本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料技術(shù)領(lǐng)域，采用反向溫敏的方式進(jìn)行制備，采用該技術(shù)制備的生物材料可應(yīng)用于硬腦膜、硬脊膜及周圍神經(jīng)的修復(fù)。

背景技術(shù)：

硬腦膜是位于腦組織表面和顱骨內(nèi)側(cè)面之間的雙層膜性組織結(jié)構(gòu)，保持硬腦膜完整性是其發(fā)揮保護(hù)和支持作用的基礎(chǔ)。在臨床上，腫瘤侵蝕、炎癥破壞、先天性發(fā)育不良或開(kāi)放性的顱腦損傷、手術(shù)等因素可導(dǎo)致硬腦膜缺損。當(dāng)硬腦膜缺損時(shí)，易形成皮下積液和腦脊液漏，導(dǎo)致感染可引發(fā)腦炎、腦膜炎，且腦損傷及手術(shù)后腦組織可與頭皮下組織直接粘連愈合，增加癲癇發(fā)生的機(jī)會(huì)，手術(shù)后頭皮或肌肉層的滲血可彌漫至蛛網(wǎng)膜下腔，引發(fā)術(shù)后發(fā)熱，頭痛、無(wú)菌性炎癥或腦膜刺激征。因此，手術(shù)修補(bǔ)硬腦膜缺損恢復(fù)其正常的解剖結(jié)構(gòu)，可為腦組織提供保護(hù)作用，并能減少術(shù)后大腦與周圍組織的粘連，降低癲癇、顱內(nèi)感染，皮下積液、腦脊液漏等并發(fā)癥的發(fā)生率。

人工硬腦膜（Artificial Dura Mater）是用生物材料制成人體腦膜的替代物，用于因顱腦、脊髓損傷、腫瘤及其他顱腦疾病引起的硬腦膜或脊膜缺損的修補(bǔ)，防止腦脊液外漏、顱內(nèi)感染、腦膨出、腦粘連和疤痕等嚴(yán)重并發(fā)癥，以恢復(fù)其完整性。理想的硬腦膜替代物材料具有以下特點(diǎn)：①安全性，無(wú)毒性，無(wú)炎癥反應(yīng)、不傳播病毒性疾?。虎诮M織相容性好，無(wú)免疫反應(yīng)；③柔順性好，細(xì)胞粘附性能好；④防滲漏性好；⑤無(wú)腦組織粘連；⑥可吸收性，新生腦組織形成的同時(shí)，人工硬腦膜應(yīng)逐漸降解吸收；⑦便于手術(shù)操作。

臨床上使用的硬腦膜替代材料有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，主要分為以下四個(gè)大類：①自體筋膜：其優(yōu)點(diǎn)是是排異反應(yīng)較少且組織相容性良好，缺點(diǎn)是不宜取材，且增加自體損傷，易與腦組織發(fā)生粘連引起癲癇。②同種異體組織，如凍干人硬腦膜：其優(yōu)點(diǎn)是具有正常人體硬腦膜的解剖結(jié)構(gòu)，能夠起到一定的支撐和保護(hù)腦組織的作用，缺點(diǎn)是材料來(lái)源有限，并受到倫理道德的限制，而且具有潛在感染病毒性疾病的可能，現(xiàn)已禁用。③異種生物材料，如豬腹膜、牛心包等：是目前臨床上使用較多的人工硬膜材料。其優(yōu)點(diǎn)是材料來(lái)源充足，無(wú)倫理學(xué)限制；具有良好的致密性，修補(bǔ)后能基本恢復(fù)硬腦膜的解剖結(jié)構(gòu)，可有效防止腦脊液漏；生物相容性好，炎癥反應(yīng)輕微；具有一定的韌性和彈性；表面光滑，不易與周圍組織發(fā)生粘連。缺點(diǎn)是在去除異種蛋白抗原時(shí)使用的戊二醛可在材料中殘留部分醛基，不易徹底清除，有礙于成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入替代材料內(nèi)部，且存在一定的毒性，并具有潛在的異物反應(yīng)可能。④人工合成替代材料，如絲素蛋白、高分子聚合材料等。這類材料的優(yōu)點(diǎn)是制作方便，價(jià)格低廉，其缺點(diǎn)是作為永久性異物，有發(fā)生排異反應(yīng)的可能，易導(dǎo)致無(wú)菌性炎癥的發(fā)生形成肉芽腫等。

天然高分子材料應(yīng)用于人工硬腦膜是當(dāng)今醫(yī)用生物材料發(fā)展的趨勢(shì)之一，最為常見(jiàn)的材料是Ⅰ型膠原蛋白，通過(guò)凍干等技術(shù)制備而成。北京天新福公司采用Ⅰ型膠原蛋白制備人工硬腦膜并投入到了臨床使用，因其無(wú)毒副作用、無(wú)免疫排斥反應(yīng)且能夠自行降解等優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛的應(yīng)用。但膠原蛋白制備的生物材料力學(xué)性能和抗水性能相對(duì)較差，在液體環(huán)境中不能保持一定的韌性強(qiáng)度，且在體內(nèi)降解速度過(guò)快，從而限制了其在某些醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，在國(guó)內(nèi)公開(kāi)的專利中，有很多采用殼聚糖作為制備材料的先例，但殼聚糖在支撐組織細(xì)胞方面的力學(xué)性能不好，一般是與其它材料進(jìn)行復(fù)合使用才能滿足臨床需求。在國(guó)內(nèi)專利《一種胸膜/腦膜及其制備方法》（申請(qǐng)?zhí)?01510511365.5）中提出了一種旋轉(zhuǎn)涂膜的方式制備殼聚糖膜的方法，通過(guò)這種方法制備的胸膜/腦膜是致密的、無(wú)孔結(jié)構(gòu)薄膜，雖然在防滲性能上有所提高，但它不能吸收滲出的腦脊液，且這種無(wú)孔結(jié)構(gòu)不利于組織細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)，另外，這一薄膜的厚度相對(duì)較薄，與人體中硬腦膜的實(shí)際厚度有一定的差異。本發(fā)明的目的是制備出一種具有相對(duì)較高機(jī)械性能、具有多孔結(jié)構(gòu)、厚度易控、且能夠在液體環(huán)境中保持材料形狀和韌性的新型硬腦膜產(chǎn)品，以豐富硬腦膜產(chǎn)品市場(chǎng)，滿足臨床上對(duì)硬腦膜、硬脊膜及周圍神經(jīng)修復(fù)材料的需求。

溫敏性幾丁糖水凝膠在室溫及更高溫度下可以由流動(dòng)的液體狀態(tài)轉(zhuǎn)化為不流動(dòng)的凝膠狀態(tài)，但這一凝膠狀態(tài)極易與玻璃、金屬、聚四氟乙烯等材質(zhì)的容器發(fā)生牢固的粘連，使其很難從這些器具中光滑、完整的脫離下來(lái)，本發(fā)明中利用明膠與溫敏性幾丁糖反向溫敏特性，采用明膠相變涂層的方式進(jìn)行脫膜，明膠在高溫下溶解后可形成極小的空腔，鹽溶液占據(jù)這些空腔后便可使凝膠與器皿有效的分離開(kāi)來(lái)，示意圖如圖1所示。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種反向溫敏技術(shù)制備人工硬腦膜的制備方法，該方法制備的人工硬腦膜具有高韌性、多孔結(jié)構(gòu)、可在生理緩沖溶液中保存等特點(diǎn)。在制備過(guò)程中，巧妙的利用兩種不同溫度響應(yīng)的天然高分子材料，首先利用生理溫度下溫敏性幾丁糖材料本身的溶液-凝膠溫度響應(yīng)固化成型，然后利用生理緩沖液的相變響應(yīng)進(jìn)行固化，隨后利用明膠材料本身生理溫度下的凝膠-溶液的溫度響應(yīng)將其與模具基地脫離，然后通過(guò)浸泡、漂洗、冷凍干燥、滅菌等過(guò)程得到人工硬腦膜，其大致步驟如下：

在選定的模具底部及周邊區(qū)域，用一定濃度的明膠溶液進(jìn)行涂膜，在0-30℃溫度條件下靜置一段時(shí)間，向該模具中注入一定體積的溫敏性幾丁糖溶液（注入前溫敏性幾丁糖溶液應(yīng)在冰箱中保存或預(yù)冷），15-30℃條件下靜置使固化成凝膠狀態(tài)。隨后將該水凝膠連同模具一同放入20-60℃鹽溶液中，利用二者對(duì)溫度雙向響應(yīng)特性使凝膠從模具中脫離。將凝膠轉(zhuǎn)移至新鮮的鹽溶液中密封，20-60℃水浴放置12-96h，使凝膠充分進(jìn)行相轉(zhuǎn)變，而后取膜、去離子水漂洗、冷凍干燥、裁剪后用PBS浸潤(rùn)、最后滅菌即得。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

1.制備工藝簡(jiǎn)單，不需要經(jīng)過(guò)任何化學(xué)交聯(lián)劑的參與便能制備出高韌性、高機(jī)械強(qiáng)度的薄膜；

2.本產(chǎn)品具有多孔結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞粘附生長(zhǎng)；

3.經(jīng)本方法制得的硬腦膜補(bǔ)片可保存在生理緩沖液中，可采用高溫高壓濕熱滅菌的方式對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行終端滅菌；

4.本產(chǎn)品為可降解生物高分子材料，使用后無(wú)需再次手術(shù)取出。

附圖說(shuō)明

圖1反向溫敏技術(shù)示意圖;

圖2溫敏性幾丁糖人工硬腦膜拉力測(cè)試結(jié)果（干態(tài)）;

圖3溫敏性幾丁糖人工硬腦膜拉力測(cè)試結(jié)果（濕態(tài)）;

圖4溫敏性幾丁糖硬腦膜補(bǔ)片橫切面結(jié)構(gòu)（SEM）;

圖5溫敏性幾丁糖硬腦膜補(bǔ)片縱切面結(jié)構(gòu)（SEM） 。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。

實(shí)施例一

在選定的模具底部及周邊區(qū)域，用一定濃度的明膠溶液進(jìn)行涂膜，低溫或室溫條件下放置待凝，向該模具中注入一定體積的溫敏性幾丁糖溶液（注入前溫敏性幾丁糖溶液應(yīng)在冰箱中保存或預(yù)冷），室溫或40℃左右烘箱中靜置待凝，將該水凝膠連同模具一同放入預(yù)先加熱好的PBS水浴中進(jìn)行脫膠。將凝膠轉(zhuǎn)移至新鮮的PBS溶液中密封，水浴放置24小時(shí)，使凝膠充分進(jìn)行相轉(zhuǎn)變。第二天，取膜，去離子水漂洗30min，放入特定模具中，鋪平，進(jìn)行冷凍干燥。

將凍干后的海綿裁剪后用PBS浸潤(rùn)，放入裝有PBS的西林瓶中，密封后121℃高壓滅菌15min，即得。

實(shí)施例二

在選定的模具底部及周邊區(qū)域，用一定濃度的明膠溶液進(jìn)行涂膜，低溫或室溫條件下放置待凝，向該模具中注入一定體積的溫敏性幾丁糖溶液（注入前溫敏性幾丁糖溶液應(yīng)在冰箱中保存或預(yù)冷），室溫或40℃左右烘箱中靜置待凝，將該水凝膠連同模具一同放入預(yù)先加熱好的PBS水浴中進(jìn)行脫膠。將凝膠轉(zhuǎn)移至新鮮的PBS溶液中密封，水浴放置48小時(shí)，使凝膠充分進(jìn)行相轉(zhuǎn)變。第二天，取膜，去離子水漂洗30min，放入特定模具中，鋪平，進(jìn)行冷凍干燥。

將凍干后的海綿裁剪后用PBS浸潤(rùn)，放入裝有PBS的西林瓶中，密封后121℃高壓滅菌15min，即得。

實(shí)施例三

在選定的模具底部及周邊區(qū)域，用一定濃度的明膠溶液進(jìn)行涂膜，低溫或室溫條件下放置待凝，向該模具中注入一定體積的溫敏性幾丁糖溶液（注入前溫敏性幾丁糖溶液應(yīng)在冰箱中保存或預(yù)冷），室溫或40℃左右烘箱中靜置待凝，將該水凝膠連同模具一同放入預(yù)先加熱好的PBS水浴中進(jìn)行脫膠。將凝膠轉(zhuǎn)移至新鮮的PBS溶液中密封，水浴放置48小時(shí)，使凝膠充分進(jìn)行相轉(zhuǎn)變。第二天，取膜，去離子水漂洗10min，放入特定模具中，鋪平，進(jìn)行冷凍干燥。

將凍干后的海綿裁剪后用PBS浸潤(rùn)，放入裝有PBS的西林瓶中，密封后121℃高壓滅菌15min，即得。

實(shí)施例四

將由實(shí)施例所得的凍干溫敏性幾丁糖海綿樣品及經(jīng)高溫高壓滅菌后的最終制品于萬(wàn)能拉力機(jī)上進(jìn)行拉伸性能測(cè)試。測(cè)試條件：拉伸速率10mm/min，斷裂敏感度為35%，即當(dāng)拉力降為最大拉力的75%時(shí)即視為產(chǎn)品斷裂。測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3，可以看出溫敏性幾丁糖薄膜在干態(tài)下的拉伸強(qiáng)度非常好，在濕態(tài)下的薄膜拉伸伸長(zhǎng)率有著顯著的提升。

實(shí)施例五

將由實(shí)施例所得的凍干溫敏性幾丁糖海綿樣品，橫切面（圖4）及縱切面（圖5）通過(guò)SEM電鏡掃描，結(jié)果表明，制品具有多孔結(jié)構(gòu)，且制品表面的多孔結(jié)構(gòu)較中間部分的多孔結(jié)構(gòu)要致密，這一結(jié)構(gòu)不僅有利于防止腦脊液滲漏，還有利于將吸收的滲漏液牢牢地鎖在制品中，防止二次感染。