本發(fā)明專利屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種具有健胃整腸益生作用的復(fù)合微生態(tài)制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著時(shí)代的進(jìn)步，社會(huì)的發(fā)展速度越來越快。面對(duì)著各種生活和工作壓力，人們不得不適應(yīng)時(shí)代發(fā)展的潮流，緊跟社會(huì)發(fā)展的步伐。這樣快節(jié)奏的生活方式給人們的身心健康帶來了極大的影響，尤其是飲食和起居的不規(guī)律導(dǎo)致現(xiàn)代人普遍患有嚴(yán)重的腸胃疾病，在損害了自己的身體健康的同時(shí)，也影響了人們正常的生活和工作。胃腸道菌群是維持人體健康的必要因素，生理?xiàng)l件下胃腸道菌群除具有一定的“定植抗力”外，還可提供維生素，合成消化酶，參與蛋白質(zhì)的代謝，降解膽固醇，形成膽汁酸，并具有免疫刺激作用和生物拮抗作用，是人體內(nèi)環(huán)境平衡與否的標(biāo)志。如果機(jī)體內(nèi)外環(huán)境發(fā)生變化，人體胃腸道就會(huì)發(fā)生紊亂，導(dǎo)致消化吸收功能減弱，發(fā)生胃腸道疾病，表現(xiàn)在胃炎、腸炎、腹瀉以及便秘等，甚至?xí)?dǎo)致免疫力下降等，如不及時(shí)調(diào)整，會(huì)增加胃腸道癌變的幾率。為了治療腹瀉、便秘等胃腸道紊亂，臨床上常用一些抗生素或者通便藥來改善癥狀，但由于這些藥物長期使用會(huì)產(chǎn)生耐受性，因此不適宜長期持續(xù)服用。最近的研究表明，通過攝取一些益生菌來調(diào)節(jié)菌群平衡，調(diào)整胃腸道內(nèi)環(huán)境，能夠有效的改善胃腸道紊亂。因此，益生菌成為腹瀉、便秘等胃腸道疾病的輔助補(bǔ)充劑得到重視和應(yīng)用。
現(xiàn)在市場(chǎng)上的微生態(tài)制劑大都數(shù)是液體或者粉劑、片劑。液體微生態(tài)制劑由于細(xì)菌的生長，活菌數(shù)很快細(xì)菌的死亡就會(huì)大量降低；粉劑或者片劑的微生態(tài)制劑除芽孢菌類以外，由于空氣或者輔料中有水分存在，細(xì)菌也會(huì)死亡，因而活性也會(huì)下降。本發(fā)明基于腸道菌群平衡理論基礎(chǔ)上研發(fā)的一種通過多種有益菌輔以益生元來調(diào)節(jié)胃腸道菌群，達(dá)到恢復(fù)正常菌群的目的，來調(diào)理胃腸道疾病。本發(fā)明還將用于菌種保藏的真空冷凍干燥技術(shù)應(yīng)用在微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，使得制得的復(fù)合益生菌處在一種休眠狀態(tài)，能夠長期保持微生物的活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)合的健胃整腸用的微生態(tài)制劑，同時(shí)提供其相應(yīng)的制備方法是本發(fā)明的另一目的。
基于上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：一種復(fù)合的微生態(tài)健胃整腸制劑，每1g制劑中含嗜酸乳桿菌≥5×107CFU，地衣芽孢桿菌≥5×107CFU，釀酒酵母≥5×107CFU，凍干保護(hù)劑0.1-0.2g。
所述凍干保護(hù)劑的質(zhì)量比為：10-20％脫脂奶粉、5-10％蔗糖，5-10％低聚糖。所述低聚糖包括低聚果糖，低聚麥芽糖，低聚木糖。
一種混合型腸道微生態(tài)制劑的制備方法，包括以下步驟：
(a)制備復(fù)合菌菌液：
將嗜酸乳桿菌、地衣芽孢桿菌和釀酒酵母分別接種到MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基以及YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵18-36小時(shí)，發(fā)酵溫度30-40℃，所得各菌含量≥5×108CFU/ml，然后進(jìn)行按比例混合得混合菌液；
(b)將(a)所獲得的菌液加入凍干保護(hù)劑和低聚寡糖，將準(zhǔn)備好的菌液分裝到凍干瓶中，然后進(jìn)行預(yù)冷；
(c)真空冷凍干燥，得成品。
所述的一種微生態(tài)健胃整腸制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(a)中所用菌株為嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854，地衣芽孢桿菌CGMCC1.105，釀酒酵母CICC1249；混合液中各菌占總體積比例為20-50％V/V。
所述的一種微生態(tài)健胃整腸制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(b)中，以質(zhì)量百分比計(jì)，所述凍干保護(hù)劑的配方包括：10-20％脫脂奶粉、5-10％蔗糖，5-10％低聚糖。
所述的一種微生態(tài)健胃整腸制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(b)中，在-70～-80℃下預(yù)凍2-4小時(shí)。
所述的一種微生態(tài)健胃整腸制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(c)中，真空冷凍干燥36小時(shí)。
所述的一種微生態(tài)健胃整腸制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(b)中，低聚糖包括低聚果糖，低聚麥芽糖，低聚木糖。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：將具有健胃、整腸功能的益生菌進(jìn)行體外單獨(dú)發(fā)酵，然后按照一定的比例進(jìn)行混合，配以凍干保護(hù)劑和低聚糖等益生元，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，能提高細(xì)菌在自然狀態(tài)下的存活率。該復(fù)合微生態(tài)制劑能以休眠狀態(tài)的菌體進(jìn)入到胃腸道，在胃腸道里定制并消耗氧氣，創(chuàng)造厭氧環(huán)境，低聚糖等益生元能促進(jìn)有益菌的生長，該復(fù)合微生態(tài)制劑能有效抑制有害菌的定植，減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)胃腸道內(nèi)正常菌群的平衡，提高機(jī)體的免疫力，保證人體健康。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例只為進(jìn)一步說明本發(fā)明，不以任何形式限制本發(fā)明，本實(shí)施例中所涉及的菌株嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854，地衣芽孢桿菌CGMCC1.105購自中國普通微生物菌種保藏中心，釀酒酵母CICC1249購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。
實(shí)施例1
將嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854，地衣芽孢桿菌CGMCC1.105，釀酒酵母CICC1249三種菌株按照斜面、液體種子、液體發(fā)酵的順序進(jìn)行培養(yǎng)，斜面和液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別為：嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，其組成為(W/V)：蛋白陳1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，吐溫80 0.1％，磷酸氫二鉀0.2％，乙酸鈉0.5％，檸檬酸三銨0.2％，硫酸鎂0.02％，硫酸錳0.005％，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉1.5-2％，pH 6.2左右；釀酒酵母培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基，其組成為(W/V)：葡萄糖2％,蛋白胨1％,酵母膏0.5％,固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉1.5-2％，pH自然；地衣芽孢桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其組成為：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化鈉1％，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉1.5-2％，pH7.4。將種子液按照5％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，酵母菌在30℃，嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌在37℃，通氣培養(yǎng)24-48h，使得每種菌的菌含量≥109cfu/ml。
將三種菌發(fā)酵液按體積百分比20％:30％:50％混合，得復(fù)合菌液，加入凍干保護(hù)劑該凍干保護(hù)劑的配方包括：脫脂乳、蔗糖和低聚果糖，其中，在凍干保護(hù)劑中，脫脂乳為10％，蔗糖5％、低聚果糖10％，分裝，接下來以-80℃進(jìn)行預(yù)凍4小時(shí)，最后冷凍干燥36小時(shí)即可。
實(shí)施例2
將嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854，地衣芽孢桿菌CGMCC1.105，釀酒酵母CICC1249三種菌株按照斜面、液體種子、液體發(fā)酵的順序進(jìn)行培養(yǎng)，斜面和液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別為：嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，其組成為(W/V)：蛋白陳1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，吐溫80 0.1％，磷酸氫二鉀0.2％，乙酸鈉0.5％，檸檬酸三銨0.2％，硫酸鎂0.02％，硫酸錳0.005％，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉1.5-2％，pH 6.2左右；釀酒酵母培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基，其組成為(W/V)：葡萄糖2％,蛋白胨1％,酵母膏0.5％,固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉1.5-2％，pH自然；地衣芽孢桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其組成為：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化鈉1％，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉1.5-2％，pH7.4。將種子液按照5％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，酵母菌在30℃，嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌在37℃，通氣培養(yǎng)24-48h，使得每種菌的菌含量≥109cfu/ml。
將三種菌發(fā)酵液按體積百分比30％:30％:40％混合，得復(fù)合菌液，加入凍干保護(hù)劑該凍干保護(hù)劑的配方包括：脫脂乳、蔗糖和低聚果糖，其中，在凍干保護(hù)劑中，脫脂乳為10％，蔗糖5％、低聚果糖10％，分裝，接下來以-80℃進(jìn)行預(yù)凍4小時(shí)，最后冷凍干燥36小時(shí)即可。
實(shí)施例3
將嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854，地衣芽孢桿菌CGMCC1.105，釀酒酵母CICC1249三種菌株按照斜面、液體種子、液體發(fā)酵的順序進(jìn)行培養(yǎng)，斜面和液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別為：嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，其組成為(W/V)：蛋白陳1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，吐溫80 0.1％，磷酸氫二鉀0.2％，乙酸鈉0.5％，檸檬酸三銨0.2％，硫酸鎂0.02％，硫酸錳0.005％，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉1.5-2％，pH 6.2左右；釀酒酵母培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基，其組成為(W/V)：葡萄糖2％,蛋白胨1％,酵母膏0.5％,固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉1.5-2％，pH自然；地衣芽孢桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其組成為：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化鈉1％，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉1.5-2％，pH7.4。將種子液按照5％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，酵母菌在30℃，嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌在37℃，通氣培養(yǎng)24-48h，使得每種菌的菌含量≥109cfu/ml。
將三種菌發(fā)酵液按體積百分比50％:30％:20％混合，得復(fù)合菌液，加入凍干保護(hù)劑該凍干保護(hù)劑的配方包括：脫脂乳、蔗糖和低聚果糖，其中，在凍干保護(hù)劑中，脫脂乳為10％，蔗糖5％、低聚果糖10％，分裝，接下來以-80℃進(jìn)行預(yù)凍4小時(shí)，最后冷凍干燥36小時(shí)即可。
實(shí)施例4按照實(shí)施例1制備的復(fù)合益生菌制劑與市場(chǎng)上所售益生菌產(chǎn)品保存穩(wěn)定性比較。市場(chǎng)產(chǎn)品分別選三株口服液，市售高濃縮益生菌菌粉。按常規(guī)加速試驗(yàn)法，若將產(chǎn)品置37～40℃、相對(duì)濕度75％條件下放置3個(gè)月、12個(gè)月后,測(cè)定菌含量。結(jié)果顯示本發(fā)明所制得的真空冷凍干燥的復(fù)合益生菌經(jīng)過長期保存后，活菌含量仍然很高，結(jié)果見表1。
表1益生菌保存性實(shí)驗(yàn)
實(shí)施例5
復(fù)合益生菌制劑對(duì)臨床急性感染性腹瀉的治療及對(duì)腸道菌群的恢復(fù)效果。該實(shí)驗(yàn)在浙江省麗水人民醫(yī)院完成，選取2015年6月-2016年3月在醫(yī)院診治的急性感染性腹瀉患者60例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均有腹瀉、腹痛等臨床癥狀，感染性腹瀉診斷依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的《感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS271-2007)(2)在患病后48h之內(nèi)就診。(3)納入研究前未服用抗菌藥物及微生態(tài)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行治療。(4)年齡＞18歲，＜60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)慢性腹瀉，非感染性腹瀉。(2)合并其他感染性疾病。(3)合并免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重心肝腎等其他臟器功能障礙性疾病。將患者隨機(jī)分為復(fù)合益生菌組(本發(fā)明制劑)、市售金雙歧片(雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片)為對(duì)照組1與不使用益生菌組為對(duì)照組2，每組20例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用復(fù)合益生菌組能有效改善腹瀉狀況(表2)，并能快速恢復(fù)腸道菌群(表3)。
表2使用益生菌一天后三組病人的腹瀉情況
表3復(fù)合益生菌對(duì)腸道主要菌含量的影響(1g CFU/g濕便，x±s,n＝5)