專利名稱：松花粉超臨界萃取物中總磷脂含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種松花粉超臨界萃取物中總磷脂含量的測定方法。
背景技術(shù)：
松花粉(Pollen Pini)是松科植物馬尾松(Pinus massonina lamb)、油松 (Pinustabulaefermiscarr)等植物于春季花剛開時(shí)將雄球采摘，曬干，搓下花粉，收集，除去雜質(zhì)所得的淡黃色細(xì)花粉[參見=ChP(中國藥典).2010. Vol I (—部)191]。松花粉是天然的微型營養(yǎng)庫。作為優(yōu)良的保健食品，松花粉的營養(yǎng)成分可以分為糖、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、微量元素和生物活性物質(zhì)六大類。其所含的多種酶、激素、黃酮以及豐富的磷脂等生物活性物質(zhì)對(duì)人體的生命活動(dòng)有重要的調(diào)節(jié)作用，具有抗衰老、抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂、降血糖、 護(hù)肝、美容、減肥等多種藥理作用，是花粉產(chǎn)品中的佼佼者。松花粉活性成分復(fù)雜，雖被《中國藥典》收載，規(guī)定了制法、顯微鑒別和檢查項(xiàng)目， 但未對(duì)其活性有效成分的含量做出質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。目前的文獻(xiàn)表明松花粉所富含的磷脂具有顯著的降血脂等多種藥理活性。近20年來生物醫(yī)學(xué)研究也充分證明磷脂具有調(diào)節(jié)生理機(jī)能、增強(qiáng)免疫力、防治心、腦、血管等疾病的作用。但磷脂遇熱不穩(wěn)定，給傳統(tǒng)的溶劑提取帶來困難。超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction, SFE)是近代分離領(lǐng)域出現(xiàn)的高新技木，除減少有機(jī)溶劑用量外，還有萃取效率和選擇性高、適用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的提取、環(huán)境污染小、操作條件易于改變等特點(diǎn)，是ー種較為理想的中藥活性物質(zhì)提取方法。 對(duì)松花粉進(jìn)行超臨界(X)2萃取，可以避免有機(jī)溶劑的殘留，提高產(chǎn)率，同時(shí)在提取過程中不易破壞松花粉中的有效活性物質(zhì)，大大提高活性成分的萃取量。[參見邵興軍，丁德華， 酈宏巖等.超臨界CO2萃取松花粉中有效成分的方法.[P]中國專利200810155138. 3， 2009-03-18;馮武，范國棟，劉嘉寶.云南松花粉超臨界CO2脫脂研究.[J]云南林業(yè)科技· 2003，(1) :63ο ]松花粉超臨界萃取物作為具有廣闊市場前景的中藥提取物，制定其質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其在中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有非常重要的意義，特別是針對(duì)其中典型活性成分建立有效的分折方法從而從總體上把握萃取物的質(zhì)量情況尤為重要。目前，國內(nèi)外尚未見針對(duì)松花粉超臨界萃取物進(jìn)行磷脂類成分的含量測定文獻(xiàn)及專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種針對(duì)超臨界流體萃取松花粉中總磷脂成分建立含量測定方法的技術(shù)方案。本發(fā)明的技術(shù)方案如下ー種松花粉超臨界萃取物中總磷脂含量的測定方法，它包括如下步驟1.標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備精密稱取磷酸ニ氫鉀適量，加雙蒸水溶解，配制成 0. 05mg · ml—1的磷酸ニ氫鉀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(含磷0. OlHmg · ml—1)；
2.供試樣品溶液的制備2. 1.精密稱取松花粉超臨界萃取物5. OOOOg，測定，放入IOOml圓底燒瓶中，加入 60ml三氯甲烷-甲醇混合液(v/v，2 1)，于60°C水浴中提取lh，提取結(jié)束后，取下圓底燒瓶，用布氏漏斗過濾，濾液用250ml圓底燒瓶收集，用三氯甲烷-甲醇混合液洗滌燒瓶、濾器及濾器中的試樣殘?jiān)?，洗滌液并入濾液中，置于65 70°C水浴中回收溶剤，至圓底燒瓶內(nèi)物料顯濃稠態(tài)，冷卻，用移液管加入25ml石油醚，再加入15g無水硫酸鈉，立刻加塞振蕩 lOmin，將醚層移入具塞離心管中，以3000r · mirT1離心5min進(jìn)行分離，用移液管迅速吸取離心管中澄清的醚層10ml，蒸發(fā)去除石油醚后，于100 105°C烘箱中烘至衡重，將其用三氯甲烷定容于25ml量瓶中，即得供試樣品溶液以測定總磷脂的含量；2. 2磷顯色液的制備:3mol ·じ1硫酸-水-2. 5%鉬酸銨-10%抗壞血酸(ν/ν/ν/ ν,Ι 5 1 1)配制而成的溶液，配制時(shí)按上述硫酸、水、鉬酸銨和抗壞血酸的順序加入， 且當(dāng)天使用；3.測定方法精密量取上述供試樣品溶液或磷標(biāo)準(zhǔn)液適量于IOml容量瓶中，水浴上揮干溶剤，加0. 25ml質(zhì)量百分濃度為70%高氯酸置沸水浴中消化，消化完全后，用磷顯色液定容至刻度，搖勻后放入70°C水浴中加熱IOmin后立即取出冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在315nm處測定吸光度；4.結(jié)果計(jì)算以磷酸ニ氫鉀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的測定數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以供試樣品溶液的測定數(shù)據(jù)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品溶液中總磷脂的量。方法建立后分別對(duì)料液比、消化反應(yīng)時(shí)間兩個(gè)顯色條件進(jìn)行考察，確定消化反應(yīng)最佳料液比為4 10，消化時(shí)間池為最優(yōu)。有益效果目前，針對(duì)松花粉及其提取物的藥理作用和活性成分的研究已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道。 由于松花粉功效成分復(fù)雜，其質(zhì)量評(píng)價(jià)散見于維生素、微量元素和部分單類活性物質(zhì)的測定，評(píng)價(jià)內(nèi)容的規(guī)范性和完整性尚有待完善。松花粉超臨界萃取物作為具有廣闊市場前景的中藥提取物，針對(duì)其中典型活性成分制定其質(zhì)量評(píng)價(jià)方案對(duì)其在中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有非常重要的意義。目前，國內(nèi)外尚未見針對(duì)松花粉超臨界萃取物進(jìn)行黃酮及磷脂類成分的含量測定的文獻(xiàn)及專利。本發(fā)明首次針對(duì)超臨界流體萃取松花粉中總磷脂分別建立了簡便可行的分析方案，準(zhǔn)確度、精密度良好，為實(shí)現(xiàn)松花粉超臨界萃取物的質(zhì)量可控提供了方法依據(jù)。


圖1為磷標(biāo)準(zhǔn)液(1)及松花粉超臨界(X)2萃取物供試品(2)紫外掃描圖。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說明。SFE-PP中總磷脂的含量測定1.儀器與試藥UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)(日本島津)；XT-102A型電子天平(瑞士 I^recisa)等。
松花粉超臨界(X)2萃取物(SFE-PP，江蘇江大源生態(tài)生物科技有限公司)；蘆丁對(duì)照品(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；其余試劑分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。2.實(shí)驗(yàn)方法2. 1.標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備精密稱取磷酸ニ氫鉀適量，加雙蒸水溶解，配制成 0. 05mg · ml—1的磷酸ニ氫鉀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(含磷0. OlHmg · ml-1)；2. 2.供試品溶液的制備精密稱取松花粉超臨界萃取物5. OOOOg,放入IOOml圓底燒瓶中，加入60ml三氯甲烷-甲醇混合液(v/v，2 1)，于60°C水浴中提取lh，提取結(jié)束后，取下圓底燒瓶，用布氏漏斗過濾，濾液用250ml圓底燒瓶收集，用三氯甲烷-甲醇混合液洗滌燒瓶、濾器及濾器中的試樣殘?jiān)?，洗滌液并入濾液中，置于65 70°C水浴中回收溶剤， 至圓底燒瓶內(nèi)物料顯濃稠態(tài)，冷卻，用移液管加入25ml石油醚，再加入15g無水硫酸鈉，立刻加塞振蕩lOmin，將醚層移入具塞離心管中，以SOOOi^mirr1離心5min進(jìn)行分離，用移液管迅速吸取離心管中澄清的醚層10ml，蒸發(fā)去除石油醚后，于100 105°C烘箱中烘至衡重，將其用三氯甲烷定容于25ml量瓶中，即得供試品溶液以測定總磷脂的含量；2. 3磷顯色液的制備3mol ·じ1硫酸-水-2. 5%鉬酸銨-10%抗壞血酸(ν/ν/ν/ ν,Ι 5 1 1)配制而成的溶液，配制時(shí)按上述順序加入，且當(dāng)天使用；2. 4測定方法精密量取上述供試樣品溶液或磷酸ニ氫鉀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量于IOml 量瓶中，水浴上揮干溶剤，加0. 25ml 70%高氯酸置沸水浴中消化，消化完全后，用磷顯色液定容至刻度，搖勻后放入70°C水浴中精確恒溫IOmin后立即取出冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在315nm處測定吸光度；2. 5.結(jié)果計(jì)算以磷酸ニ氫鉀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的測定數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以供試樣品溶液的測定數(shù)據(jù)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品溶液中總磷脂的量。3.結(jié)果與討論3. 1總磷脂含量測定實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化與驗(yàn)證3. 1. 1.測定波長的選擇精密量取2. 1項(xiàng)下的磷標(biāo)準(zhǔn)液和2. 2項(xiàng)下的供試品溶液適量于IOml量瓶中，照 2. 4測定方法加入試劑，以相應(yīng)的試劑為空白，分別在200nm SOOnm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以確定最大吸收波長。發(fā)現(xiàn)磷標(biāo)準(zhǔn)液和SFE-PP樣品在315nm處均有最大吸收(見圖1)，且峰形相似，因此選擇315nm為測定波長。3. 1.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0. 30ml,0. 60ml,0. 90ml、1. 20ml、1. 50ml 置 IOml 量瓶中， 照2. 4測定方法加入試劑，以相應(yīng)的試劑為空白，在315nm處測定吸光度，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸，求出回歸方程為y = 0. 3939X+0. 0041 (r = 0. 9997,η = 5)，結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)磷標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。3. 1. 3精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0. 30ml,0. 90mlU. 50ml于IOml量瓶中，得低、中、高三個(gè)濃度分別為0. 342、1. 026、1. 710 μ g -πιΓ1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2. 4項(xiàng)顯色，每個(gè)濃度平行測定 5份，以考察方法的日內(nèi)精密度；以上三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每天測一次，連續(xù)5天，以考察方法的日間精密度。結(jié)果見表1。表1總磷脂精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n = 5)
權(quán)利要求
1.ー種松花粉超臨界萃取物中總磷脂含量的測定方法，其特征是它包括如下步驟 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備精密稱取磷酸ニ氫鉀適量，加雙蒸水溶解，配制成0. 05 mg ml—1的磷酸ニ氫鉀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(含磷0. 0114 mg πιΓ1)； 供試樣品溶液的制備精密稱取松花粉超臨界萃取物5. 0000 g，放入100 ml圓底燒瓶中，加入60 ml三氯甲烷-甲醇混合液(v/v，2 1)，于60°C水浴中提取1 h，提取結(jié)束后，取下圓底燒瓶，用布氏漏斗過濾，濾液用250 ml圓底燒瓶收集，用三氯甲烷-甲醇混合液洗滌燒瓶、濾器及濾器中的試樣殘?jiān)?，洗滌液并入濾液中，置于65KTC水浴中回收溶剤，至圓底燒瓶內(nèi)物料顯濃稠態(tài)，冷卻，用移液管加入25 ml石油醚，再加入15 g無水硫酸鈉，立刻加塞振蕩10 min，將醚層移入具塞離心管中，以3000 r · HiirT1離心5 min進(jìn)行分離，用移液管迅速吸取離心管中澄清的醚層10 ml，蒸發(fā)去除石油醚后，于10(T105°C烘箱中烘至衡重，將其用三氯甲烷定容于25 ml量瓶中，即得供試樣品溶液以測定總磷脂的含量；
2.磷顯色液的制備3mol じ1硫酸-水-2. 5%鉬酸銨-10%抗壞血酸(v/v/v/v， 1:5:1: 1)配制而成的溶液，配制時(shí)按上述硫酸、水、鉬酸銨和抗壞血酸的順序加入，且當(dāng)天使用；測定方法精密量取上述供試樣品溶液或磷標(biāo)準(zhǔn)液適量于10 ml容量瓶中，水浴上揮干溶剤，加0.25 ml質(zhì)量百分濃度為70%高氯酸置沸水浴中消化，消化完全后，用磷顯色液定容至刻度，搖勻后放入70°C水浴中加熱10 min后立即取出冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在315 nm處測定吸光度；結(jié)果計(jì)算以磷酸ニ氫鉀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的測定數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以供試樣品溶液的測定數(shù)據(jù)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品溶液中總磷脂的量。
全文摘要
一種松花粉超臨界萃取物中總磷脂含量的測定方法，它是以磷酸二氫鉀作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，以紫外光譜儀315nm處測得吸光度作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；精密稱取松花粉超臨界萃取物，加入三氯甲烷-甲醇混合液(v/v,2∶1)，提取，過濾，回收溶劑至濃稠態(tài)，冷卻，定量加入石油醚，再加入15g無水硫酸鈉，以3000r·min-1離心分離，醚層蒸發(fā)去除石油醚后，烘箱中烘至衡重，以70%高氯酸溶液置沸水浴中消化，消化完全后，用磷顯色液定容至刻度，以相應(yīng)的試劑為空白，在315nm處測定吸光度，測得松花粉超臨界萃取物中總磷脂含量。本發(fā)明首次針對(duì)超臨界流體萃取松花粉中總磷脂分別建立了簡便可行的分析方案，準(zhǔn)確度、精密度良好，為實(shí)現(xiàn)松花粉超臨界萃取物的質(zhì)量可控提供了方法依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102564978SQ201110374368
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月22日
發(fā)明者余江南, 徐希明, 童姍姍, 鄧倩 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)