本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種運(yùn)用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥阻斷膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者炎癥因子的新型藥物。
背景技術(shù)：
：膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷好發(fā)于中老年人和從事大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的人群，臨床表現(xiàn)主要是兩個(gè)方面：關(guān)節(jié)疼痛和運(yùn)動(dòng)功能障礙。目前，臨床治療效果不佳，主要是緩解患者的疼痛，改善膝關(guān)節(jié)功能，究其原因就是因?yàn)椴磺宄リP(guān)節(jié)炎軟骨損傷的發(fā)病機(jī)制。藥物治療主要是對(duì)癥治療，暫時(shí)緩解病人的痛苦，但長(zhǎng)期效果不佳，癥狀容易反復(fù)發(fā)作。藥物達(dá)到一定治療效果的同時(shí)還伴隨一些副作用。對(duì)于老年、晚期癥狀較重，保守治療效果不佳的患者則需要進(jìn)行人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，不僅手術(shù)費(fèi)用高，會(huì)給患者本人，家庭及社會(huì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，而且還需要進(jìn)行二次手術(shù)。因此，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥用于治療膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷給膝關(guān)節(jié)患者帶來(lái)新的希望。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖分化能力，免疫原性低，取材方便，無(wú)道德倫理問(wèn)題的限制，易于工業(yè)化制備。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠發(fā)育成硬骨、軟骨、脂肪和其他類(lèi)型的細(xì)胞，一旦注射入膝關(guān)節(jié)軟骨損傷患者的膝關(guān)節(jié)可以定向分化為軟骨細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體損傷軟骨的恢復(fù)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)方面具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展前景，可以治愈更多飽受病痛折磨的膝關(guān)節(jié)炎患者。超氧化物歧化酶能夠清除機(jī)體組織代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的有害物質(zhì)------過(guò)氧化物和氫氧根，這些代謝產(chǎn)物的堆積會(huì)造成機(jī)體組織出現(xiàn)損傷，軟骨發(fā)生破壞以及組織不斷纖維化。軟骨損傷會(huì)引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，超氧化物歧化酶可將炎癥過(guò)程中多形核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的花生四烯酸分解產(chǎn)物一過(guò)氧化物游離基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和氧，并加以清除，從而達(dá)到有效緩解乃至清除骨關(guān)節(jié)炎疼痛的目的。維生素D是一種脂溶性維生素，也被看作是一種作用于鈣、磷代謝的激素前體，能夠保護(hù)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)性病變的展延和降低其臨床癥狀。機(jī)體內(nèi)缺乏維生素D會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展、跌倒和骨折。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是彌補(bǔ)現(xiàn)有藥物治療手段的不足之處，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥具有阻斷膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者炎癥因子的活性，具有廣泛的應(yīng)用前景，可能成為臨床上治療膝關(guān)節(jié)炎的潛在治療藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種阻斷膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者炎癥因子的藥物，其特征在于：由以下組分組成，1X106細(xì)胞/ml臍血源神經(jīng)干細(xì)胞和20-60ng/ml環(huán)孢素A以及2-10ng/ml維生素B12。1X107細(xì)胞/ml臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和10-25ng/ml超氧化物歧化酶以及5-15ng/ml維生素D本發(fā)明由以下組分組成，1X107細(xì)胞/ml臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和15ng/ml超氧化物歧化酶以及8ng/ml維生素D。本發(fā)明由以下步驟組成，軟骨細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。待軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)到70-80%，用復(fù)合藥培養(yǎng)24h即可。DMEM培養(yǎng)基是dulbecco'smodifiedeaglemedium的縮寫(xiě)；DMEM的特性：(1)氨基酸含量為依格爾培養(yǎng)基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等;(2)維生素含量為依格爾培養(yǎng)基的4倍;(3)含有糖酵解途徑中的重要物質(zhì)------丙酮酸;(4)含有微量的鐵離子。膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者在關(guān)節(jié)腔注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥后，使用Lysholm膝關(guān)節(jié)功能評(píng)分進(jìn)行評(píng)估藥效，研究結(jié)果顯示注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥后可以明顯改善膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者的癥狀（表1）。治療前治療后58.62±5.67581.85±4.871使用VAS評(píng)估膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者的疼痛程度，研究結(jié)果顯示注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥后可以明顯改善膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者的疼痛程度（表2）。治療前治療后7.47±1.2722.79±1.099源于膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者的軟骨細(xì)胞是一種比較容易獲得的細(xì)胞類(lèi)型，采用酶消化法提取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥對(duì)膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者的軟骨細(xì)胞的促增殖研究，研究結(jié)果表明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥明顯增加膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者的軟骨細(xì)胞增殖效果（圖1）。實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞的炎癥因子MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13的基因表達(dá)情況（圖2）。ELIAS檢測(cè)膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞的炎癥因子MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13的蛋白表達(dá)情況（圖3）。由于MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的明膠酶，可以降解Ⅳ型膠原，例如：明膠，使用明膠酶譜法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞的MMP-2和MMP-9分解明膠的能力（圖4）。本發(fā)明的有益效果是尋找臨床上治療膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷的新方法。到目前為止，對(duì)于膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療只是對(duì)癥治療，不能根除病因，要想在臨床上尋找到治療膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷的辦法，就必須確定該疾病的發(fā)病機(jī)理，從而找到合適的分子作用靶點(diǎn)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥可以作為治療膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷的新形式。附圖說(shuō)明圖1是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥對(duì)于膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖的影響。數(shù)據(jù)代表±SEM。n=3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖2是實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥對(duì)于膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞的炎癥因子MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13基因表達(dá)情況。數(shù)據(jù)代表±SEM。n=3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3是ELISA檢測(cè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥對(duì)于膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞的炎癥因子MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13蛋白表達(dá)情況。數(shù)據(jù)代表±SEM。n=3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖4是明膠酶譜法分析臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥對(duì)于膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞的MMP-2和MMP-9分泌量情況。數(shù)據(jù)代表±SEM。n=3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。具體實(shí)施方式本發(fā)明1X107細(xì)胞/ml臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和15ng/ml超氧化物歧化酶以及8ng/ml維生素D復(fù)合藥（簡(jiǎn)寫(xiě)：復(fù)合藥）對(duì)膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞的修復(fù)研究。1.實(shí)驗(yàn)材料1.1細(xì)胞系根據(jù)相關(guān)的發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)，由某醫(yī)院康復(fù)科室診斷30名患者為膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷，其中：5男，25女。選擇30名年齡相仿的健康人作為對(duì)照組，其中：4男，26女。采用酶消化法分別從膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者和健康人中提取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。1.2儀器和試劑超凈工作臺(tái)（北京醫(yī)療設(shè)備廠，中國(guó)），C02培養(yǎng)箱（CB150，Binder，德國(guó)），臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（5804R，Eppendorf，德國(guó)），純凈水機(jī)（MILLI-Q，Millipore，美國(guó)），DMEM/F12培養(yǎng)基，青霉素、鏈霉素（華北制藥股份有限公司），胎牛血清（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8（同仁化學(xué)研究所），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Pierce，美國(guó)），1X107細(xì)胞/ml臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)室自制），超氧化物歧化酶和維生素D（Sigma公司，美國(guó)）。2實(shí)驗(yàn)方法2.1Lysholm膝關(guān)節(jié)功能評(píng)分對(duì)于膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者給予注射7ml復(fù)合藥至關(guān)節(jié)腔，三個(gè)月后觀察治療效果。2.2視覺(jué)模擬評(píng)分法(VAS)對(duì)于膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者給予注射7ml復(fù)合藥至關(guān)節(jié)腔，三個(gè)月后觀察治療效果。使用一條長(zhǎng)約10cm的游動(dòng)標(biāo)尺，一面標(biāo)有10個(gè)刻度，兩端分別為"0"分端和"10"分端，0分表示無(wú)痛，10分代表難以忍受的最劇烈的疼痛。2.3細(xì)胞培養(yǎng)軟骨細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。待軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)到70-80%，用復(fù)合藥培養(yǎng)24h。對(duì)照組不用復(fù)合藥處理。2.4增殖能力檢測(cè)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μl/孔），將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間（37℃，5%CO2）。向每孔加入10μlCCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。2.5RNA的提取和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)提取細(xì)胞的總RNA，取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為實(shí)時(shí)定量PCR的模板。所使用的引物序列如表1所示。2.6ELISA檢測(cè)使用ELISA試劑盒檢測(cè)MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13的蛋白含量。2.7明膠酶譜法（1）樣品制備收集細(xì)胞上清液，移入離心管中，2000rpm，離心10min，為了使上樣蛋白含量一致，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。（2）SDS-PAGE電泳配制電泳所需的分離膠和濃縮膠，4℃電泳，100V至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠的最底部，大約4h，停止電泳。（3）洗脫將凝膠置于洗脫液中，室溫，振蕩，洗脫4次，每次15min。（4）漂洗將凝膠置于漂洗液中，室溫，振蕩，漂洗2次，每次20min。（5）孵育將凝膠置于孵育液中，37℃，孵育24h。（6）染色及脫色將凝膠置于染色液，染色3h；再將凝膠置于脫色液A、B、C（脫色液A、B、C中甲醇濃度依次為30%、20%和10%，乙酸濃度依次為10%、10%和5%，混勻，室溫保存），分別脫色0.5，1和2h；位于藍(lán)色背景上的透亮帶就是MMP-2（72KDa）和MMP-9（92KDa）；用ImageJ進(jìn)行灰度值分析。2.8統(tǒng)計(jì)方法所有結(jié)果用mean±SEM表示。使用ANOVA方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，它屬于Tukey的一種多重比較法。當(dāng)P<0.05時(shí)，結(jié)果有顯著性差異。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1Lysholm膝關(guān)節(jié)功能評(píng)分結(jié)果利用Lysholm膝關(guān)節(jié)功能評(píng)分檢測(cè)膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷患者的膝關(guān)節(jié)功能，結(jié)果顯示，膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷患者治療前膝關(guān)節(jié)功能評(píng)分為58.62±5.675，注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥治療后，膝關(guān)節(jié)功能評(píng)分明顯提高，達(dá)到81.85±4.871。3.2VAS評(píng)估疼痛結(jié)果利用VAS評(píng)估膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷患者的疼痛程度，結(jié)果顯示，膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷患者治療前VAS評(píng)估值為7.47±1.272，注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥治療后，VAS評(píng)估值明顯降低，達(dá)到2.79±1.099。3.3細(xì)胞增殖能力結(jié)果利用CCK-8檢測(cè)膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞增殖率明顯降低，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥增加膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果提示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥能夠顯著增強(qiáng)膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞的增殖（圖1）。3.4實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）廣泛存在于機(jī)體的各種結(jié)締組織中，在胞外基質(zhì)的降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用，例如：它可以降解膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的基質(zhì)，從而造成軟骨損傷進(jìn)而出現(xiàn)糜爛和潰瘍等病理改變。關(guān)節(jié)軟骨中MMPs的表達(dá)一直是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的主要機(jī)制，同時(shí)也是進(jìn)行藥物治療作為的靶點(diǎn)，其中膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷過(guò)程中比較明顯的是MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥能夠明顯降低膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞所升高的MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13基因表達(dá)水平（圖2）。3.5ELISA結(jié)果用ELISA進(jìn)一步檢驗(yàn)MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果一致，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥能夠明顯降低膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞所升高的MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13蛋白表達(dá)水平（圖3）。3.6明膠酶譜結(jié)果用明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2和MMP-9的分泌量，進(jìn)一步確定臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥阻滯膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷的炎癥機(jī)制。MMP-2是一個(gè)72kDa的蛋白，MMP-9是一個(gè)92kDa的蛋白，它們可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多生理活動(dòng)，例如：細(xì)胞遷移，這一運(yùn)動(dòng)可以促使其損傷區(qū)域的軟骨組織進(jìn)行功能修復(fù)。膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞組，MMP-2和MMP-9的分泌量明顯升高；臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和超氧化物歧化酶以及維生素D復(fù)合藥顯著降低膝關(guān)節(jié)炎軟骨損傷患者軟骨細(xì)胞所升高的MMP-2和MMP-9的分泌量（圖4）。明膠酶譜法與實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA結(jié)果一致具體實(shí)施方式實(shí)施例11X107細(xì)胞/ml臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和10ng/ml超氧化物歧化酶以及5ng/ml維生素D。實(shí)施例21X107細(xì)胞/ml臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和15ng/ml超氧化物歧化酶以及8ng/ml維生素D。實(shí)施例31X107細(xì)胞/ml臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和25ng/ml超氧化物歧化酶以及15ng/ml維生素D。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3