本發(fā)明涉及一種多孔軟骨修復(fù)支架及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。

技術(shù)背景

關(guān)節(jié)軟骨一旦遭到破壞便很難得到修復(fù)。直到現(xiàn)在，關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)一直是臨床面臨的難題,這主要是因?yàn)檐浌墙M織內(nèi)無(wú)血管，且軟骨細(xì)胞缺乏遷徙能力，不能迅速聚集到創(chuàng)傷部位所致。關(guān)節(jié)軟骨中纖維含量少，只含有少量的膠原纖維，基質(zhì)的主要化學(xué)成分是蛋白質(zhì)多糖。關(guān)節(jié)軟骨不同于血管化的組織，由于沒(méi)有血供,且軟骨細(xì)胞埋于稠厚的細(xì)胞外基質(zhì)中，無(wú)法移動(dòng)到損傷部位參與修復(fù)，且缺乏細(xì)胞分化所必須的母細(xì)胞及細(xì)胞遷徙所必須的理想環(huán)境，這樣就使得即使是極小的軟骨缺損也難于自然修復(fù)。

目前臨床上傳統(tǒng)的治療方法主要有微骨折術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)、軟骨下磨削術(shù)、自體軟骨移植和自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)等，但是，研究結(jié)果顯示，這些修復(fù)方法只能暫時(shí)的緩解疼痛等癥狀，其修復(fù)部位主要由纖維軟骨填充而不是透明軟骨，其最終結(jié)局還是修復(fù)部位軟骨的退化壞死。組織工程技術(shù)的興起和快速發(fā)展為軟骨缺損的修復(fù)提供了嶄新的思路。

在骨組織工程的研究中，支架材料、種子細(xì)胞和誘導(dǎo)因子及其生物環(huán)境起著非常重要的作用。理想的軟骨支架材料應(yīng)具備的基本條件主要有：①能對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)提供力學(xué)支持；②對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用，有較好的生物相容性，不易引起炎性反應(yīng)，并可以促進(jìn)種子細(xì)胞黏附；③具有良好的生物活性，能夠幫助維持軟骨細(xì)胞的表型表達(dá)；④應(yīng)該具備多孔疏松的三維結(jié)構(gòu)以保存大量細(xì)胞，并且有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的進(jìn)入和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的排出，從而有利于軟骨細(xì)胞的新陳代謝；⑤具備很好的生物降解性，利于細(xì)胞增殖，并且要求支架材料的降解速率應(yīng)與細(xì)胞的增殖速率相匹配。

現(xiàn)今有多種支架材料被用于軟骨組織工程，按其來(lái)源不同大體可分為天然的和人工合成的兩種。目前用于軟骨組織工程的人工合成材料主要有：聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸一羥基乙酸、聚乙二醇、丙交酯乙交酯共聚酯、嵌段共聚物，D—磷酸三鈣、聚乙烯醇等；天然支架主要有：透明質(zhì)酸、膠原、幾丁質(zhì)、藻酸、小腸黏膜下層、纖維蛋白原等。人工合成的支架材料因其來(lái)源廣泛、易加工成所需的形狀等優(yōu)勢(shì)近年來(lái)得到了廣泛的發(fā)展，相比于天然支架材料，它具有極好的生物力學(xué)性能，并且可以根據(jù)需要調(diào)整其理化特性和生物降解速率，但因其較弱的親合性和一定程度的細(xì)胞毒性作用限制了它的應(yīng)用。而天然支架材料因其較好的親合性而有利于細(xì)胞的黏附和增殖被視為細(xì)胞生長(zhǎng)的天然載體。它具有良好的生物可降解性，經(jīng)過(guò)去抗原處理后生物相容性好，還含有生長(zhǎng)因子類物質(zhì)，可以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的識(shí)別、黏附、增殖和保持分化特性。其缺點(diǎn)是力學(xué)性能較差，降解速度快、大量制備困難，不同批次質(zhì)量差異波動(dòng)較大，且因其來(lái)自于天然生物體，處理不當(dāng)尚有傳播疾病的危險(xiǎn)。但是目前所研究的各種支架材料各有其優(yōu)缺點(diǎn)，并沒(méi)有任何一種支架材料是公認(rèn)的最佳組織工程軟骨支架材料，因此我們?nèi)匀灰铝τ趯ふ腋玫闹Ъ懿牧蟻?lái)為臨床應(yīng)用提供更多更好的選擇。

魔芋是一種天南星科魔芋屬的草本植物，魔芋葡甘聚糖（Konjacghhcomannan，簡(jiǎn)稱 KGM）是魔芋的主要成分，在干魔芋塊莖中的含量高達(dá)55%~ 60%。它是由 D-葡萄糖（G）和 D-甘露糖（M）按 1：1.6或1：1.69的摩爾比通過(guò)β-1，4-吡喃糖苷鍵結(jié)合的復(fù)合多糖。KGM 通常帶有短支鏈，并含有少量乙酰基。KGM具有良好的生物相容性、生物可降解性以及凝血性，使得KGM在抗菌消炎、止血、促進(jìn)傷口愈合等方面得到廣泛應(yīng)用；如固定化載體、外用材料及組織工程支架、藥物控釋材料等。所以充分利用魔芋葡甘聚糖良好的生物特性開發(fā)其在生物材料領(lǐng)域應(yīng)用具有優(yōu)良的發(fā)展前景。

透明質(zhì)酸鈉，是一種酸性粘多糖，廣泛分布于人體的結(jié)締組織中，在眼玻璃體、關(guān)節(jié)腔中幾乎以純態(tài)形式存在，以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，如潤(rùn)滑關(guān)節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，水電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等，同時(shí)透明質(zhì)酸鈉作為軟骨基質(zhì)中重要的蛋白多糖，在維持軟骨細(xì)胞表型、促進(jìn)軟骨機(jī)制分泌等方面也發(fā)揮著重要的作用。綜合分析研究著研究成果表明，軟骨支架材料的研究與選取，仍是軟骨組織工程學(xué)科研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有軟骨修復(fù)支架材料性能不理想，成本高等問(wèn)題。

本發(fā)明目的在于提供一種多孔軟骨修復(fù)用支架材料，所述多孔軟骨修復(fù)用支架材料依次由透明質(zhì)酸鈉、魔芋葡甘聚糖、透明質(zhì)酸鈉構(gòu)成三層結(jié)構(gòu)，即類似于“三明治”結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種多孔軟骨修復(fù)支架的制備方法，按如下步驟進(jìn)行：

（1）按甘油、乳酸、蒸餾水體積比為（0.6~1.2）：（1~2）：（90~400）的比例將甘油、乳酸、蒸餾水混合均勻，并按10~25g/L的比例將魔芋葡甘聚糖溶解于其中，在常溫常壓下，攪拌混勻得到混合溶液。

（2）將步驟（1）制得的混合溶液用微波加熱2~8min，然后冷卻至室溫，負(fù)壓脫泡后在模具中流延成膜，干燥后得到魔芋葡甘聚糖膜。

（3）按二甲基甲酰胺、蒸餾水體積比為（1~5）：（0.5~4）的比例將二甲基甲酰胺、蒸餾水混合均勻，并按8~25g/L的比例將透明質(zhì)酸鈉溶解于其中，得到透明質(zhì)酸鈉紡絲液。

（4）將步驟（3）得到的透明質(zhì)酸紡絲液，通過(guò)靜電紡絲的方法復(fù)合于步驟（2）得到的魔芋葡甘聚糖膜的兩面，得到所述多孔軟骨修復(fù)支架。

優(yōu)選的，本發(fā)明步驟（2）中微波加熱的溫度為80~120℃。

優(yōu)選的，本發(fā)明步驟（2）中負(fù)壓脫泡的條件為：在400~760毫米汞柱的負(fù)壓下脫泡10~20h。

優(yōu)選的，本發(fā)明步驟（2）中干燥溫度為40~60℃，時(shí)間為10-48小時(shí)。

優(yōu)選的，本發(fā)明步驟（4）中靜電紡絲條件為：在正電壓為8~22Kv，接收距離為10~20cm，進(jìn)料速度為0.01mm/min~1.00mm/min，紡絲環(huán)境溫度為50±10℃條件下進(jìn)行。

本發(fā)明中所述軟骨修復(fù)支架的抗拉強(qiáng)度為40~60MPa，纖維絲的直徑分布在60~180μm。

本發(fā)明采用生物相容性好的可降解生物材料魔芋葡甘聚糖與透明質(zhì)酸鈉為基本原料，制備出一種用于軟骨修復(fù)的魔芋葡甘聚糖/透明質(zhì)酸鈉多孔支架，為軟骨組織工程領(lǐng)域的發(fā)展提供了一種新的極具應(yīng)用前景的選擇，魔芋葡甘聚糖價(jià)格較低，能有效降低材料成本，另外流延法制備的魔芋葡甘聚糖膜其操作簡(jiǎn)單，易于成型，且具有較高的抗拉強(qiáng)度；采用靜電紡絲在魔芋葡甘聚糖膜兩側(cè)電紡?fù)该髻|(zhì)酸鈉，為支架材料提供較好的多孔結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的有益效果：

（1）支架材料魔芋葡甘聚糖層采用流延法成型，該方法操作簡(jiǎn)單且容易成型，并且材料的抗拉強(qiáng)度為40~60MPa，有較高的抗拉強(qiáng)度，滿足軟骨支架條件。

（2）利用靜電紡絲在魔芋葡甘聚糖膜的兩面復(fù)合透明質(zhì)酸鈉納米纖維，通過(guò)改變靜電紡絲相關(guān)參數(shù)，能較好控制其纖維質(zhì)量及纖維直徑分布，且該結(jié)構(gòu)適合營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸與細(xì)胞的長(zhǎng)入。

（3）該支架材料制備方法簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，其原材料價(jià)格低廉，可應(yīng)用與工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1制備得到的軟骨修復(fù)支架材料的顯微形貌圖。

圖2為實(shí)施例2制備得到的軟骨修復(fù)支架材料的顯微形貌圖。

圖3為實(shí)施例3制備得到的軟骨修復(fù)支架材料的顯微形貌圖。

圖4為軟骨修復(fù)支架材料的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。

實(shí)施例1

本實(shí)施例所述軟骨修復(fù)支架材料的制備方法，具體內(nèi)容如下：

（1）將0.6ml甘油、1ml乳酸和100ml蒸餾水混合均勻，并加入1.016g魔芋葡甘聚糖使其溶解于其中，在常溫常壓下，以300r/min的速度攪拌6h；得到魔芋葡甘聚糖混合溶液。

（2）將步驟（1）制得的混合溶液置于微波爐中高火（100℃，800瓦）加熱3.5min，冷卻至室溫，在400~760毫米汞柱的負(fù)壓下脫泡16h，然后在直徑為150mm，深為3mm的聚四氟乙烯磨具中流延成膜，置于50℃干燥箱干燥12h，得到魔芋葡甘聚糖膜。

（3）將18ml二甲基甲酰胺和25ml蒸餾水混合均勻，并加入0.43g透明質(zhì)酸鈉使其充分溶解于其中，得到透明質(zhì)酸鈉紡絲液。

（4）通過(guò)靜電紡絲方法，設(shè)定正電壓為12Kv，接收距離為12cm，進(jìn)料速度為1.0mm/min，紡絲環(huán)境溫度為48℃，將步驟（3）得到的透明質(zhì)酸鈉紡絲液復(fù)合于步驟（2）得到的魔芋葡甘聚糖膜的兩面，得到所述多孔軟骨修復(fù)支架。

（5）采用本實(shí)施例得到的軟骨修復(fù)支架材料抗拉強(qiáng)度為45MPa，纖維絲的直徑分布在70~100μm，細(xì)胞毒性為0級(jí)，復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)，其微觀形貌如圖1所示，由圖可以看出紡絲效果較好，絲較為平滑均勻。

實(shí)施例2

本實(shí)施例所述軟骨修復(fù)支架材料的制備方法，具體內(nèi)容如下：

（1）將0.8ml甘油、2ml乳酸和200ml蒸餾水混合均勻，并加入4.056g魔芋葡甘聚糖使其溶解于其中，在常溫常壓下，以300r/min的速度攪拌7h；得到魔芋葡甘聚糖混合溶液。

（2）將步驟（1）制得的混合溶液置于微波爐中高火（100℃，800瓦）加熱5min，冷卻至室溫，在400~760毫米汞柱的負(fù)壓下脫泡10h，然后在直徑為150mm，深為3mm的聚四氟乙烯磨具中流延成膜，置于45℃干燥箱干燥48h，得到魔芋葡甘聚糖膜。

（3）將22.5ml二甲基甲酰胺和7.5ml蒸餾水混合均勻，并加入0.36g透明質(zhì)酸鈉使其充分溶解于其中，得到透明質(zhì)酸鈉紡絲液。

（4）通過(guò)靜電紡絲方法，設(shè)定正電壓為16Kv，接收距離為17cm，進(jìn)料速度為0.06mm/min，紡絲環(huán)境溫度為48℃，將步驟（3）得到的透明質(zhì)酸鈉紡絲液復(fù)合于步驟（2）得到的魔芋葡甘聚糖膜的兩面，得到所述多孔軟骨修復(fù)支架。

（5）采用本實(shí)施例得到的軟骨修復(fù)支架材料抗拉強(qiáng)度為50MPa，纖維絲的直徑分布在80~150μm，細(xì)胞毒性為0級(jí)，復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)，其微觀形貌如圖2所示，由圖可以看出紡絲效果較好，絲比較平滑，且少有斷絲。

實(shí)施例3

本實(shí)施例所述軟骨修復(fù)支架材料的制備方法，具體內(nèi)容如下：

（1）將1.2ml甘油、2ml乳酸和400ml蒸餾水混合均勻，并加入10.08g魔芋葡甘聚糖使其溶解于其中，在常溫常壓下，以300r/min的速度攪拌7.5h。得到魔芋葡甘聚糖混合溶液。

（2）將步驟（1）制得的混合溶液置于微波爐中（100℃，800瓦）高火加熱8min，冷卻至室溫，在400~760毫米汞柱的負(fù)壓下脫泡20h，然后在直徑為150mm，深為3mm的聚四氟乙烯磨具中流延成膜，置于60℃干燥箱干燥10h，得到魔芋葡甘聚糖膜。

（3）將16.5ml二甲基甲酰胺和13.5ml蒸餾水混合均勻，并加入0.6g透明質(zhì)酸鈉使其充分溶解于其中，得到透明質(zhì)酸鈉紡絲液。

（4）通過(guò)靜電紡絲方法，設(shè)定正電壓為20Kv，接收距離為18cm，進(jìn)料速度為0.02mm/min，紡絲環(huán)境溫度為52℃，將步驟（3）得到的透明質(zhì)酸鈉紡絲液復(fù)合于步驟（2）得到的魔芋葡甘聚糖膜的兩面，得到所述多孔軟骨修復(fù)支架。

（5）采用本實(shí)施例得到的軟骨修復(fù)支架材料抗拉強(qiáng)度為45MPa，纖維絲的直徑分布在65~135μm，細(xì)胞毒性為0級(jí)，復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)，其微觀形貌如圖3所示，由圖可以看出纖維均勻性好，并且纖維比較光滑平直。