ蛋白+50ug PCSK9-Ⅱ蛋白，用PBS將Al(OH)₃和重組蛋白混合物稀釋至200ul，充分混勻。小鼠腹股溝皮下多點(diǎn)免疫，兩周一次，共4次。在首次免疫前及每次免疫1周后經(jīng)小鼠眶內(nèi)靜脈叢取血，分離血清。通過(guò)ELISA檢測(cè)血清中抗PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白的抗體滴度，結(jié)果見(jiàn)圖6。

通過(guò)Western blot檢測(cè)小鼠血清抗體的特異性，以商品化純度較高的rmPCSK9蛋白(全長(zhǎng))為抗原，以PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗免疫小鼠后的抗血清為一抗，檢測(cè)抗血清能否與rmPCSK9蛋白(全長(zhǎng))結(jié)合，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖6表明，PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白均能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。PCSK9-Ⅰ蛋白疫苗產(chǎn)生抗PCSK9-Ⅰ蛋白的抗體，抗體中位數(shù)是2560000，而未產(chǎn)生抗PCSK9-Ⅱ蛋白的抗體。PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗產(chǎn)生抗PCSK9-Ⅱ蛋白的抗體，抗體中位數(shù)是1280000，未產(chǎn)生抗PCSK9-Ⅰ蛋白的抗體。而PCSK9-Ⅰ+PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗既產(chǎn)生抗PCSK9-Ⅰ蛋白的抗體，又產(chǎn)生抗PCSK9-Ⅱ蛋白的抗體，說(shuō)明本發(fā)明設(shè)計(jì)的不同結(jié)構(gòu)域PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗能夠靶向PCSK9蛋白不同結(jié)構(gòu)域。圖7表明PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗均能產(chǎn)生特異性的抗rmPCSK9蛋白(全長(zhǎng))的抗體。

實(shí)施例5抗高血脂PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗中和抗體檢測(cè)

以高表達(dá)PCSK9蛋白的人正常肝細(xì)胞LO2為靶細(xì)胞，研究蛋白疫苗免疫后能否產(chǎn)生中和PCSK9生物學(xué)功能的抗體。在高營(yíng)養(yǎng)(DMEM+10％FBS)的條件下培養(yǎng)LO2細(xì)胞密度至80％左右，將培養(yǎng)基更換為含10μM普伐他汀的低營(yíng)養(yǎng)(DMEM+5％CS)條件下培養(yǎng)18h，誘導(dǎo)細(xì)胞LDLR的表達(dá)。18h后，將培養(yǎng)基更換為高營(yíng)養(yǎng)(DMEM+10％FBS)培養(yǎng)基，同時(shí)加入rmPCSK9蛋白與抗血清的復(fù)合物(2ugrmPCSK9蛋白+20ul血清)，以只加rmPCSK9蛋白的為陰性對(duì)照，以不加蛋白的為空白對(duì)照。孵育LO2細(xì)胞24h后，Western blot檢測(cè)細(xì)胞裂解液中LDLR與PCSK9的水平，結(jié)果見(jiàn)圖8。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用rmPCSK9處理LO2細(xì)胞，LDLR水平明顯下降，與PBS組血清相比，PCSK9-Ⅰ蛋白疫苗免疫組、PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗免疫組和PCSK9+PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗免疫組LDLR水平均上升，其中PCSK9+PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗免疫組LDLR的水平顯著上升，比PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗單獨(dú)免疫組的LDLR水平明顯上升。而各組PCSK9水平無(wú)明顯變化。說(shuō)明蛋白疫苗免疫后血清中的抗體可以阻斷PCSK9與LDLR的結(jié)合，中和PCSK9的生物學(xué)功能。

實(shí)施例6抗高血脂PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗降低小鼠血清血脂水平

在前述模型第4次免疫小鼠2周后，小鼠眼眶靜脈叢取血(取血前禁食24h)，分離血清，用日立血生化儀檢測(cè)血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)水平的變化，結(jié)果見(jiàn)圖9。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗免疫小鼠后。與對(duì)照組(PBS)相比，PCSK9-Ⅰ免疫組、PCSK9-Ⅱ免疫組、PCSK9-Ⅰ+PCSK9-Ⅱ免疫組血清LDL-C的水平均顯著降低(P<0.05)，其中PCSK9-Ⅰ+PCSK9-Ⅱ免疫組血清LDL-C水平降低了67％。說(shuō)明同種不同結(jié)構(gòu)域PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗可顯著降低血清血脂水平，而且具有協(xié)同作用。其中，單獨(dú)使用靶向催化域或C末端的蛋白疫苗即可顯著降低血清LDL-C的水平，說(shuō)明對(duì)于部分肝損傷不能完全抑制PCSK9的病人，采用部分抑制PCSK9的功能的策略即可起到治療作用，避免了個(gè)體對(duì)完全阻斷PCSK9的不耐受。

PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠后，小鼠血清TC、TG、HDL-C均略微下降，但尚無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗主要是通過(guò)阻斷PCSK9與LDLR的結(jié)合，而調(diào)節(jié)血清LDL-C的變化。

實(shí)施例7抗高血脂PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)抗高血脂PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗體內(nèi)安全性，在實(shí)施例4的過(guò)程中每周稱量一次小鼠體重，觀察蛋白疫苗對(duì)小鼠體重的影響。同時(shí)，第4次免疫2周后處死小鼠，分離小鼠血清，對(duì)小鼠血清進(jìn)行血生化分析，主要檢測(cè)以下指標(biāo)：ALT、AST、TP、Glu、BUN、UA、LDH、ALB。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCSK9-Ⅰ和PCSK9-Ⅱ蛋白疫苗無(wú)明顯的毒副作用，對(duì)小鼠體重和ALT、AST、TP、Glu、BUN、UA、LDH、ALB等血生化指標(biāo)無(wú)明顯的影響，具有較好的體內(nèi)安全性。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大學(xué)

<120> 一種針對(duì)PCSK9的抗高血脂蛋白疫苗

<130> A161035KN

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 300

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人PCSK9催化域氨基酸序列

<400> 1

Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala

1 5 10 15

Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu

20 25 30

Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val

35 40 45

Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe

50 55 60

His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly

65 70 75 80

Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg

85 90 95

Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr

100 105 110

Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val

115 120 125

Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val

130 135 140

Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val

145 150 155 160

Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala

165 170 175

Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln

180 185 190

Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp

195 200 205

Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser

210 215 220

Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val

225 230 235 240

Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu

245 250 255

Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile

260 265 270

Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu

275 280 285

Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr His Gly Ala Gly

290 295 300

<210> 2

<211> 240

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人PCSK9 C末端氨基酸序列

<400> 2

Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His Ser Gly Pro Thr

1 5 10 15

Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp Glu Glu Leu Leu

20 25 30

Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg Gly Glu Arg Met

35 40 45

Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His Asn Ala Phe Gly

50 55 60

Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu Leu Pro Gln Ala

65 70 75 80

Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ser Met Gly Thr

85 90 95

Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr Gly Cys Ser Ser

100 105 110

His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro Pro Val Leu Arg

115 120 125

Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg Glu Ala Ser Ile

130 135 140

His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys Lys Val Lys Glu

145 150 155 160

His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val Ala Cys Glu Glu

165 170 175

Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly Thr Ser His Val

180 185 190

Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val Arg Ser Arg Asp

195 200 205

Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val Thr Ala Val Ala

210 215 220

Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln

225 230 235 240

<210> 3

<211> 297

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 小鼠PCSK9催化域氨基酸序列

<400> 3

Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Ile Pro Ala Trp His Gln Thr

1 5 10 15

Glu Glu Asp Arg Ser Pro Asp Gly Ser Ser Gln Val Glu Val Tyr Leu

20 25 30

Leu Asp Thr Ser Ile Gln Gly Ala His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val

35 40 45

Thr Ile Thr Asp Phe Asn Ser Val Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe

50 55 60

His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly

65 70 75 80

Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly Val Ala Lys Gly Thr Ser Leu His

85 90 95

Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr

100 105 110

Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg Lys Ser Gln Leu Ile Gln Pro Ser

115 120 125

Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Ile

130 135 140

Leu Asn Ala Ala Cys Arg His Leu Ala Arg Thr Gly Val Val Leu Val

145 150 155 160

Ala Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala

165 170 175

Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln

180 185 190

Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp

195 200 205

Leu Phe Ala Pro Gly Lys Asp Ile Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser

210 215 220

Thr Cys Phe Met Ser Gln Ser Gly Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val

225 230 235 240

Ala Gly Ile Val Ala Arg Met Leu Ser Arg Glu Pro Thr Leu Thr Leu

245 250 255

Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile His Phe Ser Thr Lys Asp Val Ile

260 265 270

Asn Met Ala Trp Phe Pro Glu Asp Gln Gln Val Leu Thr Pro Asn Leu

275 280 285

Val Ala Thr Leu Pro Pro Ser Thr His

290 295

<210> 4

<211> 891

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 小鼠PCSK9催化域編碼核苷酸序列

<400> 4

agcatcccat ggaacctgga gcgaattatc ccagcatggc accagacaga ggaagaccgc 60

tcccctgatg gaagcagcca ggtggaggtg tatctcttag ataccagcat ccagggtgcc 120

catcgggaga ttgagggcag ggtcaccatc accgacttca acagcgtgcc ggaggaggat 180

gggacacgct tccacagaca ggcgagcaag tgtgacagcc acggcaccca cctggcaggt 240

gtggtcagcg gccgggatgc tggtgtggcc aagggcacca gcctgcacag cctgcgtgtg 300

ctcaactgtc aagggaaggg cacagtcagc ggcaccctca taggcctgga gtttattcgg 360

aagagtcagc taatccagcc ctcggggcca ctcgtggttc tgctgcccct ggccggtggg 420

tatagccgca tcctcaacgc tgcctgccgg cacctggcga ggactggggt ggtgctggtt 480

gcagcagctg ggaacttccg ggacgacgcc tgcctctact ccccagcttc tgctccagag 540

gtcatcacag tcggggccac gaatgcccag gaccagccag ttaccttggg gactttgggg 600

actaattttg gacgctgtgt ggatctcttt gcccccggga aggacatcat cggagcgtcc 660

agtgactgca gcacatgctt catgtcacag agtgggacct cacaggctgc tgcccacgtg 720

gccggcattg tggctcggat gctgagccgg gagcccacac ttaccctggc cgagctgcgg 780

cagaggctga tccacttctc taccaaagac gtcatcaaca tggcctggtt ccctgaggac 840

cagcaggtgc tgacccccaa cctggtggcc acactgcccc ccagcaccca t 891

<210> 5

<211> 242

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 小鼠PCSK9C末端氨基酸序列

<400> 5

Glu Thr Gly Gly Gln Leu Leu Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His Ser

1 5 10 15

Gly Pro Thr Arg Thr Ala Thr Ala Thr Ala Arg Cys Ala Pro Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Arg Arg Arg Gly

35 40 45

Asp Trp Ile Glu Ala Ile Gly Gly Gln Gln Val Cys Lys Ala Leu Asn

50 55 60

Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Val Ala Arg Cys Cys Leu Val

65 70 75 80

Pro Arg Ala Asn Cys Ser Ile His Asn Thr Pro Ala Ala Arg Ala Gly

85 90 95

Leu Glu Thr His Val His Cys His Gln Lys Asp His Val Leu Thr Gly

100 105 110

Cys Ser Phe His Trp Glu Val Glu Asp Leu Ser Val Arg Arg Gln Pro

115 120 125

Ala Leu Arg Ser Arg Arg Gln Pro Gly Gln Cys Val Gly His Gln Ala

130 135 140

Ala Ser Val Tyr Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys Lys

145 150 155 160

Ile Lys Glu His Gly Ile Ser Gly Pro Ser Glu Gln Val Thr Val Ala

165 170 175

Cys Glu Ala Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Asn Val Leu Pro Gly Ala

180 185 190

Ser Leu Thr Leu Gly Ala Tyr Ser Val Asp Asn Leu Cys Val Ala Arg

195 200 205

Val His Asp Thr Ala Arg Ala Asp Arg Thr Ser Gly Glu Ala Thr Val

210 215 220

Ala Ala Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg Pro Ser Ala Lys Ala Ser Trp

225 230 235 240

Val Gln

<210> 6

<211> 729

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 小鼠PCSK9C末端編碼核苷酸序列

<400> 6

gagacaggcg ggcagctgct ctgtaggacg gtgtggtcgg cacactcggg gcccactcga 60

acagctacag ctacagcccg ctgtgcccca gaagaggagc tgctgagctg ctccagcttc 120

tccaggagcg ggaggcgtcg tggtgattgg attgaggcca taggaggcca gcaggtctgc 180

aaggccctca atgcatttgg gggtgagggt gtctatgccg tcgcgagatg ctgcctggtt 240

ccccgtgcca actgcagcat ccacaacacc cctgcagcca gagctggcct ggagacccat 300

gtccactgcc accagaagga ccatgttctc acaggctgca gcttccattg ggaagtggaa 360

gaccttagtg tccggaggca gcctgcgctg aggtccagac gtcagcctgg ccagtgcgtt 420

ggccaccagg cggccagtgt ctatgcttcc tgctgccatg ccccagggct ggaatgcaaa 480

atcaaggagc atgggatctc aggtccttca gagcaggtca ctgtggcctg cgaagcagga 540

tggaccctga ctggatgcaa tgtgctccct ggggcatccc tcactctggg agcctacagc 600

gtggacaacc tgtgtgtggc aagagtccat gacactgcca gagcagacag gaccagtgga 660

gaagccacag tagctgctgc catctgctgc cggagccggc cttcagcaaa ggcctcctgg 720

gttcagtga 729

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增小鼠PCSK9催化域上游引物

<400> 7

ggggtaccga cgacgacgac aagagcatcc catggaacct gga 43

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增小鼠PCSK9催化域下游引物

<400> 8

cggaattctc aatgggtgct ggggggcagt g 31

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增小鼠PCSK9C末端下游引物

<400> 9

ggggtaccga cgacgacgac aaggagacag gcgggcagct gct 43

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 擴(kuò)增小鼠PCSK9C末端下游引物

<400> 10

cggaattctc actgaaccca ggaggcct 28