本發(fā)明涉及一種藥物聯(lián)合應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種鮮冬蟲夏草抗腫瘤化療的聯(lián)合藥物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是目前危害人類生存和健康的主要疾病之一，其治療手段主要包括手術(shù)、化療和放療。其中，手術(shù)治療會(huì)受到病情的發(fā)展程度、病人的體質(zhì)、有無其它疾病等條件的限制，通過手術(shù)等物理方式切除腫瘤，只能治標(biāo)而并不能治本。而放療作為治療惡性腫瘤的一個(gè)重要手段，雖能產(chǎn)生很好的效果，但是會(huì)產(chǎn)生放射性皮炎、放射性食管炎以及食欲下降、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉或免疫力下降等諸多毒副作用?；瘜W(xué)治療是目前惡性腫瘤綜合治療中較為有效而又普遍使用的方法之一，但單純化療常引起免疫抑制和其他諸多不良反應(yīng)和毒副作用，導(dǎo)致惡性反復(fù)感染，預(yù)后不良而加速患者的死亡等不良反應(yīng)。如順鉑類化療藥物作為第一代抗腫瘤鉑類藥物對(duì)生殖系統(tǒng)癌癥、頭頸癌和骨肉瘤等有非常好的治療效果，在臨床化療或聯(lián)合化療治療惡性腫瘤藥物中所占比例為70％～80％，另外，對(duì)肺癌、胃癌、間皮瘤等實(shí)體腫瘤的臨床治療也能起到一定的作用，但是單獨(dú)使用順鉑類藥物會(huì)引起一定的副作用，例如嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)、腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性，長期單獨(dú)使用也會(huì)導(dǎo)致越來越嚴(yán)重的耐藥性。因此，研發(fā)高效低毒，易于推廣的可用于化療增效減毒雙重作用的天然中藥成為臨床亟待解決的問題。冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，是我國特產(chǎn)的名貴中藥，含有核苷、多糖、蛋白、氨基酸等多種活性成分，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為具有補(bǔ)肺益腎、止血化痰等功效。已有大量研究表明，冬蟲夏草具有抗疲勞、耐缺氧能力、抗病毒，對(duì)肝、肺、腎、心血管、免疫、神經(jīng)等均有一定的調(diào)節(jié)作用，對(duì)黑色素瘤、胃癌、肺癌、甲狀腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用。然而，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道都以陰干、烘干或者曬干冬蟲夏草或者以冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液、蟲草花等為研究材料，且多采用煮沸、高溫超聲或回流提取獲得提取物，這些處理方法可能會(huì)造成部分活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致冬蟲夏草的藥理活性受到影響。目前很少有冬蟲夏草聯(lián)合化學(xué)藥物抗肺部腫瘤的相關(guān)報(bào)道。如文獻(xiàn)《冬蟲夏草水煎劑聯(lián)合順鉑對(duì)荷瘤小鼠抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究》記載采用常規(guī)法高溫加熱煎煮獲得冬蟲夏草水煎劑，并聯(lián)合順鉑研究對(duì)結(jié)腸癌HCTB荷瘤小鼠的抑瘤作用，結(jié)果顯示冬蟲夏草水煎劑聯(lián)合順鉑能減輕接種HCTB荷瘤小鼠瘤體質(zhì)量，而未提及冬蟲夏草減輕順鉑的毒性作用。文獻(xiàn)《冬蟲夏草聯(lián)合NP方案治療晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床觀察》中報(bào)道采用冬蟲夏草顆粒(由日本國小林制藥(株)中央研究所研究部提供，應(yīng)為冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體)聯(lián)合多種化療藥物包括NP方案中的長春瑞濱、順鉑治療晚期非小細(xì)胞肺癌，該治療方案聯(lián)合使用多個(gè)化療藥物不僅成本高、而且使用冬蟲夏草發(fā)酵產(chǎn)物，活性物質(zhì)也不明確，且發(fā)現(xiàn)治療組有效率、受益率僅為35.5％和58.8％，只是略高于僅服用化療藥物不服用冬蟲夏草顆粒的對(duì)照組，治療組生活質(zhì)量卡氏評(píng)分變化也不是很大，此外治療組還產(chǎn)生了一定毒副反應(yīng)如出現(xiàn)惡心嘔吐、感染。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種鮮冬蟲夏草抗腫瘤化療的聯(lián)合藥物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的鮮冬蟲夏草不經(jīng)過曬干、烘干處理，并提供一種高效的提取方法。本發(fā)明所涉及的抗腫瘤化療的聯(lián)合藥物中的鮮冬蟲夏草提取物，與順鉑聯(lián)合用藥不僅有增效的作用，同時(shí)對(duì)腫瘤化療引起的肝腎組織損傷也具有保護(hù)作用，具有較好的開發(fā)前景。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一方面，本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草抗腫瘤化療的聯(lián)合藥物，包括鮮冬蟲夏草提取物和順鉑，其中所述鮮冬蟲夏草提取物是以鮮冬蟲夏草為原料，以水為提取溶劑，采用閃式提取和超濾獲得。在一些實(shí)施例中，其中所述鮮冬蟲夏草提取物是以新鮮采收的冬蟲夏草為原料，以水為提取溶劑，控制溫度在20℃～25℃，采用閃式提取，然后離心，收集上清液后超濾，并進(jìn)行冷凍干燥處理所得。在一些實(shí)施例中，其中所述鮮冬蟲夏草提取物的制備方法包括以下步驟：a、將鮮冬蟲夏草剪碎，按鮮冬蟲夏草和水的重量體積比加入1:10～12g/mL的水，浸泡3h～5h，控制溫度為20℃～25℃；b、將浸泡后的鮮冬蟲夏草置于閃式提取器中提取，然后離心，收集上清液，控制溫度為20℃～25℃；c、將離心后的沉淀再加水，冷凍，再快速凍融，然后重復(fù)步驟b，進(jìn)行閃式提取，離心，收集上清液；d、將步驟b和步驟c所收集的上清液合并，加水稀釋后，過濾，之后進(jìn)行超濾；e、將超濾后的保留液進(jìn)行冷凍干燥，得到鮮冬蟲夏草提取物。在一些實(shí)施例中，其中在步驟b中，所述的閃式提取的條件為：閃式提取2次，每次提取時(shí)間為80s～120s，轉(zhuǎn)速為8000rpm～10000rpm，電壓為120V～160V；所述的離心的條件為：離心時(shí)間為15min，離心的轉(zhuǎn)速為10000rpm～12000rpm。在一些實(shí)施例中，其中在步驟c中，所述的沉淀和稀釋用水的重量體積比為1:10～12g/mL；所述的冷凍溫度為-20℃，冷凍時(shí)間為4h。在一些實(shí)施例中，其中在步驟d中，所述上清液與水的體積比為1:4；所述的過濾的介質(zhì)，是0.45μm的微膜；所述超濾的條件為：使用截留分子量大于5KDa的超濾膜，設(shè)定溫度為25℃，時(shí)間為15min，壓力為0.08KPa。在一些實(shí)施例中，其中所述鮮冬蟲夏草提取物的制備方法包括下述步驟：a、將鮮冬蟲夏草洗凈瀝干，剪碎至長度為0.2cm內(nèi)，按鮮冬蟲夏草與水的重量體積比加入1:10～1:12的水，浸泡3h～5h，控制溫度為20℃～25℃；b、將浸泡后的鮮冬蟲夏草置于閃式提取器中，閃式提取2次，每次提取時(shí)間為80s～120s，轉(zhuǎn)速為8000rpm～10000rpm，電壓為120V～160V，然后離心15min，離心的轉(zhuǎn)速為10000rpm～12000rpm，取上清液，控制溫度為20℃～25℃；c、將離心后的沉淀，按沉淀與水的重量體積比再加入1:10～1:12的水，置于-20℃的環(huán)境下冷凍4h，再快速凍融，然后重復(fù)步驟b，進(jìn)行閃式提取，離心，收集上清液；d、將步驟b和步驟c所收集的上清液合并，加水稀釋4倍，使用0.45μm微膜過濾，之后使用截留分子量大于5KDa的超濾膜，設(shè)定溫度為25℃，時(shí)間為15min，壓力為0.08KPa進(jìn)行超濾；e、將超濾后的保留液進(jìn)行冷凍干燥，得到鮮冬蟲夏草提取物。另一方面，本發(fā)明提供了一種本發(fā)明所述的聯(lián)合藥物在制備腫瘤化療藥物中的應(yīng)用。在一些實(shí)施例中，其中所述腫瘤化療藥物對(duì)肺癌Lewis細(xì)胞具有抑制作用。在一些實(shí)施例中，其中所述腫瘤化療藥物對(duì)腫瘤化療引起的肝腎組織損傷具有保護(hù)作用。本發(fā)明所述的聯(lián)合藥物不限于其最終給予患者服用時(shí)的狀態(tài)，可以為口服液或者膠囊劑型、片劑等形式。本發(fā)明的積極效果：1.鮮冬蟲夏草藥理活性研究尚處于空白領(lǐng)域，本發(fā)明采用閃式提取器在控制低溫條件下提取鮮冬蟲夏草中的大分子化學(xué)成分，很好的發(fā)揮了其藥用功效。2.本發(fā)明是首次發(fā)現(xiàn)鮮冬蟲夏草冷水提取物與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)肺部腫瘤化療具有顯著的協(xié)同增效和減毒的作用。3.本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)鮮冬蟲夏草冷水提取物與順鉑聯(lián)合對(duì)腫瘤化療引起的肝腎組織損傷具有保護(hù)作用。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。鮮冬蟲夏草來源：宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司新鮮采收。超聲儀器來源及參數(shù)：KQ-500DB數(shù)控超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)，功率：500W；超聲頻率：40KHz。離心設(shè)備來源：272R-3超大容量冷凍離心機(jī)(湖南湘離儀器廠)一、制備實(shí)施例實(shí)施例1取鮮冬蟲夏草10g，洗凈后剪碎至長度為0.2cm內(nèi)，加入100mL去離子水浸泡3h，控制溫度在20℃～25℃。將浸泡后的鮮冬蟲夏草置于閃式提取器中，控制溫度在20℃～25℃，電壓為120V，轉(zhuǎn)速為8000rpm，時(shí)間為80s。10000rpm離心15min，收集上清液。將殘?jiān)糜?20℃環(huán)境中冷凍4h，再快速凍融。之后加入100mL去離子水，再置于閃式提取器中提取，離心，收集上清液。合并兩次的上清液。將上清液加去離子水稀釋4倍后，經(jīng)0.45μm微膜過濾，之后使用超濾膜進(jìn)行超濾，截留分子量大于5KDa的成分，設(shè)定溫度為25℃，時(shí)間為15min，壓力為0.08KPa。最后將超濾之后的保留液進(jìn)行冷凍干燥，得到鮮冬蟲夏草提取物1.62g，提取率為16.2％。實(shí)施例2取鮮冬蟲夏草10g，洗凈后剪碎至長度為0.2cm內(nèi)，加入120mL去離子水浸泡5h，控制溫度在20℃～25℃。將浸泡后的鮮冬蟲夏草置于閃式提取器中，控制溫度在20℃～25℃，電壓為160V，轉(zhuǎn)速為10000rpm，時(shí)間為120s。12000rpm離心15min，收集上清液。將殘?jiān)糜?20℃環(huán)境中冷凍4h再快速凍融。之后加入120mL去離子水再置于閃式提取器中提取，離心，收集上清液。合并兩次的上清液。將上清液加去離子水稀釋4倍后，經(jīng)0.45μm微膜過濾，之后使用超濾膜進(jìn)行超濾，截留分子量大于5KDa的成分，設(shè)定溫度為25℃，時(shí)間為15min，壓力為0.08KPa。最后將超濾之后的保留液進(jìn)行冷凍干燥，得到鮮冬蟲夏草提取物1.55g，提取率為15.5％。實(shí)施例3取鮮冬蟲夏草10g，洗凈后剪碎至長度為0.2cm內(nèi)，冷凍干燥，控制溫度在20℃～25℃下進(jìn)行超微粉碎，再加入100mL去離子水90℃水浴中提取1.5h，過濾。殘?jiān)偌尤?00mL去離子水90℃水浴提取一次，過濾后合并提取液。經(jīng)0.45μm微膜過濾，保留濾液，進(jìn)行冷凍干燥，得到鮮冬蟲夏草提取物1.60g，提取率為16.0％。二、測(cè)試實(shí)施例試驗(yàn)1、鮮冬蟲夏草提取物在抗腫瘤減毒增效作用研究中的應(yīng)用1.實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來自湖南斯萊克的SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠，體重范圍為18g～20g。動(dòng)物購進(jìn)后，先在檢疫室觀察一周，然后移入SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。取實(shí)施例1的鮮冬蟲夏草冷提取物和實(shí)施例3的鮮冬蟲夏草熱提取物，加去離子水溶解，分別制成濃度為20mg/mL、80mg/mL的藥物濃度。冬蟲夏草提取物采用灌胃給藥，小鼠灌胃體積為10mL/kg，按照低劑量為200mg/kg，高劑量800mg/kg，每天給藥一次；順鉑采用腹腔注射給藥，腹腔注射體積為1mL/kg，給藥劑量為2mg/kg，隔天給藥。2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(1)細(xì)胞培養(yǎng)將小鼠Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10％新鮮胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中連讀培養(yǎng)。至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％胰酶常規(guī)消化，將細(xì)胞調(diào)整為1×106個(gè)/mL的懸液。(2)動(dòng)物分組、肺癌小鼠模型的建立及給藥根據(jù)動(dòng)物體重進(jìn)行隨機(jī)分為A、B、C、D、E、F共6個(gè)組，分別代表模型組、順鉑組(2mg/kg)、順鉑(2mg/kg)+鮮冬蟲夏草熱提取物低劑量組(200mg/kg)、順鉑(2mg/kg)+鮮冬蟲夏草熱提取物高劑量組(800mg/kg)、順鉑(2mg/kg)+鮮冬蟲夏草冷提取物低劑量組(200mg/kg)、順鉑(2mg/kg)+鮮冬蟲夏草冷提取物高劑量(800mg/kg)，每組15只動(dòng)物，共90只。實(shí)驗(yàn)開始前7天，C、D、E、F組小鼠每天灌胃給予相應(yīng)劑量的鮮冬蟲夏草提取物，A組和B組每天灌胃給予等量去離子水。第8天，A、B、C、D、E、F6個(gè)組小鼠都在左肢腋下皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞1×106/只，同時(shí)C、D、E、F組小鼠灌胃給于相應(yīng)劑量的鮮冬蟲夏草提取物，A、B組小鼠灌胃給于等量去離子水。第9天后，B組小鼠只腹腔注射2mg/kg順鉑溶液，隔天給藥；C組小鼠：配制200mg/kg的鮮冬蟲夏草熱提取物灌胃給藥，連續(xù)20天，同時(shí)配制2mg/kg順鉑溶液腹腔注射，隔天給藥；D組小鼠：配制800mg/kg的鮮冬蟲夏草熱提取物灌胃給藥，連續(xù)20天，同時(shí)配制2mg/kg順鉑溶液腹腔注射，隔天給藥；E組小鼠：配制200mg/kg的鮮冬蟲夏草冷提取物灌胃給藥，連續(xù)20天，同時(shí)配制2mg/kg順鉑溶液腹腔注射，隔天給藥；F組小鼠：配制800mg/kg的鮮冬蟲夏草冷提取物灌胃給藥，連續(xù)20天，同時(shí)配制2mg/kg順鉑溶液腹腔注射，隔天給藥；A組小鼠每天灌胃給予等量生理鹽水。第28天給藥24h后，稱量各組小鼠體重后摘眼球取血，放置4h后離心，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶(ASTL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALTL)、尿素氮(UREAL)、血肌酐(CREA2)。脫頸椎處死小鼠，剝離瘤塊并稱取瘤質(zhì)量、臟器質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率、臟器系數(shù)。其中，抑瘤率計(jì)算公式為：抑瘤率/％＝(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100％，臟器系數(shù)計(jì)算公式為：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，用SPSS16進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)行單因素方差分析，并計(jì)算p值。3.結(jié)果(1)增效結(jié)果鮮冬蟲夏草提取物對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞生長的影響及對(duì)順鉑增效作用如表1所示：表1鮮冬蟲夏草提取物對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞生長的影響及對(duì)順鉑增效作用組別劑量/mg·kg-1腫瘤重量(g)抑瘤率(％)A.模型給藥組-3.27±0.42**-B.順鉑給藥組21.77±0.2245.9C.(實(shí)施例3+順鉑)給藥組200+22.09±0.4336.1D.(實(shí)施例3+順鉑)給藥組800+21.58±0.2645.7E.(實(shí)施例1+順鉑)給藥組200+21.19±0.20*63.6F.(實(shí)施例1+順鉑)給藥組800+21.08±0.28*67.0注：與順鉑組相比較：*p＜0.05，**p＜0.01；“-”表示無。由表1數(shù)據(jù)可知，與順鉑給藥組相比，實(shí)施例1(鮮冬蟲夏草冷提取物)聯(lián)合順鉑給藥組能降低腫瘤的重量，并且顯示出顯著性差異(*p＜0.05)，抑瘤率高達(dá)67％，說明鮮冬蟲夏草冷提取物能增強(qiáng)順鉑的療效，并且與順鉑組相比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，實(shí)施例3(鮮冬蟲夏草熱提取物)聯(lián)合順鉑給藥組相比順鉑組不僅沒有降低腫瘤的質(zhì)量，且抑瘤率有一定程度的降低，表明鮮冬蟲夏草熱提取物聯(lián)合順鉑給藥相比順鉑組不能降低肺癌小鼠的腫瘤重量，鮮冬蟲夏草熱取提物對(duì)輔助治療腫瘤化療沒有達(dá)到增效作用。(2)減毒結(jié)果鮮冬蟲夏草聯(lián)合順鉑給藥對(duì)肺癌小鼠的臟器系數(shù)的影響如表2所示：表2鮮冬蟲夏草聯(lián)合順鉑給藥對(duì)肺癌小鼠的臟器系數(shù)的影響注：與順鉑組相比較：*p＜0.05，**p＜0.01；“-”表示無。由表2可知，實(shí)施例1(鮮冬蟲夏草冷提取物)與順鉑聯(lián)合用藥后能明顯改善順鉑導(dǎo)致的肺癌小鼠臟器萎縮的狀況，其中實(shí)施例1(鮮冬蟲夏草冷提取物)的減毒作用比實(shí)施例3(鮮冬蟲夏草熱提取物)更明顯，尤其對(duì)脾臟和胸腺作用更明顯。表明鮮冬蟲夏草冷提取物可對(duì)抗化療藥物順鉑所致的免疫抑制，促進(jìn)機(jī)體免疫功能的恢復(fù)，從而可提高機(jī)體的抗腫瘤作用。(3)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果鮮冬蟲夏草聯(lián)合順鉑給藥對(duì)肺癌小鼠生化指標(biāo)的影響如表3所示：表3鮮冬蟲夏草聯(lián)合順鉑給藥對(duì)肺癌小鼠生化指標(biāo)的影響注：與順鉑組相比較：*p＜0.05，**p＜0.01；由表3數(shù)據(jù)可知，與順鉑給藥組對(duì)比，實(shí)施例1(鮮冬蟲夏草冷提取物)與聯(lián)合順鉑給藥，ASTL、ALTL、UREAL、CREA2含量顯著降低(ALTL、UREAL、CREA2含量的*p＜0.05)，說明本發(fā)明所述的鮮冬蟲夏草提取物聯(lián)合順鉑可以保護(hù)抗腫瘤活性藥物引起的肝腎損傷；而實(shí)施例3(鮮冬蟲夏草熱提取物)+順鉑給藥組，ASTL、ALTL、UREAL、CREA2含量無顯著差異，說明鮮冬蟲夏草熱提取物對(duì)保護(hù)抗腫瘤活性藥物引起的肝腎損傷的效果不是很明顯。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。本發(fā)明所引用的所有出版物或?qū)＠紝⒆鳛楸景l(fā)明的參考文獻(xiàn)。當(dāng)前第1頁1 2 3