專利名稱：松花粉超臨界萃取物中總黃酮含量的測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種松花粉超臨界萃取物中總黃酮含量的測定方法。
背景技術：
松花粉(PollenPini)是松科植物馬尾松(Pinus massonina lamb)、油松(Pinus tabulaefermiscarr)等植物于春季花剛開時將雄球采摘，曬干，搓下花粉，收集，除去雜質所得的淡黃色細花粉[參見ChP (中國藥典).2010. Vol 1(—部)191]。松花粉是天然的微型營養(yǎng)庫。作為優(yōu)良的保健食品，松花粉的營養(yǎng)成分可以分為糖、蛋白質、脂肪、維生素、 微量元素和生物活性物質六大類。其所含的多種酶、激素、黃酮以及豐富的磷脂等生物活性物質對人體的生命活動有重要的調節(jié)作用，具有抗衰老、抗疲勞、調節(jié)血脂、降血糖、護肝、 美容、減肥等多種藥理作用，是花粉產品中的佼佼者。松花粉活性成分復雜，雖被《中國藥典》收載，規(guī)定了制法、顯微鑒別和檢查項目， 但未對其活性有效成分的含量做出質控標準。目前的文獻表明松花粉中的黃酮類化合物多以甙的形式存在，具有多方面的生理活性。可有效清除體內的氧自由基，其阻止氧化的能力是維生素E的十倍以上，可阻止細胞的退化、衰老。所富含的磷脂更是具有顯著的降血脂等多種藥理活性。近20年來生物醫(yī)學研究表明磷脂具有調節(jié)生理機能、增強免疫力、防治心、腦、血管等疾病的作用。但磷脂遇熱不穩(wěn)定，給傳統的溶劑提取帶來困難。超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction, SFE)是近代分離領域出現的高新技術，除減少有機溶劑用量外，還有萃取效率和選擇性高、適用于熱不穩(wěn)定物質的提取、環(huán)境污染小、操作條件易于改變等特點，是一種較為理想的中藥活性物質提取方法。 對松花粉進行超臨界(X)2萃取，可以避免有機溶劑的殘留，提高產率，同時在提取過程中不易破壞松花粉中的有效活性物質，大大提高活性成分的萃取量。[參見邵興軍，丁德華， 酈宏巖等.超臨界CO2萃取松花粉中有效成分的方法.[P]中國專利200810155138. 3， 2009-03-18;馮武，范國棟，劉嘉寶.云南松花粉超臨界CO2脫脂研究.[J]云南林業(yè)科技· 2003，(1) :63ο ]松花粉超臨界萃取物作為具有廣闊市場前景的中藥提取物，制定其質量評價標準對其在中藥產業(yè)的發(fā)展有非常重要的意義，特別是針對其中多個典型活性成分建立有效的分析方法從而從總體上把握萃取物的質量情況尤為重要。目前，國內外尚未見針對松花粉超臨界萃取物進行黃酮類成分的含量測定文獻及專利。本發(fā)明首次針對超臨界流體萃取松花粉中的總黃酮建立了簡便可行的分析方法，為制定松花粉超臨界萃取物的質量標準提供了一個可靠的依據，同時也為進一步合理開發(fā)和綜合利用該萃取物提供了質量評價手段。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于設計提供一種針對超臨界流體萃取松花粉中總黃酮成分建立含量測定方法的技術方案。對萃取物中的總黃酮運用紫外可見分光光度法進行測定，簡便可行，準確度、精密度良好，能通過活性成分的含量測定把握萃取物的質量情況，可作為松花粉超臨界萃取物的質量評價依據。本發(fā)明的技術方案如下一種松花粉超臨界萃取物(SFE-PP)中總黃酮含量的測定方法，它包括如下步驟步驟1.標準儲備液的制備精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇溶解并定容至 100ml，配成150 μ g · ml-1的蘆丁標準儲備液；步驟2.供試樣品溶液的制備1.精密稱取松花粉超臨界萃取物2. OOOOg，用濾紙包緊置于平底燒瓶中，加入 IOOml 70%乙醇溶液，浸潤后在80°C水浴下回流2h，粗提液冷卻后減壓抽濾，用少量25% 乙醇洗滌燒瓶和濾渣，合并濾液，減壓蒸餾除去其中的乙醇，倒出燒瓶內溶液，抽濾，并用 30ml熱水分3次洗滌燒瓶，抽濾后，將濾液倒入分液漏斗中，以75ml三氯甲烷分3次萃取脫脂，收集水溶液，旋轉蒸發(fā)至干后加70%乙醇溶解后用于下述的柱層析加樣；2.取經預處理的聚酰胺樹脂粉末濕法裝柱，用水飽和，吸取上述脫脂后的樣品沿層析柱慢慢滴入柱內，放置一定時間，至待測液被充分吸附后，用70 %乙醇洗脫，收集洗脫液，上述洗脫液濃縮定容得供試樣品溶液，用于測定總黃酮的含量；步驟3.測定方法精密量取上述供試樣品溶液或蘆丁標準溶液適量于IOml容量瓶中，加30%乙醇液至5ml，加質量百分濃度為5%亞硝酸鈉溶液0. :3ml，振搖后放置5min， 加入質量百分濃度為10%硝酸鋁溶液0. 3ml搖勻后放置6min，加1. Omol · L—1氫氧化鈉溶液anl，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，以相應的試劑為空白，在510nm處測定吸光度；步驟4.結果計算以蘆丁標準溶液的測定數據制作標準曲線，以供試樣品溶液的測定數據對照標準曲線計算出樣品溶液中總黃酮的量。有益效果目前，針對松花粉及其提取物的藥理作用和活性成分的研究已有多篇文獻報道。 由于松花粉功效成分復雜，其質量評價散見于維生素、微量元素和部分單類活性物質的測定，評價內容的規(guī)范性和完整性尚有待完善。松花粉超臨界萃取物作為具有廣闊市場前景的中藥提取物，針對其中典型活性成分制定其質量評價方案對其在中藥產業(yè)的發(fā)展有非常重要的意義。目前，國內外尚未見針對松花粉超臨界萃取物進行黃酮類成分的含量測定的文獻及專利。本發(fā)明首次針對超臨界流體萃取松花粉中總黃酮建立了簡便可行的分析方案，準確度、精密度良好，為實現松花粉超臨界萃取物的質量可控提供了方法依據。


圖1為蘆丁標準品(1)及松花粉超臨界(X)2萃取物供試樣品O)的紫外掃描圖。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。一、實驗部分1.儀器與試藥UV-2401PC型紫外分光光度計(日本島津)；XT-102A型電子天平(瑞士 I^recisa)寸。松花粉超臨界(X)2萃取物(SFE-PP，江蘇江大源生態(tài)生物科技有限公司)；蘆丁對照品(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；其余試劑分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。2.實驗方法SFE-PP中總黃酮的含量測定2. 1標準儲備液的制備精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇溶解并定容至100ml， 配成150 μ g · mr1的蘆丁標準儲備溶液。2. 2供試樣品溶液的制備2. 2. 1精密稱取松花粉超臨界萃取物2. OOOOg，用濾紙包緊置于平底燒瓶中，加入 IOOml 70%乙醇溶液，浸潤后在80°C水浴下回流池。粗提液冷卻后減壓抽濾，用少量25% 乙醇洗滌燒瓶和濾渣，合并濾液。減壓蒸餾除去其中的乙醇。倒出燒瓶內溶液，抽濾，用30ml 熱水分3次洗滌燒瓶，抽濾后，將濾液倒入分液漏斗中，以75ml三氯甲烷分3次萃取脫脂， 待完全分層后，收集水溶液，旋轉蒸發(fā)至干后加70%乙醇溶解后用于加樣。2. 2. 2取經預處理的聚酰胺樹脂粉末濕法裝柱，用水飽和。吸取上述脫脂后的樣品沿層析柱慢慢滴入柱內，放置一定時間，至待測液被充分吸附后，用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，上述洗脫液濃縮定容即得供試樣品溶液，以用于測定總黃酮的含量。2. 3測定方法精密量取上述供試品溶液或蘆丁標準溶液適量于IOml量瓶中， 加30%乙醇至5ml，加5%亞硝酸鈉溶液0. :3ml，振搖后放置5min，加入10%硝酸鋁溶液 0. 3ml，搖勻后放置6min，加1. Omol · L-1氫氧化鈉溶液2ml，用30%乙醇定容至刻度，搖勻。 以相應的試劑為空白，在510nm處測定吸光度。2. 4結果計算以蘆丁標準溶液的測定數據制作標準曲線，以供試樣品溶液的測定數據對照標準曲線計算出樣品溶液中總黃酮的量。二、結果與討論1總黃酮含量測定實驗條件的優(yōu)化與驗證1. 1測定波長的選擇精密量取2. 1項下的蘆丁標準溶液和2. 2項下的供試樣品溶液適量于IOmL量瓶中，照2. 3測定方法加入試劑，以相應的試劑為空白，分別在200nm SOOnm范圍內進行掃描，以確定最大吸收波長。發(fā)現蘆丁標準品和SFE-PP樣品在510nm處均有最大吸收(見圖 1)，且峰形相似，因此選擇510nm為測定波長。1.2標準曲線的繪制精密量取蘆丁標準儲備液0. 50ml、1.00ml、2. 00ml、3. 00ml、4. OOml 置 IOmL 量瓶中，照2. 3測定方法加入試劑，以相應的試劑為空白，在510nm處測定吸光度，對所得數據進行回歸，求出回歸方程為y = 0. 0099x+0. 0289 (r = 0. 9990，η = 5)，結果表明，在實驗濃度范圍內蘆丁的吸光度與濃度呈良好的線性關系。1. 3精密度實驗精密吸取蘆丁標準儲備溶液1. 00ml,2. 00ml,4. OOml于IOml量瓶中，得低、中、高三個濃度分別為15、30、60μ g · πιΓ1的標準溶液，按2. 3項顯色。每個濃度平行測定5份， 以考察方法的日內精密度；以上三個濃度的標準溶液，每天測一次，連續(xù)5天，以考察方法的日間精密度。結果見表1。表1總黃酮精密度實驗結果(n = 5)
權利要求
1. 一種松花粉超臨界萃取物中總黃酮含量的測定方法，其特征是它包括如下步驟 步驟1.標準儲備液的制備精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇溶解并定容至100 ml, 配成150 yg πιΓ1的蘆丁標準儲備液； 步驟2.供試樣品溶液的制備精密稱取松花粉超臨界萃取物2.0 g，用濾紙包緊置于平底燒瓶中，加入100 ml 70%乙醇溶液，浸潤后在80°C水浴下回流2 h，粗提液冷卻后減壓抽濾，用少量25%乙醇洗滌燒瓶和濾渣，合并濾液，減壓蒸餾除去其中的乙醇，倒出燒瓶內溶液，抽濾，并用30 ml熱水分3 次洗滌燒瓶，抽濾后，將濾液倒入分液漏斗中，以75 ml三氯甲烷分3次萃取脫脂，收集水溶液，旋轉蒸發(fā)至干后加70%乙醇溶解后用于下述的柱層析加樣；取經預處理的聚酰胺樹脂粉末濕法裝柱，用水飽和，吸取上述脫脂后的樣品沿層析柱慢慢滴入柱內，放置一定時間，至待測液被充分吸附后，用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，上述洗脫液濃縮定容得供試樣品溶液，用于測定總黃酮的含量；步驟3.測定方法精密量取上述供試樣品溶液或蘆丁標準溶液適量于10 ml量瓶中， 加30%乙醇液至5 ml，加質量百分濃度為5%亞硝酸鈉溶液0.3 ml，振搖后放置5 min，加入質量百分濃度為10%硝酸鋁溶液0. 3 ml搖勻后放置6 min,加1. 0 mol 廠1氫氧化鈉溶液2 ml，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，以相應的試劑為空白，在510 nm處測定吸光度；步驟4.結果計算以蘆丁標準溶液的測定數據制作標準曲線，以供試樣品溶液的測定數據對照標準曲線計算出樣品溶液中總黃酮的量。
全文摘要
一種松花粉超臨界萃取物中總黃酮含量的測定方法，它是以蘆丁為標準，用70%乙醇提取松花粉超臨界萃取物，以聚酰胺樹脂層析柱分離出總黃酮，加5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液和1.0mol·L-1氫氧化鈉溶液顯色，以紫外光510nm處測定吸光度，測得總黃酮的含量。本發(fā)明針對超臨界流體萃取松花粉中總黃酮建立了簡便可行的分析方案，準確度、精密度良好，為實現松花粉超臨界萃取物的質量可控提供了方法依據。
文檔編號G01N1/40GK102426156SQ201110374429
公開日2012年4月25日 申請日期2011年11月22日 優(yōu)先權日2011年11月22日
發(fā)明者余江南, 徐希明, 童姍姍, 鄧倩 申請人:江蘇大學