本發(fā)明涉及中藥，具體涉及中藥提取，尤其涉及一種利用萃取廢液制備高含量銀杏總黃酮的方法。
背景技術(shù)：
銀杏，又名白果樹(shù)、公孫樹(shù),是我國(guó)特有樹(shù)種。銀杏的葉、果、樹(shù)皮均可入藥,尤以葉的藥用價(jià)值最高。銀杏葉的化學(xué)成分較為復(fù)雜，其提取物中主要含有黃酮類(lèi)化合物和二萜類(lèi)化合物，銀杏黃酮能夠增加腦血管血液流量，改善腦血管血液循環(huán)功能，保護(hù)腦細(xì)胞，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，預(yù)防心絞痛及心肌梗塞，預(yù)防血栓形成，提高機(jī)體免疫能力。
CN 102138945 A《一種自銀杏葉中提取高黃酮含量活性物質(zhì)的方法》，該技術(shù)方案涉及一種黃酮活性物質(zhì)的分離方法，其操作步驟繁瑣、過(guò)程復(fù)雜，且在收率25％的情況下，其黃酮含量?jī)H達(dá)22％，黃酮類(lèi)有效成分損失較大，造成浪費(fèi)。
CN 102078341 A《高純度銀杏黃酮及組合物》中提到一種高純度銀杏黃酮的制備方法，其通過(guò)大孔樹(shù)脂柱分離時(shí)，為了得到高純度黃酮，只收集50％-70％乙醇高黃酮含量部位的洗脫液，致使其收率大大下降，不足20％，造成了極大的資源浪費(fèi)；其次，該工藝分離后只得到了弱極性和中等極性銀杏黃酮，其所含的黃酮成分，與標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物相比，種類(lèi)差異較大，難以和銀杏葉提取物相比較。
銀杏葉中主要成分為銀杏內(nèi)酯及銀杏總黃酮類(lèi)成分，目前銀杏內(nèi)酯類(lèi)成分已被開(kāi)發(fā)成為新藥上市，但是大量銀杏總黃酮類(lèi)有效成分被丟棄，造成資源浪費(fèi)，而有機(jī)溶劑萃取技術(shù)作為工業(yè)上從銀杏葉中提取富集銀杏內(nèi)酯的主要技術(shù)手段，萃余廢液中含有大量的銀杏總黃酮類(lèi)成分，同時(shí)也含有大量的有機(jī)溶劑。通常情況下，20℃時(shí)正丁醇在水中的溶解度7.7％(重量)，乙酸乙酯在水中的溶解度為10％(體積)。如何從該廢液中回收富集銀杏總黃酮的同時(shí)控制有機(jī)溶劑的殘留，并最終得到溶劑殘留符合要求和含量高的銀杏總黃酮，對(duì)于提高產(chǎn)品質(zhì)量，減少資源浪費(fèi)，降低生產(chǎn)成本，環(huán)境保護(hù)等方面，具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計(jì)既不影響銀杏內(nèi)酯及其他有效部位，又能提高銀杏總黃酮收率與含量，并減少有機(jī)溶劑的殘留，且適于工業(yè)化生產(chǎn)中回收銀杏總黃酮的方法。
本發(fā)明提供了一種利用萃取廢液制備高含量銀杏總黃酮的方法，該方法包括下列步驟：
(1)將銀杏葉提取物加入4-5倍提取物重量的50℃-80℃水中，攪拌至完全溶解后，加入等體積的乙酸乙酯萃取2-4次，分別收集萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；
(2)萃取廢液加入水稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)保溫處理后的聚酰胺樹(shù)脂富集，水或含量≤10％的乙醇水溶液除雜2BV-4BV，再用50％-70％的乙醇溶液洗脫，并接取乙醇洗脫液，真空減壓60-80℃減壓濃縮至干，50-80℃減壓干燥2-4h，粉碎過(guò)80目篩，即可。
經(jīng)檢測(cè)，用本發(fā)明方法對(duì)萃取廢液處理后制得的產(chǎn)品，其中銀杏總黃酮含量≥80％，乙酸乙酯和正丁醇溶劑殘留為≤10ppm，銀杏總黃酮回收率≥65％。
本發(fā)明方法所述步驟(1)溶解銀杏葉提取物的水溶液溫度為60℃-70℃，銀杏葉提取物與稀釋所用的水的質(zhì)量體積比為1∶4-5(m/V)，每次乙酸乙酯用量為0.8-1.2倍量銀杏葉提取物溶液體積(V/V)，優(yōu)選為1.0倍量體積(V/V)。
所述步驟(2)萃取廢液與稀釋所用的水的體積比為1∶30-40(V/V)。
所述步驟(2)聚酰胺樹(shù)脂選自30-60目；保溫處理聚酰胺樹(shù)脂的溫度為40-45℃，保溫1-3h。
所述步驟(2)，除雜液為水或含量≤10％的乙醇水溶液，體積為2-4BV，洗脫溶劑為50-70％乙醇水溶液。
所述步驟(2)減壓濃縮真空度為-0.09至-0.1MPa，溫度為60-70℃，時(shí)間為3-4h，減壓干燥溫度為50-80℃，時(shí)間2-4h。
本發(fā)明方法不僅可用于處理以市售銀杏葉提取物(即符合銀杏內(nèi)酯6％和銀杏黃酮24％的銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物)為起始原料所產(chǎn)生的有機(jī)溶劑萃取廢液，還可以用于處理在制備銀杏內(nèi)酯工藝過(guò)程中產(chǎn)生的含有銀杏黃酮的廢液如銀杏內(nèi)酯結(jié)晶后的母液，因?yàn)樵搹U液在除去大部分有機(jī)溶劑(通常為甲醇或乙醇)后可以與有機(jī)溶劑萃取廢液進(jìn)行合并處理。另外，由于銀杏葉的提取工藝有多種，在提取過(guò)程中可能用到的有機(jī)溶劑不限于乙酸乙酯和正丁醇兩種，還可能用到如丙酮、乙醚、除乙酸乙酯外的乙酸酯類(lèi)、正己烷等有機(jī)溶劑，工藝中產(chǎn)生的含有這些有機(jī)溶劑和銀杏黃酮的廢液，也可參考上述工藝技術(shù)方案進(jìn)行回收銀杏黃酮的制備。
本發(fā)明所得銀杏總黃酮中銀杏總黃酮含量≥80％，乙酸乙酯和正丁醇溶劑殘留為≤10ppm，銀杏總黃酮回收率≥65％，其中銀杏總黃酮回收率為萃取廢液中銀杏總黃酮的黃酮率，計(jì)算公式為C1×m1/C2×m2×100％
C1：銀杏總黃酮富集物總黃酮的質(zhì)量濃度(mg/g)
m1：銀杏總黃酮富集物的總重量(g)
C2：萃取廢液中銀杏總黃酮的質(zhì)量濃度(mg/g)
m2：萃取廢液的總重量(g)
本技術(shù)方案具有以下優(yōu)點(diǎn)：
①本方法以銀杏葉提取物萃取廢液為原料，萃取制備銀杏內(nèi)酯類(lèi)成分，回收富集銀杏總黃酮，所有有效成分可以完全提取，并提高銀杏總黃酮有效成分利用率，節(jié)省成本。
②銀杏葉提取物通過(guò)有機(jī)溶劑萃取后，萃取廢液一次過(guò)柱即可回收富集銀杏總黃酮，操作簡(jiǎn)便，且總黃酮含量高，收率高，最大程度降低有機(jī)溶劑殘留量。
本方法用銀杏葉提取物有機(jī)溶劑萃取廢液為原料，工藝簡(jiǎn)單，回收富集萃取廢液中的銀杏總黃酮，全過(guò)程除乙醇和乙酸乙酯/正丁醇外，不用其它有機(jī)溶劑，可實(shí)現(xiàn)溶劑回收利用的綠色生產(chǎn)。產(chǎn)品含量高，收率高，適于工業(yè)化生產(chǎn)，有較大的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
參考下列實(shí)施例將更易于理解本發(fā)明，給出實(shí)施例是為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
銀杏黃酮醇苷含量檢測(cè)方法參考藥典銀杏葉提取物項(xiàng)下總黃酮醇苷含量測(cè)定方法；銀杏總黃酮含量測(cè)定方法參考文獻(xiàn)(張國(guó)勇,梁曉美,方壘.銀杏葉片和銀杏酮酯片的質(zhì)量比較和用藥成本分析，中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2014,(9):1136-1140)。
實(shí)施例1
取銀杏葉提取物1kg，加入5L 85℃熱水溶解，降溫至40℃，加入乙酸乙酯萃取3次，每次5L，分別收集萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；萃取廢液加入450L 30℃水溶液稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)10L聚酰胺樹(shù)脂(30-60目)保溫吸附2h，溫度40℃，用30L水洗至流出液近無(wú)色后，再用70％乙醇洗脫30L，洗脫液于60℃減壓(真空度為-0.09-0.1Mpa)濃縮至浸膏(含水量為15％)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下80℃減壓干燥4h，最終得到銀杏總黃酮147.71g，經(jīng)檢測(cè)，銀杏黃酮醇苷含量為61.66％，銀杏總黃酮含量為81.20％，總黃酮回收率為66.63％，乙酸乙酯含量≤10ppm。
實(shí)施例2
取銀杏葉提取物2kg，加入10L 80℃熱水溶解，降溫至40℃，加入正丁醇萃取3次，每次10L，合并萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；萃取廢液加入900L 30℃水溶液稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)20L聚酰胺樹(shù)脂(30-60目)保溫吸附3h，溫度45℃，用60L水洗至流出液近無(wú)色后，再用75％乙醇洗脫60L，洗脫液于60℃減壓(真空度為-0.09-0.1Mpa)濃縮至浸膏(含水量為15％)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下70℃減壓干燥3h，最終得到銀杏總黃酮298.87g，經(jīng)檢測(cè)，銀杏黃酮醇苷含量為60.58％，銀杏總黃酮含量為82.21％，總黃酮回收率為68.25％，正丁醇含量≤10ppm。
實(shí)施例3
取銀杏葉提取物0.5kg，加入2.5L 80℃熱水溶解，降溫至40℃，加入乙酸乙酯與正丁醇混合溶劑(1：1)萃取3次，每次2.5L，合并萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；萃取廢液加入80L 30℃水溶液稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)5L聚酰胺樹(shù)脂(30-60目)保溫吸附2h，溫度45℃，用20L水洗至流出液近無(wú)色后，再用70％乙醇洗脫20L，洗脫液于60℃減壓(真空度為-0.09-0.1Mpa)濃縮至浸膏(含水量為18％)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下80℃減壓干燥2h，最終得到銀杏總黃酮74.76g，經(jīng)檢測(cè)，銀杏黃酮醇苷含量為58.22％，銀杏總黃酮含量為79.63％，總黃酮回收率為65.88％，乙酸乙酯含量≤10ppm，正丁醇含量≤10ppm。
實(shí)施例4
取銀杏葉提取物0.1kg，加入0.5L 80℃熱水溶解，降溫至40℃，加入乙酸乙酯萃取3次，每次0.5L，合并萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；萃取廢液加入45L 30℃水溶液稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)1L聚酰胺樹(shù)脂(30-60目)保溫吸附1h，溫度45℃，用2L水洗至流出液近無(wú)色后，再用75％乙醇洗脫4L，洗脫液于60℃減壓濃縮(真空度為-0.09-0.1Mpa)至浸膏(含水量為20％)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下75℃減壓干燥4h，最終得到銀杏總黃酮16.26g，經(jīng)檢測(cè)，銀杏黃酮醇苷含量為61.42％，銀杏總黃酮含量為79.96％，總黃酮回收率為72.24％，乙酸乙酯含量≤10ppm。
實(shí)施例5
取銀杏葉提取物1.5kg，加入6L 80℃熱水溶解，降溫至40℃，加入乙酸乙酯萃取4次，每次6L，合并萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；萃取廢液加入720L 30℃水溶液稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)15L聚酰胺樹(shù)脂(30-60目)保溫吸附2h，溫度40℃，用60L水洗至流出液近無(wú)色后，再用70％乙醇洗脫45L，洗脫液于60℃減壓(真空度為-0.09-0.1Mpa)至浸膏(含水量為18％)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下80℃減壓干燥5h，最終得到銀杏總黃酮233.19g，經(jīng)檢測(cè)，銀杏黃酮醇苷含量為63.06％，銀杏總黃酮含量為81.12％，總黃酮回收率為70.06％，乙酸乙酯含量≤10ppm。
實(shí)施例6
取銀杏葉2kg，加入8L 70％乙醇(m/V)回流提取2次，每次2h，合并乙醇提取液，60℃減壓濃縮(真空度-0.09-0.10MPa)至無(wú)醇味(密度1.05g/ml)，通過(guò)300ml D-101樹(shù)脂吸附洗脫，先用10％乙醇除雜600ml，再用70％乙醇洗脫600ml，洗脫液于60℃減壓濃縮至流浸膏(密度1.05g/ml),加入正丁醇：乙酸乙酯(1:2)混合溶液萃取3次，每次300ml，分別收集萃取液及萃余液，萃取液通過(guò)結(jié)晶方法制備銀杏總內(nèi)酯，結(jié)晶后母液濃縮至無(wú)乙醇味,與萃余液合并，加入20L 30℃水溶液稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)6L聚酰胺樹(shù)脂(30-60目)保溫吸附2h，溫度40℃，用12L水洗至流出液近無(wú)色后，再用70％乙醇洗脫18L，洗脫液于60℃減壓濃縮(真空度為-0.09-0.1Mpa)至浸膏(密度1.10g/ml)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下80℃減壓干燥5h，最終得到銀杏總黃酮47.78g，經(jīng)檢測(cè)，銀杏黃酮醇苷含量為61.05％，銀杏總黃酮含量為80.54％，總黃酮回收率為71.16％，乙酸乙酯含量≤10ppm，正丁醇含量≤10ppm。
實(shí)施例7
取銀杏葉10kg，加入10倍銀杏葉重量的75％乙醇(m/V)回流提取2次，每次2h，合并乙醇提取液，60℃減壓濃縮(真空度-0.09-0.10MPa)至無(wú)醇味(密度1.05g/ml)，通過(guò)1.5L D-101樹(shù)脂吸附洗脫，先用10％乙醇除雜3L，再用70％乙醇洗脫4.5L，洗脫液于60℃減壓濃縮至流浸膏(密度1.05g/ml),加乙酸乙酯萃取3次，每次1L，分別收集萃取液及萃余液，萃取液通過(guò)結(jié)晶方法制備銀杏總內(nèi)酯，結(jié)晶后母液與萃余液合并，加入80L 30℃水溶液稀釋?zhuān)?0L聚酰胺樹(shù)脂(30-60目)保溫吸附1h，溫度45℃，用60L 5％乙醇洗至流出液近無(wú)色后，再用70％乙醇洗脫180L，洗脫液于60℃減壓濃縮(真空度為-0.09-0.1Mpa)至浸膏(密度1.10g/ml)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下80℃減壓干燥3h，最終得到銀杏總黃酮241.09g，經(jīng)檢測(cè)，銀杏黃酮醇苷含量為62.33％，銀杏總黃酮含量為81.28％，總黃酮回收率為65.04％，乙酸乙酯含量≤10ppm。
本發(fā)明方法研究設(shè)計(jì)的難點(diǎn)排除以及工藝設(shè)計(jì)試驗(yàn)：
一、最佳工藝研究設(shè)計(jì)：
(一)當(dāng)采用將萃取廢液直接濃縮，然后真空干燥的方式制備銀杏總黃酮，該方法操作簡(jiǎn)便省時(shí)，可快速回收得到銀杏總黃酮，且收率高，但是濃縮過(guò)程中無(wú)法將有機(jī)溶劑完全去除，有機(jī)溶劑殘留量較大，即使是長(zhǎng)時(shí)間加熱真空干燥也無(wú)法達(dá)到控制有機(jī)溶劑殘留量的滿意效果，且能耗高，總黃酮含量低，因此，該技術(shù)路線不可取?？傸S酮重量、總黃酮含量、總黃酮回收率、乙酸乙酯和正丁醇?xì)埩袅康臄?shù)據(jù)見(jiàn)表1。
(二)當(dāng)采用將萃取廢液直接上大孔吸附樹(shù)脂吸附和洗脫，然后減壓濃縮、干燥的方式制備銀杏總黃酮，銀杏總黃酮收率與含量偏低，究其原因是由于萃取廢液中有機(jī)溶劑濃度過(guò)高，導(dǎo)致上樣吸附不完全，降低收率，另外，由于大孔樹(shù)脂選擇性特點(diǎn)，對(duì)于銀杏總黃酮無(wú)特異性吸附，在富集銀杏總黃酮過(guò)程中會(huì)同時(shí)吸附其它雜質(zhì)成分，最終導(dǎo)致銀杏總黃酮收率與含量同時(shí)偏低?？傸S酮重量、總黃酮含量、總黃酮回收率、乙酸乙酯和正丁醇?xì)埩袅康臄?shù)據(jù)見(jiàn)表1。
(三)當(dāng)采用將萃取廢液直接上聚酰胺樹(shù)脂柱吸附洗脫，然后減壓濃縮、干燥的方式制備銀杏總黃酮，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示最終銀杏總黃酮中溶劑殘留量偏高，總黃酮回收率偏低。推測(cè)該方法由于萃取廢液中有機(jī)溶劑濃度過(guò)高，在聚酰胺樹(shù)脂上會(huì)與銀杏總黃酮產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，最終導(dǎo)致上樣過(guò)程中部分被有機(jī)溶劑洗脫，銀杏總黃酮收率偏低，而溶劑殘留量偏高?？傸S酮重量、總黃酮含量、總黃酮回收率、乙酸乙酯和正丁醇?xì)埩袅康臄?shù)據(jù)見(jiàn)表1。
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)控制萃取廢液的稀釋倍數(shù)與除雜體積，可改變成品的總黃酮含量和溶劑殘留量?jī)蓚€(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。
首先，萃取廢液稀釋倍數(shù)對(duì)上樣吸附過(guò)程、總黃酮的含量和溶劑殘留有很大影響，過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致最終制備的銀杏總黃酮達(dá)不到上述技術(shù)指標(biāo)，稀釋倍數(shù)過(guò)大，溶液中銀杏總黃酮濃度過(guò)低，過(guò)柱后聚酰胺不能最大程度吸附銀杏總黃酮成分，導(dǎo)致收率降低，相應(yīng)其它無(wú)效成分含量增加，實(shí)驗(yàn)過(guò)程工時(shí)延長(zhǎng)，不利于操作；稀釋倍數(shù)過(guò)小，溶液中有機(jī)溶劑濃度偏高，同上所述，會(huì)與銀杏總黃酮成分產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，最終導(dǎo)致制備出的銀杏總黃酮收率降低，而有機(jī)溶劑殘留量偏高。因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本發(fā)明萃取廢液最佳稀釋倍數(shù)為30-40倍萃取廢液體積(V/V)。
其次，除雜體積對(duì)過(guò)柱和總黃酮的含量和溶劑殘留也有很大影響，除雜體積過(guò)大，影響總黃酮損失嚴(yán)重，低極性黃酮類(lèi)成分會(huì)被洗脫，從而損失部分銀杏總黃酮類(lèi)成分；除雜體積過(guò)小，未能完全除掉聚酰胺樹(shù)脂吸附的有機(jī)溶劑，最終導(dǎo)致制備出的銀杏總黃酮中有機(jī)溶劑殘留量過(guò)高，因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出最佳除雜體積為2-4BV。
以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行具體說(shuō)明。
表1：不同制備方式對(duì)于最終銀杏總黃酮各項(xiàng)指標(biāo)的影響
注：均量取100ml萃取廢液進(jìn)行試驗(yàn)，下同。
綜上所述，最佳工藝為：萃取廢液稀釋后通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂富集洗脫。
二、最佳工藝中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行研究設(shè)計(jì)。
表2：?jiǎn)我蛩剌腿U液稀釋倍數(shù)對(duì)于銀杏總黃酮各指標(biāo)的影響
由表中數(shù)據(jù)可得出，當(dāng)萃取廢液稀釋體積在30-40倍(V/V)時(shí)，銀杏總黃酮各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求，其中萃取廢液稀釋體積優(yōu)選40倍(V/V)。
表3：?jiǎn)我蛩爻s體積對(duì)于銀杏總黃酮各指標(biāo)的影響
由表中數(shù)據(jù)可得出，當(dāng)除雜體積在2-4BV時(shí)，銀杏總黃酮各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求，優(yōu)選3BV。