本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是軟骨修復(fù)材料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料及其制備方法。

背景技術(shù)：

軟骨是覆蓋在關(guān)節(jié)之間的結(jié)蹄組織，由于其缺少血管、干細(xì)胞和生長(zhǎng)因子，因此其一旦受損就難以復(fù)原。治療軟骨缺損主要治療方法是通過手術(shù)治療或組織工程技術(shù)。手術(shù)治療最常見的包括關(guān)節(jié)鏡清創(chuàng)術(shù)、骨髓刺激治療和軟骨及軟骨細(xì)胞移植，但均存在缺陷，如關(guān)節(jié)鏡清創(chuàng)手雖對(duì)早期關(guān)節(jié)炎效果顯著，但缺乏長(zhǎng)期的療效；骨髓刺激治療只能緩解軟受損帶來的痛苦但不能治愈損傷；自體移植則受到供體來源所限，難以實(shí)現(xiàn)大面積的軟骨缺損修復(fù)，異體軟骨移植則會(huì)出現(xiàn)免疫排異等不良反應(yīng)。

組織工程軟骨要求將細(xì)胞培養(yǎng)、生物支架材料和生長(zhǎng)因子三者結(jié)合，但目前在細(xì)胞選擇、支架制作、生長(zhǎng)因子的負(fù)載和釋放等各方面均需深入研究。其中一個(gè)難點(diǎn)就是外源性生長(zhǎng)因子在體內(nèi)半衰期短，不利于細(xì)胞增殖和分化。目前，有多種控釋方式被用于軟骨組織工程中，如水凝膠包埋，微球負(fù)載等，但這些方法均存在著不足之處。首先，常規(guī)方法制備的水凝膠或者微球其孔隙率，結(jié)構(gòu)尺寸和微孔結(jié)構(gòu)的連通性均只能控制在一定范圍而不能精確在某一特定數(shù)值。而在生長(zhǎng)因子負(fù)載到支架材料時(shí)，由于人為操作的影響，生長(zhǎng)因子的負(fù)載率有一定隨機(jī)性。在整個(gè)制備的的過程中，需要先制成支架材料，再進(jìn)行生長(zhǎng)因子負(fù)載，整個(gè)過程所需時(shí)間較長(zhǎng)。雖然上述的傳統(tǒng)的組織工程軟骨修復(fù)材料的制備方法簡(jiǎn)單，但是在組織結(jié)構(gòu)、生物學(xué)性能與軟骨組織存在差距。

三維打印技術(shù)（3D-printing）在生物組織工程中的研究國(guó)內(nèi)外已有大量的研究報(bào)道，其中生物三維打印已在個(gè)性化醫(yī)療模型、仿生支架、藥物緩釋模式等方面應(yīng)用，這為軟骨修復(fù)材料的發(fā)展帶來了新方向。生物三維打印其所打印的材料主要是以細(xì)胞、生物材料或是生長(zhǎng)因子，利用計(jì)算機(jī)輔助軟件建模后，控制打印機(jī)沉積細(xì)胞或者生物材料的速度和位置，來實(shí)現(xiàn)仿生活性支架或是仿生材料的制造。在組織工程的應(yīng)用上，生物三維打印能一步到位地根據(jù)實(shí)際所需精準(zhǔn)地構(gòu)建修復(fù)材料的內(nèi)外結(jié)構(gòu)，而且能使生長(zhǎng)因子均勻分布，所構(gòu)建的組織修復(fù)材料與正常人體組織高度相似。而且采用生物三維打印來制備組織工程軟骨，可以克服支架制備耗時(shí)長(zhǎng)，精度不高等問題。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白是目前發(fā)現(xiàn)唯一能夠單獨(dú)誘導(dǎo)成骨生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子，其中BMP-2的成骨能力最為突出。而基因重組后所得的rhBMP-2在誘導(dǎo)成骨時(shí)間、成骨的量、血管和骨髓樣組織形成等方面明顯優(yōu)于天然BMP-2。BMP-2參與BMP-2/Smads/Msx2/Osterix信號(hào)通路和BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信號(hào)通路，通過激活Smads信號(hào)，轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)成骨基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮其成骨作用；能誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，使新生軟骨內(nèi)的蛋白多糖和膠原纖維的含量更加趨近正常軟骨細(xì)胞合成的Ⅱ型膠原和蛋白多糖含量，長(zhǎng)期維持體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有的組織工程軟骨修復(fù)材料制備精度不高，生物活性成分分布不均，材料制備需時(shí)過長(zhǎng)等缺陷，提供一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料及其制備方法，該軟骨修復(fù)材料免疫原性低，材料來源豐富，具有良好的生物相容性，骨誘導(dǎo)能力和血管化能力。本發(fā)明通過三維打印技術(shù)制備得到的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料，可根據(jù)受損部位實(shí)際情況進(jìn)行建模，能真正地達(dá)到個(gè)性化治療。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料為多層矩形結(jié)構(gòu)，由海藻酸鈉和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（rhBMP-2）構(gòu)成。

進(jìn)一步的，所述的軟骨修復(fù)材料按重量份數(shù)計(jì)由海藻酸鈉10份和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（rhBMP-2）0.01~0.1份組成。

優(yōu)選的，所述的海藻酸鈉的分子量為2~3×10⁵g/mol，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（rhBMP-2）購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的另一技術(shù)方案為：一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料的制備方法，所述的制備方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：凝固收集平臺(tái)的準(zhǔn)備；生物活性打印材料的制備；通過3D打印機(jī)技術(shù)將生物活性打印材料打印在凝固收集平臺(tái)上，層層累加后，形成多層矩形結(jié)構(gòu)的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料。

進(jìn)一步的，所述凝固收集平臺(tái)的制備具體步驟為：在一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入質(zhì)量濃度為0.5%的聚乙烯亞胺溶液至剛好浸沒培養(yǎng)皿的底部，將盛有聚乙烯亞胺溶液的培養(yǎng)皿置于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置24小時(shí)，使培養(yǎng)皿內(nèi)壁覆蓋上聚乙烯亞胺層，將培養(yǎng)皿中多余的聚乙烯亞胺溶液棄去，用去離子水沖洗培養(yǎng)皿2~3次；再加入質(zhì)量濃度為2%的氯化鈣溶液，加入氯化鈣溶液的體積為培養(yǎng)皿容積的二分之一，將盛有氯化鈣溶液的培養(yǎng)皿置于3D打印機(jī)的工作平臺(tái)上，形成凝固收集平臺(tái)。

更進(jìn)一步的，所述生物活性打印材料的制備具體如下：

（1）按配方量將海藻酸鈉溶于去離子水中，配成質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉溶液；

（2）按配方量將干態(tài)的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（rhBMP-2）加入去離子水中，配成質(zhì)量濃度為2% 的rhBMP-2生長(zhǎng)因子溶液；

（3）將步驟（2）配成的rhBMP-2生長(zhǎng)因子溶液與步驟（1）配成的海藻酸鈉溶液等體積混合，得到生物活性打印材料。

優(yōu)選的，所述的3D打印機(jī)技術(shù)采用氣體動(dòng)力噴射打印，溫度控制在35~37℃，通過CAD或Solidwords 電腦輻照軟件建立打印模型。

優(yōu)選的，所述的聚乙烯亞胺的分子量為25kD。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明公開的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料具有免疫原性低，原材料豐富，價(jià)格低廉，制備方法簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。

（2）本發(fā)明以海藻酸鈉作為軟骨修復(fù)材料的基質(zhì)，與重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（rhBMP-2）復(fù)合后，利用三維打印技術(shù)進(jìn)行仿生打印，這不僅克服了傳統(tǒng)軟骨修復(fù)材料因?yàn)闆]有生物活性而不能達(dá)到真正地修復(fù)治療效果，同時(shí)通過三維打印技術(shù)所制得的軟骨修復(fù)材料，可以根據(jù)患者受損部位實(shí)際情況建模，能真正達(dá)到個(gè)性化治療。

（3）本發(fā)明制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料，是采用生物三維打印技術(shù)，通過將基質(zhì)材料和生長(zhǎng)因子復(fù)合后再進(jìn)行仿生打??；相比于傳統(tǒng)的組織工程軟骨材料制備方法，本發(fā)明所公開的制備方法具有支架微結(jié)構(gòu)精確成型，生長(zhǎng)因子在支架中能均為分布，且能達(dá)到緩釋效果，能有效克服外源性生長(zhǎng)因子在體內(nèi)半衰期短的難題。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1～3所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料與對(duì)比例的rhBMP-2體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比圖；

圖2為實(shí)施例1～3所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料與對(duì)比例的ALP值檢測(cè)結(jié)果對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料為多層矩形結(jié)構(gòu)，由海藻酸鈉和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白構(gòu)成；按重量份數(shù)計(jì)由海藻酸鈉10份和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白0.01份組成；所述的海藻酸鈉的分子量為2~3×10⁵g/mol，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司。

實(shí)施例2

一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料為多層矩形結(jié)構(gòu)，由海藻酸鈉和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白構(gòu)成；按重量份數(shù)計(jì)由海藻酸鈉10份和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白0.05份組成；所述的海藻酸鈉的分子量為2~3×10⁵g/mol，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司。

實(shí)施例3

一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料為多層矩形結(jié)構(gòu)，由海藻酸鈉和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白構(gòu)成；按重量份數(shù)計(jì)由海藻酸鈉10份和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白0.1份組成；所述的海藻酸鈉的分子量為2~3×10⁵g/mol，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司。

實(shí)施例4

實(shí)施例1～實(shí)施例3任一例一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料，其制備方法的具體步驟如下：

（1）凝固收集平臺(tái)的準(zhǔn)備：在一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入質(zhì)量濃度為0.5%的聚乙烯亞胺溶液至剛好浸沒培養(yǎng)皿的底部，將盛有聚乙烯亞胺溶液的培養(yǎng)皿置于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置24小時(shí)，使培養(yǎng)皿內(nèi)壁覆蓋上聚乙烯亞胺層，將培養(yǎng)皿中多余的聚乙烯亞胺溶液棄去，用去離子水沖洗培養(yǎng)皿2~3次；再加入質(zhì)量濃度為2%的氯化鈣溶液，加入氯化鈣溶液的體積為培養(yǎng)皿容積的二分之一，將盛有氯化鈣溶液的培養(yǎng)皿置于3D打印機(jī)的工作平臺(tái)上，形成凝固收集平臺(tái)，待用；所述的聚乙烯亞胺的分子量為25kD；

（2）生物活性打印材料的制備：按配方量將海藻酸鈉溶于去離子水中，配成質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉溶液；按配方量將干態(tài)的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（rhBMP-2）加入去離子水中，配成質(zhì)量濃度為2% 的rhBMP-2生長(zhǎng)因子溶液；將配成的rhBMP-2生長(zhǎng)因子溶液與配成的海藻酸鈉溶液等體積混合，得到生物活性打印材料，備用；

（3）軟骨修復(fù)材料的打印：通過CAD或Solidwords 電腦輻照軟件建立打印模型，3D打印機(jī)采用氣體動(dòng)力噴射打印方式，溫度控制在35~37℃，將步驟（2）制備的生物活性打印材料打印在步驟（1）制備的凝固收集平臺(tái)上，層層累加后，形成多層矩形結(jié)構(gòu)的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料。

實(shí)施例5

對(duì)比例：為負(fù)載了rhBMP-2的海藻酸鈉/殼聚糖復(fù)合軟骨修復(fù)材料（支架材料參考申請(qǐng)?zhí)枮镃N201310641686.8所公開的軟骨組織工程支架材料及其制備方法的制備方法所制得，再將rhBMP-2負(fù)載到海藻酸鈉/殼聚糖軟骨修復(fù)材料上）。

實(shí)驗(yàn)組1~3：為實(shí)施例1～3所得的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料，采用實(shí)施例4的方法制備而成。

將上述實(shí)施例1～3所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料與對(duì)比例進(jìn)行rhBMP-2釋放實(shí)驗(yàn)，對(duì)比實(shí)施例1~3和對(duì)比例對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1示。

從上圖結(jié)果可知，對(duì)比例從實(shí)驗(yàn)開始至rhBMP-2完全釋放均較同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組1~3的釋放率高，且在5天到10天這段時(shí)間有一個(gè)明顯的突釋過程，到16天時(shí)已完全釋放，不能達(dá)到長(zhǎng)效持續(xù)釋放的效果。而實(shí)施例1~3雖然在5-7天、15-20天這兩個(gè)時(shí)間段分別有兩個(gè)突釋的過程，但之后均有一個(gè)緩釋的平臺(tái)期，整個(gè)釋放過程屬于緩釋過程。由此可見，本發(fā)明通過3D打印機(jī)技術(shù)所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料，具有長(zhǎng)效持續(xù)釋放rhBMP-2的效果，能克服rhBMP-2在體內(nèi)半衰期短的不足之處。

實(shí)施例6

對(duì)比例：為負(fù)載了rhBMP-2的海藻酸鈉/殼聚糖復(fù)合軟骨修復(fù)材料（支架材料參考申請(qǐng)?zhí)枮镃N201310641686.8所公開的軟骨組織工程支架材料及其制備方法的制備方法所制得，再將rhBMP-2負(fù)載到海藻酸鈉/殼聚糖軟骨修復(fù)材料上）。

實(shí)驗(yàn)組1~3：為實(shí)施例1～3所得的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料，采用實(shí)施例4的方法制備而成。

將上述實(shí)施例1～3所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料與對(duì)比例分別與MG-63（人成骨肉瘤細(xì)胞）進(jìn)行共培養(yǎng)7天后對(duì)其ALP值進(jìn)行檢測(cè)，以此評(píng)價(jià)實(shí)施例1~3和對(duì)比例的成骨誘導(dǎo)能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2示。

堿性磷酸酶（alkaline phosphate ALP）是分化成骨細(xì)胞的標(biāo)志物，能促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化。從上圖可知，與對(duì)比例相比，實(shí)施例1~3的ALP值明顯較對(duì)比例要高。由此可見，本發(fā)明通過3D打印機(jī)技術(shù)所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料具有較高的骨誘導(dǎo)能力。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定；對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉；凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。