專利名稱：重組hpv16l2蛋白疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于重組蛋白制備領(lǐng)域，涉及重組HPV16L2蛋白疫苗及其制備方法，該蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2 Ne)和具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)。
背景技術(shù)：
人乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)屬乳多空病毒科,是無包膜的閉環(huán)雙鏈DNA病毒。現(xiàn)已明確，高危型HPV如HPV16U8的持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，被確定為導(dǎo)致宮頸癌的主要病因，其中又以HPV16型最為常見(Bosch F X，J Natl CancerInst , 1995 , 87: 796 - 802·)。中國專利“人宮頸癌的一種治療性疫苗(專利號(hào)ZL200810112765. 9)”中，公開了人宮頸癌的治療性的疫苗，該疫苗的活性成分為重組腺病毒，該疫苗是將包括HPV16mE67、HPV18mE67、HPV58mE67以及連接三者的短核苷酸片段的轉(zhuǎn)錄融合三基因片段插入Adeno-X的表達(dá)系統(tǒng)的病毒DNA中得到重組腺病毒載體，再將該腺病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞中得到重組腺病毒。該治療性疫苗雖然能引起宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，但以前的感染可能對疫苗的效果產(chǎn)生負(fù)面影響。HPV16病毒樣顆粒(Virus-Like Particles)由主要衣殼蛋白LI和次要衣殼蛋白L2—起共同構(gòu)成。研究表明，主要衣殼蛋白LI可以自組裝形成病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)(VirusLike Particles, VLPs), LI VLPs可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的血清中和抗體,該抗體具有型別特異性，不同基因型的HPV LI VLPs之間沒有或僅有微弱的交叉保護(hù)效果。近來的研究顯示，不同型別HPV LI VLPs的混合制劑在免疫時(shí)相互之間會(huì)產(chǎn)生競爭，導(dǎo)致疫苗整體免疫效果的下降(Ting Zhang, Vaccine, 2010, 28 (19) : 3479-3487)且多個(gè) VLPs 的混合制劑增加了接種蛋白劑量，加大了疫苗接種個(gè)體過敏的幾率。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HPV16L2蛋白的N端具有中和多種HPV基因型的交叉中和表位，是很有前景的候選宮頸癌疫苗(Kawana K，Virology, 1998，245:353-359)，然而，其免疫原性偏低制約了該疫苗的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，提高HPV16L2蛋白免疫原性是決定該疫苗能否進(jìn)入實(shí)用化階段的重要因素。源于HIV-I Tat的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽具有穿膜活性，可以將外源蛋白(融合或非融合)帶入細(xì)胞內(nèi)。有研究顯示，轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽可顯著提高外源蛋白進(jìn)入胞內(nèi)的水平(Haibin Xia, NatureBiotechnology, 2001, 19: 640-644)。因此，在宮頸癌疫苗的領(lǐng)域，需要研發(fā)出一種將轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽PTD的穿膜活性與HPV16L2蛋白的免疫原性協(xié)同作用，顯著提高HPV16L2蛋白免疫原性的新型重組蛋白疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供重組HPV16L2蛋白疫苗及其制備方法；該重組HPV16L2蛋白疫苗將轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽PTD的穿膜活性與HPV16L2蛋白的免疫原性協(xié)同作用，免疫原性較高。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
重組HPV16L2蛋白疫苗，該蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2 Ne)和具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)。進(jìn)一步地，所述HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2Ne)是HPV16L2 l_88aa多肽片段或HPV16L2 l_200aa多肽片段；編碼所述的HPV16L2 l_88aa多肽片段的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No :1 ;編碼所述的HPV16L2 l_200aa多肽片段的核苷酸序列為序列表中的 SEQ ID No 2o進(jìn)一步地，編碼所述的具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No 3 ;所述的具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No :4。進(jìn)一步地，該蛋白疫苗有兩種形式一種為HPV16L2Ne -PTD融合蛋白；一種為HPV16L2Ne蛋白和PTD蛋白按等比例混合的混合物HPV16L2Ne+PTD。圖I為重組HPV16L2蛋白疫苗基因的結(jié)構(gòu)模式圖。本發(fā)明的目的是通過以下另一技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
重組HPV16L2蛋白疫苗的制備方法，該蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2 Ne)和具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD);制備方法包括如下步驟
步驟一、構(gòu)建含PTD和HPV16L2Ne融合基因的重組蛋白表達(dá)載體，以及僅含HPV16L2Ne基因的重組蛋白表達(dá)載體；
步驟二、用步驟一制備得到的兩種重組蛋白表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)得到所述的HPV16L2Ne-PTD融合蛋白和所述的HPV16L2Ne蛋白；
步驟三、將PTD蛋白與所述的HPV16L2Ne蛋白按等比例混合制成混合制劑，得到所述的混合物 HPV16L2Ne+PTD。進(jìn)一步地,用于制備所述重組蛋白表達(dá)載體的質(zhì)粒是pET_30a或pET_22b ；
進(jìn)一步地，所述相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞是BL-21細(xì)胞[基因型F-，ompT, hsdSB(rB-mB~)，gal dcm (DE3)]。本發(fā)明的目的是通過以下另一技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
重組HPV16L2蛋白疫苗的應(yīng)用，蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2 Ne)和具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD);所述重組HPV16L2蛋白疫苗應(yīng)用于制備預(yù)防和治療子宮頸癌的藥物制劑中。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下有益效果
本發(fā)明將轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽PTD的穿膜活性與HPV16L2蛋白的免疫原性協(xié)同作用，免疫原性較高；本發(fā)明用于制備重組HPV16L2蛋白疫苗，產(chǎn)生中和抗體的滴度明顯提高，得到良好的預(yù)防效果。


圖I :重組HPV16L2蛋白疫苗基因結(jié)構(gòu)模式圖。 圖2 :實(shí)施例I中的8種重組蛋白表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3 :實(shí)施例I中的重組HPV16L2蛋白疫苗抗HPV交叉中和抗體的檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :重組HPV16L2蛋白疫苗，該蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2 Ne)和具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)。所述HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2Ne)是HPV16L2 l_88aa多肽片段或HPV16L2 l-200aa多肽片段；編碼所述的HPV16L2 l_88aa多肽片段的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No :1 ;編碼所述的HPV16L2 l_200aa多肽片段的核苷酸序列為序列表中的SEQID No :2。編碼所述的具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)的核苷酸序列為序列表中的SEQ IDNo 3 ;所述的具有穿膜活 性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No :4。該蛋白疫苗有兩種形式該蛋白疫苗有兩種形式一種為HPV16L2Ne -PTD融合蛋白；一種為HPV16L2Ne蛋白和PTD蛋白按等比例混合的混合物HPV16L2Ne+PTD。圖I為重組HPV16L2蛋白疫苗基因的結(jié)構(gòu)模式圖。本實(shí)施例的重組HPV16L2蛋白疫苗的制備方法包括以下步驟
步驟一、構(gòu)建含PTD和HPV16L2Ne融合基因的重組蛋白表達(dá)載體，以及僅含HPV16L2Ne基因的重組蛋白表達(dá)載體；
步驟一的詳細(xì)操作過程如下
I、構(gòu)建重組HPV16L2蛋白多肽基因序列
本實(shí)施例共構(gòu)建以下四種形式的重組HPV16L2蛋白多肽基因序列
P16L2-88基因序列只含有L2 N端f 88個(gè)氨基酸的基因序列；即為編碼所述的HPV16L2 l_88aa多肽片段的基因序列，核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No 1 ；
P16L2-88-PTD基因序列含有L2 N端1 88個(gè)氨基酸的基因序列和PTD的基因序列；P16L2-200基因序列只含有L2 N端f200個(gè)氨基酸的基因序列；即為編碼所述的HPV16L2 l_200aa多肽片段的基因序列，核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No :2。P16L2-200-PTD基因序列含有L2 N端f200個(gè)氨基酸的基因序列和PTD的基因序列。以上P16L2-88-PTD基因序列、P16L2-200-PTD基因序列中含有的PTD基因序列，即為編碼所述的具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)的基因序列，核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No :3 ;所述的具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID
No :4。A、P16L2-88 基因序列的構(gòu)建以含 HPV16L2 基因(Genbank 登錄號(hào)NC_001526. 2)的PUC-HPV16L2質(zhì)粒為模板，以G88F1和G881R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系是模板質(zhì)粒 lyl，G88Fl I μ I, G881R1 I μ I, IOXPfu Buffer 10 μ I, dNTP 8 μ I, Pfu 2 μ I,ddH20 77 μ 1，總體系 100 μ I。經(jīng)過 30 個(gè)循環(huán)(94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s)獲得P16L2-88基因序列，PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過切膠回收進(jìn)行純化，得到所述的P16L2-88基因序列；具體操作參見試劑盒說明書。B、P16L2-88-PTD基因序列的構(gòu)建以含HPV16L2基因(Genbank登錄號(hào)NC_001526. 2)的PUC-HPV16L2質(zhì)粒為模板，以G88F1和G881R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系模板質(zhì)粒 1μ 1，G88F1 I μ I, G881R2 I μ I, IOXPfu Buffer 10 μ I, dNTP 8 μ I, Pfu
2μ I, DMSO 5 μ I, ddH20 72 μ 1，總體系 100 μ I。經(jīng)過 30 個(gè)循環(huán)(94°C變性 30s，58°C退火30s，72°C延伸30s)獲得P16L2-88-PTD基因序列，PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過切膠回收進(jìn)行純化，得到所述的P16L2-88-PTD基因序列；具體操作參見試劑盒說明書。C、P16L2-200基因序列的構(gòu)建以含HPV16L2基因(Genbank登錄號(hào)NC_001526. 2)的PUC-HPV16L2質(zhì)粒為模板，以G88F1和G881R3為引物，PCR體系及循環(huán)參數(shù)同實(shí)施例l(l)，P16L2-200 PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過切膠回收進(jìn)行純化，得到所述的P16L2-200基因序列；具體操作參見試劑盒說明書。D、P16L2-200-PTD基因序列的構(gòu)建以含HPV16L2基因(Genbank登錄號(hào)NC_001526. 2)的PUC-HPV16L2質(zhì)粒為模板，以G88F1和G881R4為引物，PCR體系及循環(huán)參數(shù)同實(shí)施例I (2)，P16L2-200-PTD PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過切膠回收進(jìn)行純化，得到所述的P16L2-200-PTD基因序列；具體操作參見試劑盒說明書。所述的PUC-HPV16L2質(zhì)粒的構(gòu)建方法為
通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將所述的HPV16L2基因(Genbank登錄號(hào)NC_001526. 2)的兩端引入HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)，得到帶有酶切位點(diǎn)的HPV16L2的基因片段；
對PUC18質(zhì)粒用HindIII和EcoRI酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到帶有酶切位點(diǎn)的大片段；將所述的帶有酶切位點(diǎn)的HPV16L2的基因片段、帶有酶切位點(diǎn)的大片段進(jìn)行連接反應(yīng)，得到連接產(chǎn)物；
將上述連接產(chǎn)物進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，得到所述的TOC-16L2質(zhì)粒。以上四種重組HPV16L2蛋白多肽基因序列的結(jié)構(gòu)模式圖見附件圖I。以上PCR引物序列為
引物 G88F1 序列agtacatatgatgcgacacaaacgttctgc ；
引物 G881R1 序列tagactcgagaggagcaagtgtatctgtag ；
引物G881R2序列
attactcgagcgcacgcgcctgacgcgccgccgcacgcgcataaggagcaagtgtatc ；
引物 G881R3 序列tagactcgagtgtatccataggaatttcttc ；
引物G881R4序列
tagactcgagcgcacgcgcctgacgcgccgccgcacgcgcatatgtatccataggaatttcttc ；
II、構(gòu)建含有重組HPV16L2蛋白多肽基因序列的表達(dá)載體
A、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備
從37°C培養(yǎng)16 20h的新鮮平板上挑取DH5 α單菌落，接種于5ml不含抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜(12 16h)。次日從上述培養(yǎng)物中吸取O. 5ml按1:100轉(zhuǎn)入50ml LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)約3h，至菌液的0D600值為3時(shí)，在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、用冰預(yù)冷的50ml離心管中，冰浴30min。在4°C條件下,4000rpm離心IOmin,棄上清，將管倒置lmin，使殘留培養(yǎng)液流盡，以IOml用冰預(yù)冷的lOOmmol/L CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，冰浴30min。4°C，4000rpm離心IOmin,棄上清,每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的含15%甘油的lOOmmol/L CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，得到所述的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞；將所述的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞分裝為200 μ I每管，_80°C保存?zhèn)溆?。B、pET-30a載體質(zhì)粒、pET_22b載體質(zhì)粒的小量制備
分別挑取pET-30a、pET-22b質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單菌落分別接種于5ml含卡那霉素或氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。分別將培養(yǎng)物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm 離心 30_60s,棄上清，用 100 μ I 預(yù)冷的溶液 I [50mmoI /T, Glucose, 25mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)，1OmmoI/L EDTA (pH8. 0)]重懸菌體，劇烈振蕩混勻；加入 200 μ I 新鮮配制的溶液II (O. 2mol/L NaOH, 1%SDS)，溫和混勻，冰浴3min,至液體清亮；加入150 μ I預(yù)冷的溶液III (100ml中含5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml)溫和混勻，冰浴lOmin, 12000rpm離心IOmin,小心吸取上清,將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入2倍體積的無水乙醇室溫沉淀30min, 12000rpm離心lOmin,棄上清,沉淀用70%乙醇洗一次,室溫晾干后，用 30μ I 含 RNaseAdOOy g/ml)的 TE (pH 8. O)溶解沉淀，37°C 水浴 3(T60min，分別得到所述的pET-30a載體質(zhì)粒、pET-22b載體質(zhì)粒；分別將所述的pET_30a載體質(zhì)粒、pET_22b載體質(zhì)粒置_20°C保存?zhèn)溆谩、構(gòu)建P30a_88重組蛋白表達(dá)載體、P30a_88_PTD重組蛋白表達(dá)載體、P22b_88重組蛋白表達(dá)載體、P22b-88-PTD重組蛋白表達(dá)載體、P30a-200重組蛋白表達(dá)載體、P30a-200-PTD重組蛋白表達(dá)載體、P22b_200重組蛋白表達(dá)載體、P22b_200_PTD重組蛋白表達(dá)載體
將步驟I中得到的所述的P16L2-88基因序列、P16L2-88-PTD基因序列、P16L2-200基因序列、P16L2-200-PTD基因序列分別用內(nèi)切酶I和沿ο I進(jìn)行雙酶切；使用I和通ο I對步驟II -B中得到的所述的pET-30a載體質(zhì)?；騪ET_22b載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。每個(gè)酶切體系為以上每種基因序列20yl，BSA O. 5 μ 1,10 X buff er4 5μ1，內(nèi)切酶M/e I 2 u I,Xho I 2 μ l,ddH20 20. 5 μ 1，總的酶切體系 50 μ 1，37°C消化 3_4h，分別得到酶切產(chǎn)物P16L2-88、P16L2-200、P16L2-88-PTD、P16L2-200-PTD。雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物分別使用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，具體操作參見試劑盒說明書。建立連接反應(yīng)體系，將所述的酶切產(chǎn)物P16L2-88、P16L2-200、P16L2-88-PTD、P16L2-200-PTD分別與載體質(zhì)粒pET-30a、pET_22b分別進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系以上每種酶切產(chǎn)物7 μ 1，每種載體質(zhì)粒I μ 1，10X連接buffer 1μ1，Τ4連接酶I μ I。16°C連接過夜，分別得到連接產(chǎn)物。將所述的連接產(chǎn)物分別加入100 μ I DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min。將管移入42°C水浴箱中水浴90s，然后將管快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I 2min。每管加入500 μ I不含抗生素的LB培養(yǎng)基，將管轉(zhuǎn)移至37°C搖床上，溫育45min(轉(zhuǎn)速<150rpm)。分別取50 μ I已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，用一個(gè)無菌的彎頭玻璃涂布棒輕輕涂到含相應(yīng)抗生素的瓊脂平板表面，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)12 16h。分別命名為 P30a-88、P30a-88-PTD、P30a-200、P30a-200-PTD、P22b-88、P22b-88-PTD、P22b-200、P22b-200-PTD。分別挑取相應(yīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單菌落接種于5ml含卡那霉素或氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。分別將培養(yǎng)物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm 離心 30_60s,棄上清,用 100 μ I 預(yù)冷的溶液 I [50mmoI /T, Glucose, 25mmol/L Tris-HCl (pH 8. O)，IOmmoI/L EDTA (pH8. 0)]重懸菌體，劇烈振蕩混勻；加入 200 μ I 新鮮配制的溶液II (O. 2mol/L NaOH, 1%SDS)，溫和混勻，冰浴3min，至液體清亮；加入150 μ I預(yù)冷的溶液III (100ml中含5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml)溫和混勻，冰浴lOmin, 12000rpm離心IOmin,小心吸取上清,將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入2倍體積的無水乙醇室溫沉淀30min, 12000rpm離心lOmin,棄上清,沉淀用70%乙醇洗一次，室溫晾干后，用 30μ I 含 RNaseAdOOy g/ml)的 TE (pH 8. O)溶解沉淀，37°C 水浴 30_60min 后置_20°C保存?zhèn)溆茫謩e命名為P30a-88重組蛋白表達(dá)載體、P30a_88_PTD重組蛋白表達(dá)載體、P30a-200重組蛋白表達(dá)載體、P30a-200-PTD重組蛋白表達(dá)載體、P22b_88重組蛋白表達(dá)載體、P22b-88-PTD重組蛋白表達(dá)載體、P22b-200重組蛋白表達(dá)載體、P22b_200_PTD重組蛋白表達(dá)載體。圖2為以上8種重組蛋白表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。所述的P30a-88_PTD重組蛋白表達(dá)載體、P30a_200_PTD重組蛋白表達(dá)載體、P22b-88-PTD重組蛋白表達(dá)載體、P22b-200-PTD重組蛋白表達(dá)載體為所述的含PTD和HPV16L2Ne融合基因的重組蛋白表達(dá)載體；
所述的P30a-88重組蛋白表達(dá)載體、P30a- 200重組蛋白表達(dá)載體、P22b_88重組蛋白表達(dá)載體、P22b-200重組蛋白表達(dá)載體為所述的僅含HPV16L2Ne基因的重組蛋白表達(dá)載體。D、重組蛋白表達(dá)載體的鑒定
建立酶切反應(yīng)體系，分別雙酶切所述的P30a-88重組蛋白表達(dá)載體、P30a-88-PTD重組蛋白表達(dá)載體、P30a-200重組蛋白表達(dá)載體、P30a-200-PTD重組蛋白表達(dá)載體、P22b_88重組蛋白表達(dá)載體、P22b-88-PTD重組蛋白表達(dá)載體、P22b-200重組蛋白表達(dá)載體、P22b-200-PTD重組蛋白表達(dá)載體；每個(gè)酶切體系為以上每種重組蛋白表達(dá)載體5 μ 1，BSA
O.2 μ 1,10Xbuffer4 2 μ 1，內(nèi)切酶I I μ I,Xho I I μ I, ddH20 10. 8 μ 1，總的酶切體系20μ 1，37°C消化2h。酶切產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分離，酶切鑒定陽性菌落送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，確定以上各種重組蛋白表達(dá)載體構(gòu)建正確。步驟二、用步驟一制備得到的重組蛋白表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)得到所述的HPV16L2Ne-PTD融合蛋白和所述的HPV16L2Ne蛋白；
步驟二的詳細(xì)操作過程如下
III、重組HPV16L2蛋白疫苗的表達(dá)和純化
A、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL-21的構(gòu)建
將I μ I實(shí)施例I中構(gòu)建并經(jīng)測序鑒定正確的P30a_88重組蛋白表達(dá)載體、P30a-88-PTD重組蛋白表達(dá)載體、P30a_200重組蛋白表達(dá)載體、P30a_200_PTD重組蛋白表達(dá)載體、P22b-88重組蛋白表達(dá)載體、P22b-88-PTD重組蛋白表達(dá)載體、P22b_200重組蛋白表達(dá)載體、P22b-200-PTD重組蛋白表達(dá)載體分別加入100 μ I BL-21感受態(tài)細(xì)胞[基因型F-,OffljDTjA^OrS13 (rB-mB-) ,gal dcm (DE3)]中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻,冰浴 30min。分別將管移入 42°C水浴箱中水浴90s,然后將管快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I 2min。分別將每管加入500 μ I不含抗生素的LB培養(yǎng)基，將管轉(zhuǎn)移至37°C搖床上，溫育45min (轉(zhuǎn)速<150rpm)。分別取50 μ g已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，用一個(gè)無菌的彎頭玻璃涂布棒輕輕涂到含有相應(yīng)抗生素的瓊脂平板表面，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)12 16h，得到含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞，分別為
含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-88、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-88-PTD、含重組HPVl6L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a_200、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-200-PTD、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-88、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b_88_PTD、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-200、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-200-PTD。B、重組HPV16L2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
分別挑取上述含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-88、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-88-PTD、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-200、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-200-PTD、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-88、含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-88-PTD、含重組HPVl6L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-200、含重組HPVl6L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-200-PTD的單菌落接種于50ml含卡那霉素(50 μ g/ml)或氨芐青霉素(60μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中，20°C振蕩培養(yǎng)過夜。分別將50ml過夜培養(yǎng)物接入IL含卡那霉素(50 μ g/ml)或氨芐青霉素(60 μ g/ml)的LB培養(yǎng)液中，37°C攪拌培養(yǎng)2h以上，至對數(shù)中期(A55tl=O. 5-1.0)。分別在培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度lmmol/L，37°C誘導(dǎo)表達(dá)4h，得到誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-88、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-88-PTD、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-200、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-200-PTD、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b_88、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-88-PTD、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-200、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-200-PTD。
C、重組HPV16L2蛋白的純化
a. HPV16L2 重組蛋白 P16L2-88 和 HPV16L2 重組蛋白 P16L2-88-PTD 的純化
將步驟III -B中得到的誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-88、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-88-PTD、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-88、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-88-PTD的菌液分別于4°C以5000g離心15min收集細(xì)胞。每IOOml培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀懸于4ml結(jié)合緩沖液。分別加入溶菌酶至濃度lmg/ml，冰上放置30min。分別將混合物于4°C搖床上孵育lOmin。分別加入Triton_X100、DNase和RNase，終濃度分別為1%、5 μ g/ml和5 μ g/ml，再于4°C搖床上孵育IOmin裂解菌體。分別于4°C3000g離心30min，去除不溶性細(xì)胞碎片，收集上述各個(gè)蛋白表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞裂解上清液。分別使用5ml的HiTrap FF預(yù)裝柱,用10個(gè)柱體積的bufferl (20mM磷酸鈉，500mMNaCl7PH 7.8)平衡柱子，將上述每種細(xì)胞裂解上清液以lml/min流速上柱；用10個(gè)柱體積的 bufferl (20 mmol /I,憐酸鈉，500 mmol /T, NaCl, PH 7. 8)清洗 5ml 的 HiTrap FF 預(yù)裝柱；再用 10 個(gè)柱體積的 buffer2 (20mM 憐酸鈉，500 mmol/L NaCl, PH 6. O)清洗 5ml 的 HiTrapFF預(yù)裝柱，直至穿透液A55(i〈0. 5-1. O ;用6個(gè)柱體積的洗滌緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉，500mmol/L NaCl，PH 5.5)洗柱子。分別用6個(gè)柱體積的低pH洗脫緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉,500 mmol/L NaCl, PH 4.0)洗脫結(jié)合的蛋白；最后得到HPV16L2重組蛋白P16L2-88和HPV16L2 重組蛋白 P16L2-88-PTD。其中，所述的誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a_88、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-88經(jīng)純化后均得到所述的HPV16L2重組蛋白P16L2-88 ;誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-88-PTD、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-88-PTD經(jīng)純化后均得到所述的HPV16L2重組蛋白P16L2-88-PTD。b. HPV16L2 重組蛋白 P16L2-200 和 HPV16L2 重組蛋白 P16L2-200-PTD 的純化將步驟III -B中得到的誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-200、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a_200_PTD、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-200、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-200-PTD的菌液于4°C以5000g離心15min。棄上清，稱菌體沉淀濕重，每克濕重菌體加入3ml細(xì)胞裂解緩沖液[50mmol/L Tris-Cl (pH8. O), lmmol/L EDTA (pH 8. 0), lOOmmol/L NaCl],用玻璃棒輕輕攪動(dòng),使菌體懸起。每克濕重菌體加入4μ I 100mmol/L PMSF, 80 μ I 10mg/ml溶菌酶,攪動(dòng)20min。每克濕重菌體加入4mg脫氧膽酸，繼續(xù)攪動(dòng)。分別懸液37°C放置，不時(shí)用玻璃棒攪動(dòng)，待其變粘時(shí)每克濕重菌體加入20 μ I lmg/ml DNase I，得到上述各個(gè)蛋白表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞裂解液。分別將所述的細(xì)胞裂解液室溫放置，直至不再粘稠，大 約lh。分別將所述的細(xì)胞裂解液于4°C高速離心15min。棄上清，每克沉淀依次重懸于100μ I含不同濃度(0.5、l、2mol/L)尿素的O. lmol/LTris-Cl (pH 8. 5)，44°C高速離心15min。分別棄上清,每克沉淀重懸于100 μ I含0. Immol/L PMSF 的包涵體溶解緩沖液 I [50mmol/L Tris-Cl (pH 8. 0), lmmol/L EDTA (pH 8.0)，lOOmmol/L NaCl, 8mol/L 尿素,0. lmmol/L PMSF],室溫放置 lh,室溫高速離心 15min。棄沉淀，分別收集包涵體溶解上清純化備用。分別使用GE公司HiTrap FF 5ml預(yù)裝柱，用10個(gè)柱體積含8mol/L尿素的bufferl (20mM磷酸鈉，500mM NaCl, PH 7.8)平衡柱子，將上述收集的每種包涵體溶解上清以lml/min流速上柱；用10個(gè)柱體積含8mol/L尿素的bufferl (20 mmol/L磷酸鈉,500mmol/L NaCl, PH 7. 8)清洗5ml的HiTrap FF預(yù)裝柱；再用10個(gè)柱體積含8mol/L尿素的buffer2 (20mM憐酸鈉，500 mmol/L NaCl,PH 6. 0)清洗 5ml 的 HiTrap FF 預(yù)裝柱,直至穿透液、5(|〈0. 5-1. O ;用6個(gè)柱體積含8mol/L尿素的洗滌緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，PH 5. 5)洗柱子；用6個(gè)柱體積低pH含8mol/L尿素的洗脫緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl7PH 4.0)洗脫結(jié)合的蛋白。分別將純化的蛋白于4°C置于含6mol/L、4mol/L、2mol/L、0mol/L尿素的PBS緩沖液中進(jìn)行透析以除去溶液中的尿素。使分別用BCA法對純化蛋白進(jìn)行定量，具體操作參見試劑盒說明書。最后得到HPV16L2重組蛋白P16L2-200 和 HPV16L2 重組蛋白 P16L2-200-PTD。其中，誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a_200、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-200經(jīng)純化后均得到所述的HPV16L2重組蛋白P16L2-200 ;誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL30a-200-PTD、誘導(dǎo)表達(dá)后的含重組HPV16L2基因序列的蛋白表達(dá)細(xì)胞BL22b-200-PTD經(jīng)純化后均得到所述的HPV16L2重組蛋白P16L2-200-PTD。所述的HPV16L2 重組蛋白 P16L2-88-PTD、HPV16L2 重組蛋白 P16L2-200-PTD 為所述的HPV16L2Ne-PTD融合蛋白；所述的HPV16L2Ne -PTD融合蛋白即可作為HPV16L2蛋白疫苗的形式之一。所述的HPV16L2重組蛋白P16L2-88、HPV16L2重組蛋白P16L2-200為所述的HPV16L2Ne 蛋白。步驟三、將PTD蛋白與所述的HPV16L2Ne蛋白按等比例混合制成混合制劑，得到所述的混合物HPV16L2Ne+PTD。所述的PTD蛋白由中科亞光科技有限公司合成；所述的PTD蛋白即為所述的具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD);編碼所述的具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No :3 ;所述的具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No 4o本實(shí)施例中所述的重組HPV16L2蛋白疫苗免疫原性的研究
A、動(dòng)物免疫
4-6周齡，雌性BALB/c小鼠。共分14組，每組組各6只小鼠。PBS劑量為100 μ I/只，HPV16L2Ne-PTD融合蛋白疫苗(即HPV16L2蛋白疫苗的形式之一)、HPV16L2Ne和PTD按等比例混合的HPV16L2Ne+PTD (即HPV16L2蛋白疫苗的形式之二)及PTD單獨(dú)免疫使用的劑量均為20 μ g/只，將上述劑量的重組HPV16L2蛋白疫苗分別與完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑充分混合，各組疫苗在0、2、4周于小鼠單側(cè)脛前肌皮下注射，初次免疫使用完全弗氏佐劑混合疫苗，加強(qiáng)免疫使用不完全弗氏佐劑混合疫苗。動(dòng)物免疫具體規(guī)程見表I。表1 :
權(quán)利要求
1.重組HPV16L2蛋白疫苗，其特征在于，該蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2 Ne)和具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組HPV16L2蛋白疫苗，其特征在于，所述HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2Ne)是HPV16L2 l_88aa多肽片段、或HPV16L2 l_200aa多肽片段；編碼所述的HPV16L2 l_88aa多肽片段的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No :1 ;編碼所述的HPV16L2 l_200aa多肽片段的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No :2。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的所述的重組HPV16L2蛋白疫苗，其特征在于，編碼所述的具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No :3;所述的具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No :4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組HPV16L2蛋白疫苗，其特征在于，該蛋白疫苗有兩種形式一種為HPV16L2Ne -PTD融合蛋白；一種為HPV16L2Ne和PTD按等比例的混合的混合物HPV16L2Ne+PTD。
5.重組HPV16L2蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，該蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2 Ne)和具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD);制備方法包括如下步驟步驟一、構(gòu)建含PTD和HPV16L2Ne融合基因的重組蛋白表達(dá)載體，以及僅含HPV16L2Ne基因的重組蛋白表達(dá)載體；步驟二、用步驟一制備得到的兩種重組蛋白表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)得到HPV16L2Ne-PTD融合蛋白和HPV16L2Ne蛋白；步驟三、將PTD蛋白與所述的HPV16L2Ne蛋白按等比例混合制成混合制劑，得到混合物HPV16L2Ne+PTD。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組HPV16L2蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，用于制備所述重組蛋白表達(dá)載體的質(zhì)粒是pET-30a或pET-22b。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的重組HPV16L2蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，所述相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞是BL-21細(xì)胞。
8.重組HPV16L2蛋白疫苗的應(yīng)用，其特征在于，蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2 Ne)和具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD);所述重組HPV16L2蛋白疫苗應(yīng)用于制備預(yù)防和治療子宮頸癌的藥物制劑中。
全文摘要
本發(fā)明屬于重組蛋白制備領(lǐng)域，涉及重組HPV16L2蛋白疫苗及其制備方法，該蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段(HPV16L2Ne)和具有穿膜活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽(PTD)。該蛋白疫苗有兩種形式一種為HPV16L2Ne-PTD融合蛋白；一種為HPV16L2Ne和PTD按等比例混合的混合物HPV16L2Ne+PTD。本發(fā)明將轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽PTD的穿膜活性與HPV16L2蛋白的免疫原性協(xié)同作用，免疫原性較高；本發(fā)明用于制備重組HPV16L2蛋白疫苗，產(chǎn)生中和抗體的滴度明顯提高，得到良好的預(yù)防效果。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102614506SQ201210054370
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者周玉柏, 曾毅, 李澤琳, 郭艷濤 申請人:北京工業(yè)大學(xué)