一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜及其制備方法【專利摘要】一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜，包含萬古霉素或鹽酸氧氟沙星注射液，殼聚糖及β-甘油磷酸鈉，其特點(diǎn)是：將脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料制成海綿狀膠原生物膜支架，應(yīng)用2%(w/v)殼聚糖溶液，56%(w/v)β-甘油磷酸鈉溶液進(jìn)行混合，根據(jù)殼聚糖與β-甘油磷酸鈉溶液復(fù)合物在37℃時(shí)形成水凝膠的溫度敏感性的特性，將萬古霉素或鹽酸氧氟沙星注射液加入殼聚糖與β-甘油磷酸鈉溶液復(fù)合物的溶液浸入已經(jīng)制成的海綿狀膠原生物膜支架的免縫合硬腦膜，在37℃溫箱內(nèi)放置10min，水凝膠復(fù)合物均勻浸入海綿狀膠原生物膜支架形成具有抗菌活性的可吸收的人工硬腦膜。并提供制備方法。具有制作方便，易成膜，成本低廉，便于操作等特點(diǎn)?！緦＠f明】一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜及其制備方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物材料【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，屬于公眾能夠得到的生物材料，具體地說，是一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜及其制備方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]殼聚糖，英文chitosan，是P(I—4)一2—乙酰氨基一2—脫氧一D葡聚糖和2一氨基一2—脫氧一D葡聚糖的共聚物，這種聚陽離子的生物二聚體主要通過對幾丁質(zhì)脫乙?；@得。由于來源廣泛，無毒性、具有良好的組織相容性、生物可降解性和粘附作用，該材料在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域得到了深入研究和廣泛應(yīng)用。Chenite等(見CheniteA,ChaputC,WangD,etal.Novelinjectableneutralsolutionsofchitosanformbiodegradablegelsinsitu[J].Biomaterials,2000，21(21):2155-2161.)應(yīng)用甘油憐酸鈉中和殼聚糖后，得到了PH值中性且在常溫下可長時(shí)間保持液態(tài)的殼聚糖/β形生成水凝膠，而且具有不致癌、不致畸形、不致突變的特性，經(jīng)過滅菌已經(jīng)成為一種可注射的非靜脈的藥物，廣泛應(yīng)用于組織工程學(xué)成為藥物的載體和細(xì)胞支架材料。[0003]生物替代材料作為硬腦膜替代材料具有使用安全有效、易于操作、較柔韌、來源廣泛、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，良好的生物適應(yīng)性。常使用牛肌腱、豬心包、牛心包、羊心包、牛腹膜、豬腹膜、腸系膜代替硬膜。但同時(shí)又有導(dǎo)致粘連、不易保存、不易消毒、有可能發(fā)生免疫反應(yīng)等缺點(diǎn)。[0004]較為理想的人工硬腦膜應(yīng)該具備以下特點(diǎn):①無免疫排斥反應(yīng)、無毒性反應(yīng)，無致癌、致畸作用；②具有延展性，柔韌性，能夠防治感染；③經(jīng)過縫合或黏貼能夠防止腦脊液漏，有效保護(hù)腦組織，與腦組織無粘連，無瘢痕；④在新生類腦膜樣組織生成以后能夠被機(jī)體完全吸收材料來源方便，容易保存；?價(jià)格相對適中。[0005]現(xiàn)有臨床應(yīng)用較多的人工硬腦膜多以進(jìn)口為主，如天義福(DuraMax)、冠昊(NormalGEN)、瑞之來(DuraGen)、但仁思(Durascaffold)價(jià)格昂貴,有較多的盧頁內(nèi)感染及排斥反應(yīng)的病例。腦脊液漏的患者亦較多，均不能完全滿足上述要求。[0006]本發(fā)明旨在研制出更加適合于臨床需要的硬腦膜替代材料。【
發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明的目的是對現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行實(shí)質(zhì)性改進(jìn)和創(chuàng)新，提供一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜，并提供其制備方法。其制備方法具有制作方便，易成膜，成本低廉，便于操作等特點(diǎn)。所制備的復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦為硬膜缺損部位提供有利于成纖維細(xì)胞長入和演生新硬膜組織的海綿狀膠原生物膜支架，與加入萬古霉素或鹽酸氧氟沙星的對于溫度敏感的殼聚糖/β-甘油磷酸鈉復(fù)合物在37°C結(jié)合，制備出具有良好的組織相容性和可降解性，能有效地減少顱內(nèi)感染和腦脊液的滲漏，同時(shí)也減少了腦組織與鄰近組織之間形成瘢痕的新型復(fù)合人工硬腦膜。[0008]本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜，包含萬古霉素或鹽酸氧氟沙星注射液，殼聚糖及β-甘油磷酸鈉，其特征是:將脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料制成海綿狀膠原生物膜支架，應(yīng)用2%(w/v)殼聚糖溶液8ml，56%(w/v)β-甘油磷酸鈉溶液Iml進(jìn)行混合，根據(jù)殼聚糖與β-甘油磷酸鈉溶液復(fù)合物在37°C時(shí)形成水凝膠的溫度敏感性的特性，將0.1g萬古霉素或0.1g鹽酸氧氟沙星注射液1ml，加入殼聚糖與β-甘油磷酸鈉溶液復(fù)合物的溶液浸入已經(jīng)制成的海綿狀膠原生物膜支架的免縫合硬腦膜，在37°C溫箱內(nèi)放置lOmin，水凝膠復(fù)合物均勻浸入海綿狀膠原生物膜支架形成具有抗菌活性的可吸收的人工硬腦膜。[0009]所述的脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料包括牛肌腱、豬心包、牛心包、羊心包、牛腹膜、豬腹膜、牛腸、豬腸和羊腸中的任意一種。[0010]一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜的制備方法，其特征是，它包括以下步驟:1)海綿狀膠原生物膜支架的制備；利用膠原膜冷凍干燥后制備而成，具有多孔疏松狀結(jié)構(gòu)，具有良好的滲透和吸水能力，采用脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料置于75%乙醇溶液及過氧乙酸中浸泡消毒2h，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗3次；將其置于氫氧化鈉溶液浸泡2h，再用磷酸鹽緩沖液沖洗浸泡至PH7.4;將其放在-80°C低溫液氮中冷凍24h，置于真空凍干機(jī)冷凍干燥24h，液氮冷凍粉碎機(jī)粉碎40min，9號篩網(wǎng)取粒徑80μm以下膠原微粒，將膠原微粒與0.5%胰蛋白酶、0.2%乙二胺四乙酸即EDTA按體積比1:5混合，4°〇冰箱振蕩24h,以離心半徑8cm,5000r/min離心20min棄去上清液體；磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗3次，同上法離心后棄上清液，將離心后膠原微粒與Imol/L冰醋酸按體積比1:5混合，膠原微粒與胃蛋白酶按質(zhì)量比100:I混合，4°C冰箱連續(xù)振蕩24h，去除膠原微粒中膠原分子的非螺旋區(qū)，用Imol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.4,以離心半徑8cm,5000r/min離心20min;棄去上清液體,三蒸水反復(fù)清洗3次，以離心半徑8cm,5000r/min離心20min;棄去上清液體,沉淀物置于特制的圓柱形模具中，規(guī)格有6cmX6cm；8cmX8cm；IOcmXIOcm；12cmX120cm,厚度2_4毫米，以真空凍干機(jī)冷凍干燥，-80°C低溫液氮中冷凍24h后，置于冷凍干燥機(jī)成型24h后取出，獲得脫細(xì)胞海綿狀膠原生物膜，真空包裝，環(huán)氧乙烷滅菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?)殼聚糖/β-甘油磷酸鈉復(fù)合物的制備:取36%濃鹽酸0.43ml，加三蒸水至總液量為50ml，取0.43ml鹽酸加入三蒸水的50ml容量瓶中，加三蒸水定容為50毫升，配制成0.1M的稀鹽酸，殼聚糖規(guī)格是:粘度150mPa.s’分子量8.13萬道爾頓，脫乙酞度91%，2g殼聚糖溶解于0.1M的稀鹽酸，23°C室溫下以磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?0分鐘，轉(zhuǎn)速450r/min，混勻制成總量100ml溶液，制備成2%(w/v)殼聚糖溶液，121°C高壓消毒30min，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?6%(w/v)β-甘油磷酸鈉溶液配制56gβ-甘油磷酸鈉，加三蒸水完全溶解，定容至100ml,過濾除菌，121°C高壓消毒30min，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?%(w/v)殼聚糖與56%(w/v)β-甘油磷酸鈉以8:1的比例配制，pH值為7.25，37°C水浴中成為水凝膠時(shí)間為6分鐘；3)取2%(w/v)殼聚糖溶液8ml:56%(w/v)β-甘油磷酸鈉溶液Iml:0.1g萬古霉素或0.1g鹽酸氧氟沙星注射液1ml，三者在4°C均勻混合后，以脫細(xì)胞海綿狀膠原生物膜浸入上述混合溶液，在37°C溫箱內(nèi)放置10分鐘，混合溶液形成水凝膠與膠原生物膜融為一體。[0011]本發(fā)明的一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜，由采用水凝膠復(fù)合物均勻浸入海綿狀膠原生物膜形成的，因?yàn)橛兴z的存在術(shù)中可不需要縫合，與組織有良好的相容性，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明無腦脊液漏發(fā)生；水凝膠中的萬古霉素或鹽酸氧氟沙星在水凝膠逐漸降解中緩慢釋放，達(dá)到防治顱內(nèi)感染的目的；海綿狀膠原膜降解速度與人體自身硬膜生長速度相似，具有良好的可吸收性和組織學(xué)相容性；材料來源廣泛，價(jià)格低廉，使用安全，壽命長。[0012]本發(fā)明的復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜的制備方法科學(xué)、合理，制備流程容易操控，成膜質(zhì)量好，生物學(xué)特性好?！揪唧w實(shí)施方式】[0013]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。[0014]一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜，包含萬古霉素或鹽酸氧氟沙星注射液，殼聚糖及β_甘油磷酸鈉，其特征是:將脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料制成海綿狀膠原生物膜支架，應(yīng)用2%(w/V)殼聚糖溶液8ml,56%(w/ν)β-甘油磷酸鈉溶液Iml進(jìn)行混合,根據(jù)殼聚糖與β-甘油磷酸鈉溶液復(fù)合物在37°C時(shí)形成水凝膠的溫度敏感性的特性，將0.1g萬古霉素或0.1g鹽酸氧氟沙星注射液Iml加入殼聚糖與β-甘油磷酸鈉溶液復(fù)合物的溶液浸入已經(jīng)制成的海綿狀膠原生物膜支架的免縫合硬腦膜，在37°C溫箱內(nèi)放置lOmin，水凝膠復(fù)合物均勻浸入海綿狀膠原生物膜支架形成具有抗菌活性的可吸收的人工硬腦膜。[0015]所述的脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料包括牛肌腱、豬心包、牛心包、羊心包、牛腹膜、豬腹膜、牛腸、豬腸和羊腸中的任意一種。[0016]本發(fā)明通過9個(gè)實(shí)施例的具體實(shí)施，分別采用牛肌腱、豬心包、牛心包、羊心包、牛腹膜、豬腹膜、牛腸、豬腸和羊腸對復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜進(jìn)行制備，均獲得成功。[0017]實(shí)施例1:現(xiàn)以作為脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料之一的牛肌腱為例說明其具體復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜進(jìn)行制備方法，對于所述其它脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料同實(shí)施例1:包括以下步驟:`1)海綿狀膠原生物膜支架的制備；利用膠原膜冷凍干燥后制備而成，具有多孔疏松狀結(jié)構(gòu)，具有良好的滲透和吸水能力，采用脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料之一的牛肌腱置于75%乙醇溶液及過氧乙酸中浸泡消毒2h，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗3次；將其置于氫氧化鈉溶液浸泡2h，再用磷酸鹽緩沖液沖洗浸泡至PH7.4;將其放在_80°C低溫液氮中冷凍24h，置于真空凍干機(jī)冷凍干燥24h，液氮冷凍粉碎機(jī)粉碎40min，9號篩網(wǎng)取粒徑80μm以下膠原微粒，將膠原微粒與0.5%胰蛋白酶、0.2%乙二胺四乙酸即EDTA按體積比1:5混合，4箱振蕩24h,以離心半徑8cm,5000r/min離心20min棄去上清液體；磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗3次，同上法離心后棄上清液，將離心后膠原微粒與Imol/L冰醋酸按體積比1:5混合，膠原微粒與胃蛋白酶按質(zhì)量比100:I混合，4°C冰箱連續(xù)振24h，去除膠原微粒中膠原分子的非螺旋區(qū)，用Imol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.4，以離心半徑8cm,5000r/min離心20min;棄去上清液體,三蒸水反復(fù)清洗3次，以離心半徑8cm,5000r/min離心20min;棄去上清液體,沉淀物置于特制的圓柱形模具中，規(guī)格有6cmX6cm;8cmX8cm；IOcmXIOcm;12cmX120cm,厚度2-4毫米，以真空凍干機(jī)冷凍干燥，-80°C低溫液氮中冷凍24h后，置于冷凍干燥機(jī)成型24h后取出，獲得脫細(xì)胞海綿狀膠原生物膜，真空包裝，環(huán)氧乙烷滅菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?)殼聚糖/β-甘油磷酸鈉復(fù)合物的制備:取36%濃鹽酸0.43ml,加三蒸水至總液量為50ml，取0.43ml鹽酸加入三蒸水的50ml容量瓶中，加三蒸水定容為50毫升，配制成0.1M的稀鹽酸，殼聚糖規(guī)格是:粘度150mPa.s’分子量8.13萬道爾頓，脫乙酞度91%，2g殼聚糖溶解于0.1M的稀鹽酸，23°C室溫下以磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?0分鐘，轉(zhuǎn)速450r/min，混勻制成總量100ml溶液，制備成2%(w/v)殼聚糖溶液，121°C高壓消毒30min，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?6%(w/v)β-甘油磷酸鈉溶液配制56gβ-甘油磷酸鈉，加三蒸水完全溶解，定容至100ml,過濾除菌，121°C高壓消毒30min，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?%(w/v)殼聚糖與56%(w/v)β-甘油磷酸鈉以8:1的比例配制，pH值為7.25，37°C水浴中成為水凝膠時(shí)間為6分鐘；3)取2%(w/v)殼聚糖溶液8ml:56%(w/v)β-甘油磷酸鈉溶液Iml:0.1g萬古霉素或0.1g鹽酸氧氟沙星注射液1ml，三者在4°C均勻混合后，以脫細(xì)胞海綿狀膠原生物膜浸入上述混合溶液，在37°C溫箱內(nèi)放置10分鐘，混合溶液形成水凝膠與膠原生物膜融為一體。[0018]用本發(fā)明一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜制備方法制成的復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜，經(jīng)過30例群體1-10個(gè)月的使用，效果良好，實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明目的和達(dá)到了所述的效果。【權(quán)利要求】1.一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜，包含萬古霉素或鹽酸氧氟沙星注射液，殼聚糖及β-甘油磷酸鈉，其特征是:將脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料制成海綿狀膠原生物膜支架，應(yīng)用2%(w/v)殼聚糖溶液8ml,56%(w/v)β-甘油磷酸鈉溶液Iml進(jìn)行混合,根據(jù)殼聚糖與β-甘油磷酸鈉溶液復(fù)合物在37°C時(shí)形成水凝膠的溫度敏感性的特性，將0.1g萬古霉素或.0.1g鹽酸氧氟沙星注射液Iml加入殼聚糖與β-甘油磷酸鈉溶液復(fù)合物的溶液浸入已經(jīng)制成的海綿狀膠原生物膜支架的免縫合硬腦膜，在37°C溫箱內(nèi)放置lOmin，水凝膠復(fù)合物均勻浸入海綿狀膠原生物膜支架形成具有抗菌活性的可吸收的人工硬腦膜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜，其特征是:脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料包括牛肌腱、豬心包、牛心包、羊心包、牛腹膜、豬腹膜、牛腸、豬腸和羊腸中的任意一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合型可降解的抗菌人工硬腦膜的制備方法，其特征是，它包括以下步驟:.1)海綿狀膠原生物膜支架的制備；利用膠原膜冷凍干燥后制備而成，具有多孔疏松狀結(jié)構(gòu)，具有良好的滲透和吸水能力，采用脫細(xì)胞膜狀生物衍生材料置于75%乙醇溶液及過氧乙酸中浸泡消毒2h，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗3次；將其置于氫氧化鈉溶液浸泡2h，再用磷酸鹽緩沖液沖洗浸泡至PH7.4;將其放在-80°C低溫液氮中冷凍24h，置于真空凍干機(jī)冷凍干燥24h，液氮冷凍粉碎機(jī)粉碎40min，9號篩網(wǎng)取粒徑80μm以下膠原微粒，將膠原微粒與0.5%胰蛋白酶、0.2%乙二胺四乙酸即EDTA按體積比1:5混合，41:冰箱振蕩.24h,以離心半徑8cm,5000r/min離心20min棄去上清液體；磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗3次，同上法離心后棄上清液，將離心后膠原微粒與Imol/L冰醋酸按體積比1:5混合，膠原微粒與胃蛋白酶按質(zhì)量比100:I混合，4°C冰箱連續(xù)振蕩24h，去除膠原微粒中膠原分子的非螺旋區(qū)，用Imol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.4,以離心半徑8cm,5000r/min離心20min;棄去上清液體,三蒸水反復(fù)清洗3次，以離心半徑8cm,5000r/min離心20min;棄去上清液體,沉淀物置于特制的圓柱形模具中，規(guī)格有6cmX6cm；8cmX8cm；IOcmXIOcm；12cmX120cm,厚度2_4毫米，以真空凍干機(jī)冷凍干燥，-80°C低溫液氮中冷凍.24h后，置于冷凍干燥機(jī)成型24h后取出，獲得脫細(xì)胞海綿狀膠原生物膜，真空包裝，環(huán)氧乙烷滅菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?2)殼聚糖/β-甘油磷酸鈉復(fù)合物的制備:取36%濃鹽酸0.43ml,加三蒸水至總液量為.50ml，取0.43ml鹽酸加入三蒸水的50ml容量瓶中，加三蒸水定容為50毫升，配制成0.1M的稀鹽酸，殼聚糖規(guī)格是:粘度150mPa.s’分子量8.13萬道爾頓，脫乙酞度91%，2g殼聚糖溶解于0.1M的稀鹽酸，23°C室溫下以磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?0分鐘，轉(zhuǎn)速450r/min，混勻制成總量100ml溶液，制備成2%(w/v)殼聚糖溶液，121°C高壓消毒30min，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?6%(w/v)β-甘油磷酸鈉溶液配制56gβ-甘油磷酸鈉，加三蒸水完全溶解，定容至.100ml,過濾除菌，121°C高壓消毒30min，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?%(w/v)殼聚糖與56%(w/v)β-甘油磷酸鈉以8:1的比例配制，pH值為7.25，37°C水浴中成為水凝膠時(shí)間為6分鐘；.3)取2%(w/v)殼聚糖溶液8ml:56%(w/v)β-甘油磷酸鈉溶液Iml:0.1g萬古霉素或.0.1g鹽酸氧氟沙星注射液1ml，三者在4°C均勻混合后，以脫細(xì)胞海綿狀膠原生物膜浸入上述混合溶液，在37°C溫箱內(nèi)放置10分鐘，混合溶液形成水凝膠與膠原生物膜融為一體?！疚臋n編號】A61L27/20GK103656749SQ201310659823【公開日】2014年3月26日申請日期:2013年12月10日優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日【發(fā)明者】寧顯賓,張愛榮,何巍,趙長福,逄錦峰,丁照義申請人:北華大學(xué)