專利名稱：Sars病毒s蛋白及其疫苗和用其篩選藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)、流行病和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及SARS病毒的特征性位點(diǎn)及其用途。
背景技術(shù)：
2003年我國和世界上許多國家遭到了一次大規(guī)模的非典型肺炎(Atypical pneumonias)的侵襲，由非典型肺炎引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory Sydrome，SARS)已經(jīng)在22個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)在疫情發(fā)生后迅速建立起由全球10個(gè)國家的13個(gè)實(shí)驗(yàn)室組成的協(xié)作研究和監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)。4月16日，WHO正式確認(rèn)SARS的病原體是一種新型冠狀病毒，這是一種單鏈RNA病毒。
全球已有8000多例非典型肺炎患者，在某些發(fā)病區(qū)其死亡率達(dá)到15％，給人民群眾帶來了極大的恐慌。及時(shí)開展SARS冠狀病毒的病原學(xué)以及預(yù)防、診斷和治療的研究，加強(qiáng)控制和治療措施、對患者和疑似病例做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離和早治療，是控制疫情繼續(xù)發(fā)生和傳播的關(guān)鍵。
然而，迄今為止對于SARS病毒的毒性和傳播能力的決定性位點(diǎn)并沒有報(bào)道。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)用于篩選藥物和生產(chǎn)疫苗的SARS蛋白，尤其是來自傳染力強(qiáng)和/或毒性高的SARS病毒株的免疫學(xué)性蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種SARS病毒的特征性蛋白，尤其是來自傳染力強(qiáng)和/或毒性高的SARS病毒株的免疫學(xué)性蛋白。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供所述蛋白在篩選藥物和生產(chǎn)疫苗的用途。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種SARS病毒的S蛋白，該蛋白具有SEQID NO2所述的氨基酸序列，并含有選自下列的突變
a)778D→Y；b)77D→Gc)244T→I；d)1182K→Q；e)360F→S；f)479N→R或K；g)480D→G；h)609A→L。
在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白同時(shí)含有b)77D→G和c)244T→I的突變。
本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種分離的核酸，它編碼上述SARS病毒的S蛋白。
本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了一種SARS病毒，其S蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，并含有選自下列的突變a)778D→Y；b)77D→G；c)244T→I；d)1182K→Q；e)360F→S；f)479N→R或K；g)480D→G；h)609A→L。
在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的S蛋白含有a)778D→Y的突變。
在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的S蛋白同時(shí)含有b)77D→G和c)244T→I的突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了所述的SARS病毒的用途，該病毒用于篩選治療SARS的藥物。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了上述SARS病毒S蛋白的用途，該蛋白用于產(chǎn)生針對SARS病毒的疫苗。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種特異性檢測SARS病毒S蛋白的試劑盒，它含有容器和裝在容器內(nèi)的引物對，所述的引物對擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有對應(yīng)于S蛋白以下位點(diǎn)的核苷酸序列
a)778D→Y；b)77D→G；c)244T→I；d)1182K→Q；e)360F→S；f)479N→R或K；g)480D→G；h)609A→L。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，核苷酸的編號基于加拿大分離到的SARS病毒株的基因序列(SEQ ID NO1)，其在Genbank的登錄號為NC004718(＞gi|30248028|gb|AY274119.3|SARS冠狀病毒TOR2，完全基因組)。
S蛋白的編號以AAP41037.1氨基酸序列為基準(zhǔn)序列，見序列表SEQ IDNO2。
S蛋白(Spike蛋白)是膜蛋白，其構(gòu)成病毒的包膜子粒，是病毒感染宿主細(xì)胞的主要成分。冠狀病毒要感染細(xì)胞，首先要將其遺傳物質(zhì)RNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，這一過程主要是通過S蛋白來完成的。一個(gè)冠狀病毒顆粒在膜上一般包括200左右S蛋白，這些S蛋白的突起是其與受體相互作用和膜融合的關(guān)鍵部位。在多數(shù)冠狀病毒中，S蛋白存在兩種形式，一種為獨(dú)立的單鏈蛋白，另一種為兩個(gè)大小相似的蛋白剪切產(chǎn)物，稱為S1和S2.S1位于N端，為外周部分，構(gòu)成S蛋白的球狀頭，其通過非共價(jià)鍵與跨膜的桿狀S2片段相連。在病毒感染細(xì)胞的初期，外周部分的S1負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞上的受體作用。最初的膜融合反應(yīng)發(fā)生在細(xì)胞膜表面，而在隨后的感染過程中，S蛋白將聚集的在感染細(xì)胞的表面，并最終形成能夠被觀察到的合胞體。由此可見，S蛋白對于SARS病毒的感染和毒性非常重要。
本發(fā)明人在對于不同時(shí)期和不同地點(diǎn)獲得的眾多病人分離得到的SARS病毒進(jìn)行全序列測定和分析后，不僅發(fā)現(xiàn)了S病毒的變異情況，而且發(fā)現(xiàn)在S蛋白上的幾個(gè)重要氨基酸位點(diǎn)是SARS病毒的毒性和傳播能力的決定性位點(diǎn)
第一類是病毒早期變化過程中逐漸發(fā)生的氨基酸變化，包括九個(gè)氨基酸位點(diǎn)，其中位點(diǎn)778D→Y是早期最關(guān)鍵的變化，它的變化與病情加重和傳播能力加強(qiáng)相關(guān)。而位點(diǎn)77D→G，244T→I相對較晚，基因型相對穩(wěn)定，病情也較嚴(yán)重，兩個(gè)位點(diǎn)變異只出現(xiàn)一個(gè)的病毒株也有發(fā)現(xiàn)，但是在群體中發(fā)生比例較低，發(fā)病程度較輕。而兩個(gè)同時(shí)變異產(chǎn)生的病毒株有非常強(qiáng)的感染力和毒性。
第二類是晚期的1182K→Q變化。
利用S蛋白上第77，778和1182位上的突變，可用常規(guī)的DNA重組技術(shù)獲得含有上述突變的S蛋白，然后將其用于藥物篩選和制備抗體。
一種藥物篩選方法是，將候選藥物與含有這些突變的S蛋白的SARS病毒一起培養(yǎng)，可篩選獲得能夠治療sars的多種可能藥物。此外，也可進(jìn)行計(jì)算機(jī)虛擬篩選進(jìn)行初篩，然后再進(jìn)行生物實(shí)驗(yàn)篩選。
本發(fā)明的突變的S蛋白可用于免疫兔、鼠等動物，從而獲得抗本發(fā)明多肽的抗體(“本發(fā)明抗體”)。本發(fā)明抗體包括特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段(如Fab′或(Fab)2片段)、抗體重鏈、抗體輕鏈、嵌合抗體、人源化抗體等。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的含上述突變位點(diǎn)S蛋白或其片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。對于單克隆抗體，可利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
用上述方法制得的本發(fā)明抗體可用檢測樣品中是否存在SARS病毒，從而作為檢測SARS的有效指標(biāo)之一。
基于本發(fā)明公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計(jì)出可特異性擴(kuò)增出含S蛋白特定位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過測序等方法確定是否存在所述突變(見表1和表2)。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(bǔ)(尤其是引物的5′端)的情況下，也能夠特異性地?cái)U(kuò)增(即僅擴(kuò)增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對應(yīng)位置。
雖然擴(kuò)增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為100-3000bp，較佳地為150-2000bp，更佳地為200-1000bp。這些擴(kuò)增產(chǎn)物都應(yīng)含有本發(fā)明至少一個(gè)所述位點(diǎn)(見表1和表2)。
此外，用上述方法制得的本發(fā)明抗體，還可以用于治療SARS。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1SARS突變S蛋白的檢測采集從流行早期到晚期(2003年1月5日至2003年4月7日)的不同地區(qū)的多個(gè)SARS患者的病毒分離培養(yǎng)樣本，分離病毒核酸，然后通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得互補(bǔ)DNA(cDNA)，或直接通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從生物學(xué)樣本，如，痰液，糞便和組織器官獲得cDNA，進(jìn)行全序列測定，從中獲得S蛋白序列。
結(jié)果如表1。
表1列出了SARS病毒S蛋白突變的位點(diǎn)和核苷酸改變。

*注“S30，S08”等為病例編號，其中黑體字標(biāo)出的本申請主要關(guān)注的幾個(gè)位點(diǎn)在許多病人當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，無法一一列出。
發(fā)現(xiàn)當(dāng)778位的氨基酸從Asp變成Tyr，和77位的Asp變成Gly同時(shí)244位的Thr變?yōu)镮le時(shí)，包含有突變S蛋白的SARS病毒株毒性特別強(qiáng)烈，而且傳染力增加了許多倍。而當(dāng)77位和244位不一起發(fā)生突變的時(shí)候，傳染力和發(fā)病的程度都較輕。
還在1182位發(fā)現(xiàn)了Lys到Gln的突變。這種突變僅在SARS流行晚期的病人體內(nèi)分離的病毒株中見到。該突變可用來確定SARS病毒的流行病學(xué)時(shí)間。
實(shí)施例2SARS突變S蛋白的檢測II采集從流行早早期(2004年1-2月)廣州的三個(gè)SARS患者的病毒分離培養(yǎng)樣本以及來自果子貍的SARS病毒樣本。按實(shí)施例1相同方法，對分離的SARS病毒全序列測定，從中獲得S蛋白序列。結(jié)果如表2所示。
表2列出了早早期SARS病毒S蛋白突變的位點(diǎn)和核苷酸改變。

2004年初廣東新診斷出的SARS病例(即GZ03-01，GZ03-02，GZ03-03病例)雖然出現(xiàn)時(shí)間晚于2002-2003年的病例，但是基于臨床診斷和序列分析，認(rèn)為屬于早早期的SARS病例，因?yàn)檫@些早早期SARS的全序列一方面與果子貍的SARS病毒全序列更為接近，而且其感染力也很弱，沒有發(fā)生人與人之間傳播情況，這提示這些早早期SARS病毒在人與人之間傳播力非常弱，甚至可能不能在人與人之間傳播。此外，早早期SARS感染病例出現(xiàn)抗SARS抗體的時(shí)間明顯早已其他SARS病毒(例如早、中、晚期SARS，如S30，S08，C52，C53，GZ01等)的感染病例，這提示這些早早期SARS更容易被人體的免疫系統(tǒng)所識別。
S蛋白是SARS病毒與宿主細(xì)胞表面上的受體發(fā)生結(jié)合的主要蛋白，因此S蛋白的變異情況與SARS病毒的感染力強(qiáng)弱密切相關(guān)。根據(jù)對90例SARS病毒的全序列測定結(jié)果以及對多例果子貍SARS病毒的全序列測定結(jié)果，表明表2所示的S蛋白位點(diǎn)22570、22927-22928、22930、23316-23317位不僅可以作為早早期SARS病毒的特異性標(biāo)志，而且這些位點(diǎn)的突變所導(dǎo)致的氨基酸突變(即360 F→S；479 N→R或K；480 D→G；609 A→L)會導(dǎo)致SARS病毒的感染力減弱，然而卻不影響其免疫原性，因此在制備抗SARS疫苗方面有巨大的應(yīng)用前景。
此外，22927-22928位和23316-23317位是兩個(gè)很特別的雙突變位點(diǎn)。其中22927-22928位在所有感染人的SARS中都是AT型(對應(yīng)氨基酸為Asn)，而在果子貍中存在GA型和AA型(對應(yīng)氨基酸為帶正電荷的氨基酸Arg或Lys)，這提示只有果子貍SARS病毒發(fā)生突變所產(chǎn)生AT型，才可有效地感染人。而非AT型(如GA型和AA型)SARS病毒并不感染人。因此，這一位點(diǎn)可以作為區(qū)分SARS病毒來源和判斷其感染力強(qiáng)弱的重要標(biāo)識之一。
23316-23317位在所有測定的SARS病例中只有GC和TT兩種，在所有2003年的SARS感染病例中都是GC型(對應(yīng)氨基酸為Ala)，而在果子貍和早早期的SARS病例中為TT型或GC型(對應(yīng)氨基酸為Leu)，這提示這位點(diǎn)非常重要，而且GC型SARS對人的感染力強(qiáng)。而TT型SARS病毒感染力弱。因此，這一位點(diǎn)可以作為判斷SARS感染力強(qiáng)弱的重要標(biāo)識之一。
此外，根據(jù)對S蛋白結(jié)構(gòu)的分析，表明S蛋白第311-487位氨基酸構(gòu)成的區(qū)段(對應(yīng)于第22422-22951位核苷酸)，參與S蛋白和ACE2受體結(jié)合，而第577-613位氨基酸構(gòu)成的區(qū)段(對應(yīng)于第23220-23330位核苷酸)與三聚體的形成的有關(guān)。而22927-22928位和23316-23317位分別位于上述兩個(gè)區(qū)段，因此在SARS檢測上具有重要意義。
實(shí)施例3SARS檢測試劑盒如實(shí)施例1和2所述，SEQ ID NO1中22222、22570、22927-22928、22930、23316-23317、23823等位點(diǎn)與SARS的感染力強(qiáng)弱密切相關(guān)。因此，基于這些突變設(shè)計(jì)特異性引物，用盲法取不同SARS病毒DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行檢測。
制備一試劑盒(100人次)，它含有

將檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到1umol/μl，以所提取的SARS DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物(對應(yīng)于SEQ ID NO1中第22890-23910位)純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。然后根據(jù)SNP來判斷待檢測SARS的感染力強(qiáng)弱。
檢測結(jié)果如表3所示，與臨床結(jié)果和樣本來源完全相符。
表3檢測結(jié)果

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>國家人類基因組南方研究中心廣東省疾病預(yù)防控制中心廣州市疾病預(yù)防控制中心中國人民解放軍軍需大學(xué)<120>SARS病毒S蛋白及其疫苗和用其篩選藥物的方法<130>043094<150>CN03141518.0<151>2003-07-10<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29751<212>DNA<213>SARS病毒(SARS virus)<400>1atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt60ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac120gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct180tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc240gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca300cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg360gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt420ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa480cgttctgatg ccttaagcac caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg540gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc600gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggt660ggtcatagct atggcatcga tctaaagtct tatgacttag gtgacgagct tggcactgat720cccattgaag attatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc actccgtgaa780ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc840ccagatgggt accctcttga ttgcatcaaa gattttctcg cacgcgcggg caagtcaatg900tgcactcttt ccgaacaact tgattacatc gagtcgaaga gaggtgtcta ctgctgccgt960gaccatgagc atgaaattgc ctggttcact gagcgctctg ataagagcta cgagcaccag1020acacccttcg aaattaagag tgccaagaaa tttgacactt tcaaagggga atgcccaaag1080tttgtgtttc ctcttaactc aaaagtcaaa gtcattcaac cacgtgttga aaagaaaaag1140actgagggtt tcatggggcg tatacgctct gtgtaccctg ttgcatctcc acaggagtgt1200aacaatatgc acttgtctac cttgatgaaa tgtaatcatt gcgatgaagt ttcatggcag1260acgtgcgact ttctgaaagc cacttgtgaa cattgtggca ctgaaaattt agttattgaa1320ggacctacta catgtgggta cctacctact aatgctgtag tgaaaatgcc atgtcctgcc1380tgtcaagacc cagagattgg acctgagcat agtgttgcag attatcacaa ccactcaaac1440attgaaactc gactccgcaa gggaggtagg actagatgtt ttggaggctg tgtgtttgcc1500tatgttggct gctataataa gcgtgcctac tgggttcctc gtgctagtgc tgatattggc1560tcaggccata ctggcattac tggtgacaat gtggagacct tgaatgagga tctccttgag1620atactgagtc gtgaacgtgt taacattaac attgttggcg attttcattt gaatgaagag1680gttgccatca ttttggcatc tttctctgct tctacaagtg cctttattga cactataaag1740agtcttgatt acaagtcttt caaaaccatt gttgagtcct gcggtaacta taaagttacc1800aagggaaagc ccgtaaaagg tgcttggaac attggacaac agagatcagt tttaacacca1860ctgtgtggtt ttccctcaca ggctgctggt gttatcagat caatttttgc gcgcacactt1920gatgcagcaa accactcaat tcctgatttg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt1980atttctgaac agtcattacg tcttgtcgac gccatggttt atacttcaga cctgctcacc2040aacagtgtca ttattatggc atatgtaact ggtggtcttg tacaacagac ttctcagtgg2100ttgtctaatc ttttgggcac tactgttgaa aaactcaggc ctatctttga atggattgag2160gcgaaactta gtgcaggagt tgaatttctc aaggatgctt gggagattct caaatttctc2220
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gcttgttttg tgcttgctgc tgtctacaga attaattggg tgactggcgg gattgcgatt 26640gcaatggctt gtattgtagg cttgatgtgg cttagctact tcgttgcttc cttcaggctg 26700tttgctcgta cccgctcaat gtggtcattc aacccagaaa caaacattct tctcaatgtg 26760cctctccggg ggacaattgt gaccagaccg ctcatggaaa gtgaacttgt cattggtgct 26820gtgatcattc gtggtcactt gcgaatggcc ggacactccc tagggcgctg tgacattaag 26880gacctgccaa aagagatcac tgtggctaca tcacgaacgc tttcttatta caaattagga 26940gcgtcgcagc gtgtaggcac tgattcaggt tttgctgcat acaaccgcta ccgtattgga 27000aactataaat taaatacaga ccacgccggt agcaacgaca atattgcttt gctagtacag 27060taagtgacaa cagatgtttc atcttgttga cttccaggtt acaatagcag agatattgat 27120tatcattatg aggactttca ggattgctat ttggaatctt gacgttataa taagttcaat 27180agtgagacaa ttatttaagc ctctaactaa gaagaattat tcggagttag atgatgaaga 27240acctatggag ttagattatc cataaaacga acatgaaaat tattctcttc ctgacattga 27300ttgtatttac atcttgcgag ctatatcact atcaggagtg tgttagaggt acgactgtac 27360tactaaaaga accttgccca tcaggaacat acgagggcaa ttcaccattt caccctcttg 27420ctgacaataa atttgcacta acttgcacta gcacacactt tgcttttgct tgtgctgacg 27480gtactcgaca tacctatcag ctgcgtgcaa gatcagtttc accaaaactt ttcatcagac 27540aagaggaggt tcaacaagag ctctactcgc cactttttct cattgttgct gctctagtat 27600ttttaatact ttgcttcacc attaagagaa agacagaatg aatgagctca ctttaattga 27660cttctatttg tgctttttag cctttctgct attccttgtt ttaataatgc ttattatatt 27720ttggttttca ctcgaaatcc aggatctaga agaaccttgt accaaagtct aaacgaacat 27780gaaacttctc attgttttga cttgtatttc tctatgcagt tgcatatgca ctgtagtaca 27840gcgctgtgca tctaataaac ctcatgtgct tgaagatcct tgtaaggtac aacactaggg 27900gtaatactta tagcactgct tggctttgtg ctctaggaaa ggttttacct tttcatagat 27960ggcacactat ggttcaaaca tgcacaccta atgttactat caactgtcaa gatccagctg 28020gtggtgcgct tatagctagg tgttggtacc ttcatgaagg tcaccaaact gctgcattta 28080gagacgtact tgttgtttta aataaacgaa caaattaaaa tgtctgataa tggaccccaa 28140tcaaaccaac gtagtgcccc ccgcattaca tttggtggac ccacagattc aactgacaat 28200aaccagaatg gaggacgcaa tggggcaagg ccaaaacagc gccgacccca aggtttaccc 28260aataatactg cgtcttggtt cacagctctc actcagcatg gcaaggagga acttagattc 28320cctcgaggcc agggcgttcc aatcaacacc aatagtggtc cagatgacca aattggctac 28380taccgaagag ctacccgacg agttcgtggt ggtgacggca aaatgaaaga gctcagcccc 28440agatggtact tctattacct aggaactggc ccagaagctt cacttcccta cggcgctaac 28500aaagaaggca tcgtatgggt tgcaactgag ggagccttga atacacccaa agaccacatt 28560ggcacccgca atcctaataa caatgctgcc accgtgctac aacttcctca aggaacaaca 28620ttgccaaaag gcttctacgc agagggaagc agaggcggca gtcaagcctc ttctcgctcc 28680tcatcacgta gtcgcggtaa ttcaagaaat tcaactcctg gcagcagtag gggaaattct 28740cctgctcgaa tggctagcgg aggtggtgaa actgccctcg cgctattgct gctagacaga 28800ttgaaccagc ttgagagcaa agtttctggt aaaggccaac aacaacaagg ccaaactgtc 28860actaagaaat ctgctgctga ggcatctaaa aagcctcgcc aaaaacgtac tgccacaaaa 28920cagtacaacg tcactcaagc atttgggaga cgtggtccag aacaaaccca aggaaatttc 28980ggggaccaag acctaatcag acaaggaact gattacaaac attggccgca aattgcacaa 29040tttgctccaa gtgcctctgc attctttgga atgtcacgca ttggcatgga agtcacacct 29100tcgggaacat ggctgactta tcatggagcc attaaattgg atgacaaaga tccacaattc 29160aaagacaacg tcatactgct gaacaagcac attgacgcat acaaaacatt cccaccaaca 29220gagcctaaaa aggacaaaaa gaaaaagact gatgaagctc agcctttgcc gcagagacaa 29280aagaagcagc ccactgtgac tcttcttcct gcggctgaca tggatgattt ctccagacaa 29340cttcaaaatt ccatgagtgg agcttctgct gattcaactc aggcataaac actcatgatg 29400accacacaag gcagatgggc tatgtaaacg ttttcgcaat tccgtttacg atacatagtc 29460tactcttgtg cagaatgaat tctcgtaact aaacagcaca agtaggttta gttaacttta 29520atctcacata gcaatcttta atcaatgtgt aacattaggg aggacttgaa agagccacca 29580cattttcatc gaggccacgc ggagtacgat cgagggtaca gtgaataatg ctagggagag 29640ctgcctatat ggaagagccc taatgtgtaa aattaatttt agtagtgcta tccccatgtg 29700attttaatag cttcttagga gaatgacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 29751<210>2<211>1255<212>PRT
<213>SARS病毒(SARS virus)<400>2Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp195 200 205Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu210 215 220Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro225 230 235 240Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr245 250 255Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile260 265 270Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys275 280 285Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn290 295 300Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr305 310 315 320Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser325 330 335Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr340 345 350Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly355 360 365Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala370 375 380Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly385 390 395 400Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe405 410 415Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser420 425 430
Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu435 440 445Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly450 455 460Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp465 470 475 480Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val485 490 495Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly500 505 510Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn515 520 525Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg530 535 540Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp545 550 555 560Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys565 570 575Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser580 585 590Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr595 600 605Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr610 615 620Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu625 630 635 640His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile645 650 655Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys660 665 670Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala675 680 685Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile690 695 700Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys705 710 715 720Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu725 730 735Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile740 745 750Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys755 760 765Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe770 775 780Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile785 790 795 800Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met805 810 815Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile820 825 830Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr835 840 845Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala850 855 860Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe865 870 875 880Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn885 890 895
Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala900 905 910Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly915 920 925Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu930935 940Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn945 950 955 960Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp965 970 975Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln980985990Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala995 1000 1005Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp101010151020Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala102510301035Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln104010451050Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys105510601065Ala Tyr Phe Pro Arg Glu GIy Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser107010751080Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr108510901095Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly110011051110Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp111511201125Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser113011351140Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val114511501155Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys116011651170Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr117511801185Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile119011951200Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys120512101215Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys Gly122012251230Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys123512401245Gly Val Lys Leu His Tyr Thr12501255<210>3<211>30<212>DNA<213>SARS病毒(SARS virus)<400>3gcaccccacc tgctcttaat tgttattggc 30
<210>4<211>30<212>DNA<213>SARS病毒(SARS virus)<400>4tattaaagag caagtcctca ataaaagacc 30
權(quán)利要求
1.一種SARS病毒的S蛋白，其特征在于，該蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，并含有選自下列的突變a)778D→Y；b)77D→G；c)244T→I；d)1182K→Q；e)360F→S；f)479N→R或K；g)480D→G；h)609A→L。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于，該蛋白同時(shí)含有b)77D→G和c)244T→I的突變。
3.一種分離的核酸，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的SARS病毒的S蛋白。
4.一種SARS病毒，其特征在于，其S蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，并含有選自下列的突變a)778D→Y；b)77D→G；c)244T→I；d)1182K→Q；e)360F→S；f)479N→R或K；g)480D→G；h)609A→L。
5.如權(quán)利要求4所述的SARS病毒，其特征在于，所述的S蛋白含有a)778D→Y的突變。
6.如權(quán)利要求4所述的SARS病毒，其特征在于，所述的S蛋白同時(shí)含有b)77D→G和c)244T→I的突變。
7.權(quán)利要求4所述的SARS病毒的用途，其特征在于，該病毒用于篩選治療SARS的藥物。
8.權(quán)利要求1所述的SARS病毒S蛋白的用途，其特征在于，該蛋白用于產(chǎn)生針對SARS病毒的疫苗。
9.一種特異性檢測SARS病毒S蛋白的試劑盒，其特征在于，它含有容器和裝在容器內(nèi)的引物對，所述的引物對擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有對應(yīng)于S蛋白以下位點(diǎn)的核苷酸序列a)778D→Y；b)77D→G；c)244T→I；d)1182K→Q；e)360F→S；f)479N→R或K；g)480D→G；h)609A→L。
全文摘要
公開了一種SARS病毒的S蛋白，該蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，并含有選自下列的突變a)778D→Y；b)77D→G；c)244T→I；d)1182K→Q；e)360 F→S；f)479 N→R或K；g)480 D→G；h)609 A→L。還公開了編碼該S蛋白的核酸和含有這些突變的SARS病毒。還公開了該病毒用于篩選治療SARS的藥物和該S蛋白用于產(chǎn)生針對SARS病毒的疫苗的用途。
文檔編號A61P31/14GK1607207SQ20041004359
公開日2005年4月20日 申請日期2004年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月10日
發(fā)明者趙國屏, 林錦炎, 宋懷東, 鄭煥英, 王升躍, 何劍峰, 任雙喜, 鄢心革, 李亦學(xué), 萬卓越, 孔祥銀, 許銳恒, 郝沛, 吳新偉, 顧伯偉, 侯金林, 陳竺, 閔軍, 繆有剛, 徐軍, 傅剛, 陸家海, 張樹義, 王小寧, 涂長春, 王鳴 申請人:國家人類基因組南方研究中心, 廣東省疾病預(yù)防控制中心, 廣州市疾病預(yù)防控制中心, 中國人民解放軍軍需大學(xué)