可溶性埃博拉病毒包膜蛋白疫苗的制備方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病毒疫苗制備技術(shù)和醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究領(lǐng)域。本發(fā)明涉及重組的埃博拉病毒包膜蛋白(GP蛋白)的序列組成及其在疾病預(yù)防中的使用。
【背景技術(shù)】
[0002]埃博拉病毒(Ebola virus)是引起人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物發(fā)生埃博拉出血熱的致病病毒，它是當(dāng)今世界上最致命的出血熱病毒，感染者癥狀為惡心、嘔吐、腹瀉、膚色改變、全身酸痛、體內(nèi)出血、發(fā)熱等，其致死率達(dá)50?70 %，致死原因主要為中風(fēng)、心肌梗塞、低血容量休克或多發(fā)性器官衰竭。自1976年首次被發(fā)現(xiàn)以來，埃博拉出血熱已多次在非洲多個(gè)國(guó)家和地區(qū)暴發(fā)流行，造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。2013年起，埃博拉病毒感染病例相繼出現(xiàn)在幾內(nèi)亞、利比里亞、塞拉利昂等西非國(guó)家，且以驚人的速度傳播。截至2014年12月15日，世界衛(wèi)生組織宣布埃博拉病毒已在全球范圍內(nèi)造成6841人死亡，受感染的病例總數(shù)達(dá)到18464人，成為有史以來最大的一次埃博拉疫情。盡管埃博拉屬于地區(qū)局域性流行病，但是各國(guó)都將它做為頭號(hào)防御對(duì)象，一旦傳入該國(guó)，會(huì)影響到該國(guó)與其它國(guó)家的經(jīng)貿(mào)往來和旅游。埃博拉在任何地方大范圍傳播，都會(huì)釀成一場(chǎng)人道災(zāi)難，即使只有少數(shù)病例，也會(huì)在這個(gè)嚴(yán)重依賴貿(mào)易的地區(qū)引發(fā)經(jīng)濟(jì)動(dòng)蕩。
[0003]疫苗是預(yù)防埃博拉病毒的最好策略。2015年I月歐盟投入逾2億歐元推動(dòng)埃博拉疫苗研究。埃博拉病毒具有一個(gè)獨(dú)特和唯一的包膜蛋白(envelope glycoprotein，GP)，這個(gè)GP蛋白具有免疫原性，免疫小鼠后能夠產(chǎn)生抗體中和埃博拉病毒。目前研發(fā)的各種埃博拉病毒疫苗均是針對(duì)GP蛋白的。
[0004]目前，進(jìn)入臨床試驗(yàn)的埃博拉病毒疫苗主要有兩種:一種是減毒水皰性口炎病毒載體的埃博拉疫苗“rVSVAG-EBOVGP”，另一種復(fù)制缺陷型3型腺病毒載體的埃博拉疫苗“cAd3-EB0V”。這兩種疫苗均為活的病毒疫苗，注射人體后，通過疫苗所表達(dá)的GP蛋白來激活人體的免疫系統(tǒng)，從而產(chǎn)生中和埃博拉病毒的抗體。
[0005]然而，以病毒為載體的疫苗在注射人體后，會(huì)產(chǎn)生一過性發(fā)熱和肌肉疼痛等不適癥狀。瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)醫(yī)院2014年12月11日宣布暫停試驗(yàn)德國(guó)默克公司(Merck)和美國(guó)紐琳公司(NewLink)聯(lián)手研發(fā)的埃博拉疫苗，源于4名接種疫苗的志愿者出現(xiàn)了關(guān)節(jié)疼痛癥狀。
[0006]能否用單純的GP蛋白來制備疫苗？這在目前的技術(shù)上存在一定的難度。這是因?yàn)镚P蛋白在胞內(nèi)先是翻譯成完整的676個(gè)氨基酸大蛋白，隨后被胞內(nèi)furin酶于501位氨基酸后切割成兩個(gè)蛋白:GP1和GP2。GP2蛋白為穿膜蛋白，錨定在細(xì)胞膜上，而GPl蛋白通過二硫鍵與GP2蛋白相鏈接形成復(fù)合體。同時(shí)，三個(gè)GP1/GP2蛋白復(fù)合體相互結(jié)合形成trimer，構(gòu)成了埃博拉病毒包膜上的刺突結(jié)構(gòu)。因此，從上可以看出，GP蛋白為非分泌性蛋白，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需依賴于細(xì)胞膜才能正確組裝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明是在埃博拉病毒包膜蛋白第629位氨基酸后插入兩個(gè)凝血酶切割位點(diǎn)Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (LVPRGS)，即在第629位氨基酸后插入的序列具體為GSGLVPRGSGLVPRGS，重組后的埃博拉病毒包膜蛋白完整的氨基酸數(shù)目為692個(gè)(SEQ ID NO:1)，完整的重組蛋白的具體序列為:
MGVTGILQLP RDRFKRTSFF LffVIILFQRT FSIPLGVIHN STLQVSDVDK LVCRDKLSST 60 NQLRSVGLNL EGNGVATDVP SATKRffGFRS GVPPKVVNYE AGEffAENCYN LEIKKPDGSE 120 CLPAAPDGIR GFPRCRYVHK VSGTGPCAGD FAFHKEGAFF LYDRLASTVI YRGTTFAEGV 180 VAFLILPQAK KDFFSSHPLR EPVNATEDPS SGYYSTTIRY QATGFGTNET EYLFEVDNLT 240 YVQLESRFTP QFLLQLNETI YTSGKRSNTT GKLIffKVNPE IDTTIGEffAF WETKKNLTRK 300 IRSEELSFTV VSNGAKNISG QSPARTSSDP GTNTTTEDHK IMASENSSAM VQVHSQGREA 360 AVSHLTTLAT ISTSPQSLTT KPGPDNSTHN TPVYKLDISE ATQVEQHHRR TDNDSTASDT 420 PSATTAAGPP KAENTNTSKS TDFLDPATTT SPQNHSETAG NNNTHHQDTG EESASSGKLG 480 LITNTIAGVA GLITGGRRTR REAIVNAQPK CNPNLHYffTT QDEGAAIGLA WIPYFGPAAE 540 GIYIEGLMHN QDGLICGLRQ LANETTQALQ LFLRATTELR TFSILNRKAI DFLLQRffGGT 600 CHILGPDCCI EPHDffTKNIT DKIDQIIHDG SGLVPRGSGL VPRGSFVDKT LPDQGDNDNW 660 WTGffRQffIPA GIGVTGVIIA VIALFCICKF VF692
該重組埃博拉病毒包膜蛋白通過基因轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞(可以是293細(xì)胞、huh7細(xì)胞或CHO細(xì)胞)，表達(dá)后的重組蛋白依然是位于細(xì)胞膜的外側(cè)。隨后，在細(xì)胞上清中加入凝血酶，用凝血酶切割細(xì)胞膜外側(cè)上的埃博拉病毒包膜蛋白，收集上清，抗體親合力純化該膜外段蛋白O
[0008]上述的凝血酶切割位點(diǎn)也可以更改為腸激酶切割位點(diǎn)或Xa因子切割位點(diǎn)。這樣的話，在埃博拉病毒包膜蛋白第629位氨基酸后插入的切割位點(diǎn)是腸激酶切割位點(diǎn)或Xa因子切割位點(diǎn)。
[0009]純化后的可溶性埃博拉病毒包膜蛋白，其用途是制備純蛋白性質(zhì)的埃博拉病毒疫苗。
【附圖說明】
[0010]圖1.插入兩個(gè)凝血酶切割位點(diǎn)后的重組埃博拉病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。
[0011]圖2.重組后的埃博拉病毒包膜蛋白在huh7細(xì)胞膜上的表達(dá)，一抗使用的是多克隆小鼠抗GP蛋白抗體，二抗使用的FITC標(biāo)記的羊抗小鼠多抗。
[0012]圖3.DAPI染色細(xì)胞核一重組后的埃博拉病毒包膜蛋白在huh7細(xì)胞膜上的表達(dá)。
[0013]圖4.純化后的可溶性埃博拉病毒包膜蛋白經(jīng)8%非變性膠電泳并轉(zhuǎn)膜，使用多克隆小鼠抗GP蛋白抗體進(jìn)行膜上顯影。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種可溶性埃博拉病毒包膜蛋白疫苗的制備方法，其特征為在埃博拉病毒包膜蛋白第629位氨基酸后插入兩個(gè)凝血酶切割位點(diǎn)(GSGLVPRGSGLVPRGS)，重組后的埃博拉病毒包膜蛋白的氨基酸數(shù)目為692個(gè)(SEQ ID NO:1)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛋白，該重組埃博拉病毒包膜蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞可以是293細(xì)胞、huh7細(xì)胞或CHO細(xì)胞，表達(dá)后的細(xì)胞用凝血酶切割細(xì)胞膜外側(cè)上的埃博拉病毒包膜蛋白，收集上清，抗體親合力純化該膜外段蛋白。3.權(quán)利要求1中在埃博拉病毒包膜蛋白第629位氨基酸后插入的切割位點(diǎn)也可以是腸激酶切割位點(diǎn)或Xa因子切割位點(diǎn)。4.純化后的可溶性埃博拉病毒包膜蛋白，其用途是制備純蛋白性質(zhì)的埃博拉病毒疫苗。
【專利摘要】可溶性埃博拉病毒包膜蛋白疫苗的制備方法及其用途。本發(fā)明公開了一種可溶性埃博拉病毒包膜蛋白疫苗的制備方法，具體為在埃博拉病毒包膜蛋白第629位氨基酸后插入兩個(gè)凝血酶切割位點(diǎn)（GSGLVPRGSGLVPRGS），在293細(xì)胞、CHO細(xì)胞或huh7細(xì)胞中表達(dá)該重組蛋白，然后用凝血酶切割細(xì)胞膜上外側(cè)的埃博拉病毒包膜蛋白，收集上清，抗體親合力純化。純化后的蛋白可以用來制備純蛋白性質(zhì)的埃博拉病毒疫苗。
【IPC分類】A61K39/12, C07K14/08, A61P31/14
【公開號(hào)】CN105582532
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510539663
【發(fā)明人】李小彥
【申請(qǐng)人】李小彥
【公開日】2016年5月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月30日