本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，涉及干擾素調(diào)節(jié)因子6(Interferon Regulatory Factor-6，IRF6)作為藥物靶標(biāo)在篩選治療心肌肥厚的藥物中的應(yīng)用，以及IRF6的抑制劑在制備治療心肌肥厚的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

心肌肥厚是指在生物學(xué)牽張負(fù)荷或神經(jīng)內(nèi)分泌因素刺激誘導(dǎo)下，正常心臟心肌結(jié)構(gòu)和功能的不斷調(diào)整，主要表現(xiàn)為心室空間構(gòu)象和生物學(xué)效應(yīng)的改變，如局部或大部分甚至整個(gè)心室壁或/和心房壁增厚、心臟質(zhì)量增加并伴隨心臟射血功能改變和心室壁張力變化。病理性心肌肥厚是心臟重塑發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，最初，代償性的肥厚能使心臟應(yīng)對(duì)各種病理性的刺激，但持續(xù)的病理性刺激最終將導(dǎo)致心臟失代償性肥厚，收縮功能受損和典型的心臟重塑[1，2]。在細(xì)胞水平，心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，間質(zhì)成分如成纖維細(xì)胞增殖，膠原合成和分泌增加，并伴隨心肌細(xì)胞凋亡。分子水平上表現(xiàn)為神經(jīng)內(nèi)分泌因子激活，胚胎基因再表達(dá)和興奮收縮耦聯(lián)相關(guān)蛋白、促纖維化相關(guān)基因的表達(dá)水平變化[3]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)心肌肥厚的發(fā)病基礎(chǔ)和臨床防治進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞外配體和細(xì)胞膜受體以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子參與了這一系列改變，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin/NFAT、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)[4]。目前針對(duì)心肌肥厚的主流治療策略是通過(guò)干預(yù)心肌重構(gòu)相關(guān)的分子靶點(diǎn)，改善心功能，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)。臨床上，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素Ⅱ受體Ⅰ阻斷劑(ARBs)、鈣拮抗劑(CAs)被作為主要的抗心肌肥厚藥物[5]。

IRF家族是一大類對(duì)IFN起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。IRF家族包含10個(gè)成員，其中，IRF1-9普遍表達(dá)于哺乳動(dòng)物中，IRF10則特異性地在鳥(niǎo)類和魚(yú)類中表達(dá)。在結(jié)構(gòu)上，IRF家族成員的N末端含有相對(duì)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain，DBD)，C末端包含有IRF相關(guān)結(jié)構(gòu)域(IRF associated domain，IAD)、自我抑制結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)等[6]。IRF6定位于1q32，IRF6雖然在結(jié)構(gòu)上與IRF家族其他成員類似，但我們對(duì)其在天然免疫上的功能知之甚少，甚至有大量研究認(rèn)為IRF6與天然免疫沒(méi)有關(guān)系[7]。目前關(guān)于IRF6的研究主要集中在調(diào)控上皮細(xì)胞的成熟分化方面。IRF6在皮膚角質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，并且在角質(zhì)細(xì)胞分化成熟的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)IRF6能夠與p63家族成員DeltaNp63形成一個(gè)調(diào)控環(huán)路來(lái)抑制角質(zhì)細(xì)胞的增殖。Wnt信號(hào)通路則作為p63/IRF6上游參與這個(gè)過(guò)程，Wnt減少能阻斷p63/IRF6信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖增多，凋亡減少[8]。此外，在角質(zhì)細(xì)胞中，IRF6作為Notch的主要靶分子參與Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)角質(zhì)細(xì)胞的分化和腫瘤抑制功能[9]。TGF-β/Smad4信號(hào)通路能夠激活I(lǐng)RF6，并調(diào)節(jié)下游p21的表達(dá)參與顱面愈合[10]。IRF6的突變與以唇腭裂為特征的人類先天性綜合征—范德伍綜合征(Vander Woude syndrome)和腘翼狀胬肉綜合征(popliteal pterygium syndrome)的發(fā)生直接相關(guān)。定點(diǎn)敲入人類綜合征中常見(jiàn)的突變位點(diǎn)R84C的小鼠和IRF6基因完全敲除小鼠均出現(xiàn)角質(zhì)細(xì)胞分化和增殖異常，并且能夠重現(xiàn)范德伍綜合征的表型[11，12]。綜上所述，IRF6執(zhí)行其生物學(xué)功能均為通過(guò)非免疫依賴的方式實(shí)現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)：

1.Frey N,Olson EN.Cardiac hypertrophy:the good,the bad,and the ugly.Annual review of physiology.2003；65:45-79.

2.Hill JA,Olson EN.Cardiac plasticity.The New England journal of medicine.2008 Mar 27；358(13):1370-80.

3.Kubota T,McTiernan CF,Frye CS,Slawson SE,Lemster BH,Koretsky AP,Demetris AJ,Feldman AM.Dilated cardiomyopathy in transgenic mice with cardiac-specific overexpression of tumor necrosis factor-alpha.Circulation research.1997 Oct；81(4):627-35.

4.Krum H.Decade in review--heart failure:10 Years of progress in HF research--what have we learned？Nature reviews Cardiology.2014 Nov；11(11):631-3.

5.von Lueder TG,Krum H.New medical therapies for heart failure.Nature reviews Cardiology.2015 Dec；12(12):730-40.

6.Ikushima H,Negishi H,Taniguchi T.The IRF family transcription factors at the interface of innate and adaptive immune responses.Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology.2013 Oct；78:105-16.

7.Moretti F,Marinari B,Lo Iacono N,Botti E,Giunta A,et al.A regulatory feedback loop involving p63 and IRF6 links the pathogenesis of 2 genetically different human ectodermal dysplasias.The Journal of clinical investigation.2010 May；120(5):1570-7.

8.Kurosaka H,Iulianella A,Williams T,Trainor PA.Disrupting hedgehog and WNT signaling interactions promotes cleft lip pathogenesis.The Journal of clinical investigation.2014 Apr；124(4):1660-71.

9.Restivo G,Nguyen BC,Dziunycz P,Ristorcelli E,Ryan RJ,et al.IRF6is a mediator of Notch pro-differentiation and tumour suppressive function in keratinocytes.The EMBO journal.2011 Nov 16；30(22):4571-85.

10.Iwata J,Suzuki A,Pelikan RC,Ho TV,Sanchez-Lara PA,et al.Smad4-Irf6 genetic interaction and TGFbeta-mediated IRF6 signaling cascade are crucial for palatal fusion in mice.Development.2013 Mar；140(6):1220-30.

11.Kondo S,Schutte BC,Richardson RJ,Bjork BC,Knight AS,et al.Mutations in IRF6 cause Van der Woude and popliteal pterygium syndromes.Nature genetics.2002 Oct；32(2):285-9.

12.Ingraham CR,Kinoshita A,Kondo S,Yang B,Sajan S,et al.Abnormal skin,limb and craniofacial morphogenesis in mice deficient for interferon regulatory factor 6(Irf6).Nature genetics.2006 Nov；38(11):1335-40.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為改進(jìn)臨床防治心肌肥厚疾病現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于確定IRF6基因的表達(dá)與心肌肥厚疾病間的相互關(guān)系，提供IRF6作為藥物靶標(biāo)在篩選、防治心肌肥厚疾病藥物中的應(yīng)用，進(jìn)而提供IRF6的抑制劑在制備防治心肌肥厚疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

1、IRF6基因敲除顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，改善心功能

本發(fā)明選用心臟特異性α-MHC-MCM小鼠、IRF6心臟特異性基因敲除小鼠(IRF6-CKO)、用于構(gòu)建IRF6-CKO的條件性敲除小鼠(IRF5-flox，IRF6正常表達(dá))進(jìn)行試驗(yàn)，并將每種小鼠分成假手術(shù)組和手術(shù)組，每組10只小鼠。手術(shù)組給予主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，假手術(shù)組不予主動(dòng)脈弓縮窄，然后通過(guò)對(duì)假手術(shù)組和手術(shù)組的各組小鼠進(jìn)行心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測(cè)定，研究IRF6基因敲除對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚的影響。結(jié)果表明敲除基因所致的IRF6缺陷顯著地抑制心肌肥厚、纖維化及改善心功能。

2、IRF6基因過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了心肌肥厚及其纖維化，惡化心功能

本發(fā)明選用心臟特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，并將每種小鼠分成假手術(shù)組和手術(shù)組，每組10只小鼠。手術(shù)組給予主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，假手術(shù)組不予主動(dòng)脈弓縮窄，然后通過(guò)對(duì)假手術(shù)組和手術(shù)組的各組小鼠進(jìn)行心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測(cè)定，研究IRF6基因過(guò)表達(dá)對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚的影響。結(jié)果表明過(guò)表達(dá)IRF6基因顯著地促進(jìn)心肌肥厚、纖維化，并惡化心功能。

3、IRF6干擾(AdshIRF6)及過(guò)表達(dá)(AdIRF6)腺病毒對(duì)經(jīng)Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型的影響

本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建重組腺病毒AdshIRF6及AdIRF6感染SD乳鼠原代心肌細(xì)胞，予以Ang II刺激構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型，對(duì)照組則予以PBS，經(jīng)免疫熒光監(jiān)測(cè)及心肌細(xì)胞表面積統(tǒng)計(jì)表明，在Ang II刺激下IRF6干擾病毒明顯抑制心肌細(xì)胞肥大，心肌細(xì)胞表面積減??；IRF6過(guò)表達(dá)病毒顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，心肌細(xì)胞表面積增大。

由上述結(jié)果可知在心肌肥厚的模型中，IRF6的表達(dá)與正常組相比顯著上調(diào)。IRF6基因缺陷抑制了心肌肥厚、纖維化，改善心功能；促進(jìn)IRF6表達(dá)則促進(jìn)心肌肥厚、纖維化，惡化心功能。本發(fā)明的研究證明了：在主動(dòng)脈縮窄術(shù)造成心肌肥厚模型中，IRF6具有促進(jìn)心肌肥厚及其纖維化，惡化心功能的作用。

因此，針對(duì)上述功能，IRF6基因可作為藥物靶點(diǎn)，構(gòu)建IRF6基因過(guò)表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，從而用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物；IRF6基因也可作為基因治療中的靶基因，在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并制備預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物和/或生物學(xué)試劑，通過(guò)基因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的目的。例如，以IRF6為靶基因設(shè)計(jì)干擾IRF6表達(dá)的雙鏈siRNA，通過(guò)化學(xué)方法合成后注射入人體，通過(guò)RNA干擾的方法使IRF6基因沉默以治療心肌肥厚疾??；此外還可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建IRF6的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競(jìng)爭(zhēng)IRF6原型的作用底物，從而抑制IRF6的功能，達(dá)到治療目的；另還可以IRF6為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子化合物抑制劑，利用IRF6基因過(guò)表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制IRF6的分子，從而為心肌肥厚疾病提供新的治療性分子。

本發(fā)明針對(duì)IRF6的上述功能，提供IRF6作為藥物靶標(biāo)，在篩選保護(hù)心臟功能、預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚及抗心肌纖維化的藥物中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用是非診斷和非治療的目的；所述的篩選是指篩選IRF6的抑制劑。

本發(fā)明針對(duì)IRF6的上述功能，提供IRF6的抑制劑在制備保護(hù)心臟功能和預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚及抗心肌纖維化的藥物中的應(yīng)用。

一種保護(hù)心臟功能的藥物，包含IRF6的抑制劑。

一種預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物，包含IRF6的抑制劑。

一種抗心肌纖維化的藥物，包含IRF6的抑制劑。

所述的IRF6的抑制劑具有本領(lǐng)域公知的含義，其可以是能夠特異抑制IRF6對(duì)靶基因的調(diào)控作用的任何物質(zhì)，可以是在細(xì)胞中特異抑制IRF6表達(dá)的物質(zhì)，也可以是與IRF6具有特異性相互作用并能減弱IRF6作用的物質(zhì)。優(yōu)選為IRF6基因的siRNA、IRF6基因的RNA干擾載體，IRF6的抗體及其他能夠抑制IRF6表達(dá)的抑制劑中的一種。

一種篩選用于保護(hù)心臟功能和預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物的方法，為篩選IRF6的抑制劑的方法，包括根據(jù)IRF6的序列設(shè)計(jì)其反義RNA，或者將IRF6與候選物質(zhì)接觸，檢測(cè)IRF6的表達(dá)或作用，并選擇特異抑制IRF6表達(dá)或減弱IRF6作用的候選物質(zhì)。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)IRF6的新功能，即IRF6具有促進(jìn)心肌肥厚及其纖維化，惡化心功能的作用。

(2)基于IRF6的功能，其為研制保護(hù)心臟功能、預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物提供靶標(biāo)。

(3)IRF6的抑制劑可用于制備保護(hù)心臟功能、預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物。

附圖說(shuō)明

圖1是心臟特異性敲除IRF6小鼠的打靶策略及IRF6蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖。其中，A為心臟特異性敲除IRF6小鼠的打靶策略圖；B心肌細(xì)胞特異性IRF6基因敲除小鼠(IRF6-CKO)心臟組織中的IRF6蛋白表達(dá)水平Western Blot檢測(cè)結(jié)果，與野生型小鼠相比，心肌細(xì)胞特異性IRF6基因敲除小鼠(IRF6-CKO)心臟組織中的IRF6蛋白表達(dá)水平顯著降低。

圖2是心臟特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建策略及IRF6蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖。其中，A為心臟特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建策略圖；B為心臟組織總蛋白中NTG與TG小鼠IRF6蛋白的表達(dá)量Western Blot檢測(cè)結(jié)果，圖中TG2-TG6是構(gòu)建的不同個(gè)體的IRF6-TG小鼠。

圖3是正常人和擴(kuò)張性心肌病患者心臟中IRF6蛋白的表達(dá)圖，GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果顯示擴(kuò)張性心肌病患者心臟中IRF6的表達(dá)上調(diào)(*：p＜0.05vs正常人組)。

圖4是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術(shù)4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示IRF6敲除降低HW/BW、LW/BW及HW/TL(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham組，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB組)。

圖5是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術(shù)4周后心臟組織HE、WGA染色及心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示IRF6敲除減輕心肌細(xì)胞肥大(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham組，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB組)。

圖6是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術(shù)4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結(jié)果顯示IRF6敲除減輕心臟的纖維化(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham組，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB組)。

圖7是NTG和IRF6-TG小鼠AB術(shù)4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示IRF6過(guò)表達(dá)組HW/BW、LW/BW及HW/TL升高(*：p＜0.05vs NTG Sham組，#：p＜0.05vs NTG AB組)。

圖8是NTG和IRF6-TG小鼠AB術(shù)4周后心臟組織HE、WGA染色及心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示IRF6過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大(*：p＜0.05vs NTG Sham組，#：p＜0.05vs NTG AB組)。

圖9是NTG和IRF6-TG小鼠AB術(shù)4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結(jié)果顯示IRF6過(guò)表達(dá)會(huì)加重心臟的纖維化(*：p＜0.05vs NTG Sham組，#：p＜0.05vs NTG AB組)。

圖10是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術(shù)4周后超聲檢測(cè)心功能結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示敲除IRF6改善心功能；其中，LVEDD為左室舒張末期內(nèi)徑、LVESD為左室收縮末期內(nèi)徑、FS為短軸縮短率(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham組，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB組)。

圖11是NTG和IRF6-TG小鼠AB術(shù)4周后超聲檢測(cè)心功能結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)IRF6心功能惡化；其中，LVEDD為左室舒張末期內(nèi)徑、LVESD為左室收縮末期內(nèi)徑、FS為短軸縮短率(*：p＜0.05vs NTG Sham組，#：p＜0.05vs NTG AB組)。

圖12是SD乳鼠原代心肌細(xì)胞用腺病毒AdshRNA、AdshIRF6、AdGFP、AdIRF6感染，經(jīng)Ang II刺激后的免疫熒光及細(xì)胞表面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖，IRF6的過(guò)表達(dá)病毒促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，IRF6的干擾病毒抑制心肌細(xì)胞肥大。(*：p＜0.05vs AdshRNA/AdGFP PBS組，#：p＜0.05vs AdshRNA/AdGFP Ang II組)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)行一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用8-10周齡、體重23.5-27.5g、雄性的心臟特異性Cre小鼠(α-MHC-Cre(α-MHC-MCM)，背景為C57BL/6，購(gòu)自Jackson Laboratory，貨號(hào)005650)、IRF6-flox條件性敲除小鼠(IRF6-flox)、心臟特異性IRF6基因敲除小鼠(IRF6-CKO)、心臟特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠(IRF6-TG)及非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG，同齡同窩對(duì)照非轉(zhuǎn)基因小鼠)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

飼養(yǎng)環(huán)境：所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SRF級(jí)小鼠飼料購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。

實(shí)施例1心臟特異性IRF6基因敲除小鼠以及IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

1.心臟特異性IRF6基因敲除小鼠的構(gòu)建(構(gòu)建策略見(jiàn)圖1A)

利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建心臟特異性IRF6基因敲除小鼠。首先，通過(guò)在線CRISPR設(shè)計(jì)工具(http://crispr.mit.edu)分別在小鼠IRF6基因內(nèi)含子2和3中各設(shè)計(jì)一個(gè)CRISPR的打靶位點(diǎn)，靶序列分別為：

IRF6-sgRNA 1：GGTCTGGGGCGACATTGTACAGC AGG，

IRF6-sgRNA 2：GGCGTGTTAGTAAGCCGAAGTCAC AGG。

此外還設(shè)計(jì)了一個(gè)用于同源修復(fù)的供體載體(Donor Vector)，它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子3以及兩個(gè)同向的loxp序列。

(1)打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對(duì)應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶BsaI處理過(guò)的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個(gè)T7啟動(dòng)子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

(2)條件性敲除骨架載體pBluescript SK(+)-2loxp的構(gòu)建：

分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：

loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，

loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；

loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，

loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；

上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescript II SK(+)載體用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測(cè)序正確的載體用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescript SK(+)-2loxp。

(3)供體載體的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)如下引物(表1)用于擴(kuò)增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后得到3個(gè)片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescript SK(+)-2loxp中，得到供體載體。

表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)

(4)打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對(duì)CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個(gè)部分(負(fù)責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點(diǎn)的gRNA)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。對(duì)于Cas9蛋白，將其表達(dá)載體pST1374-Cas9(Addgene 44758)用PmeI進(jìn)行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7mMESSAGE mMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對(duì)上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對(duì)于sgRNA，使用MEGAshortscript^TM Kit(AM1354，Ambion公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)進(jìn)行純化。

(5)IRF6-flox條件性敲除小鼠的制作

將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進(jìn)行培育。得到的小鼠進(jìn)行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過(guò)PCR方法篩選陽(yáng)性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機(jī)挑選一只作為F0代進(jìn)行后續(xù)的繁殖，最終獲得IRF6-flox純合小鼠。

(6)心臟特異性IRF6基因敲除小鼠的制作

將上述IRF6-floxed小鼠與心臟特異性α-MHC-Cre(購(gòu)自Jackson Laboratory，貨號(hào)005650)轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到IRF6^flox/flox/α-MHC-Cre小鼠，待該小鼠長(zhǎng)至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen(他莫昔芬)，誘導(dǎo)Cre酶的表達(dá)，Cre酶特異性的識(shí)別兩個(gè)同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個(gè)loxp，最后得到心臟細(xì)胞特異性IRF6基因敲除小鼠。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取對(duì)應(yīng)組織總蛋白，使用Western Blot方法檢測(cè)IRF6敲除小鼠與WT小鼠心臟組織中IRF6蛋白表達(dá)量(圖1B)，可見(jiàn)IRF6-CKO小鼠體內(nèi)，IRF6蛋白表達(dá)含量顯著降低。

(2)心臟特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建(構(gòu)建策略見(jiàn)圖2A)

以C57BL/6小鼠IRF6基因的cDNA為模板，用如下引物PCR擴(kuò)增IRF6基因(NCBI，Gene ID：54139，NM_006147.3)：

上游引物：5’-GCTCTAGAGCCACCATGGCCCTCCACCCCC-3’，

下游引物：5’-GCTCTAGATTACTGGGGAGGCAGGGC-3’。

把擴(kuò)增得到的產(chǎn)物和pCAG-CAT-LacZ載體(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院楊青林老師實(shí)驗(yàn)室提供，制備過(guò)程參見(jiàn)參考文獻(xiàn)：Kim T,Zhelyabovska O,Liu J,et al.Generation of an Inducible,Cardiomyocyte-Specific Transgenic Mouse Model with PPAR b/d Overexpression[J].Peroxisome Proliferator-Activated Receptors(PPARs),57.)用限制性內(nèi)切酶XbaI(NEB，#R0145L)酶切后連接，得到轉(zhuǎn)基因載體pCAG-CAT-IRF6-polyA，IRF6的表達(dá)由CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)得到。

將構(gòu)建的pCAG-CAT-IRF6-polyA載體通過(guò)顯微注射構(gòu)造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到IRF6-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠。心臟特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠由IRF6-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠和α-MHC-Cre(購(gòu)自Jackson Laboratory，貨號(hào)005650)小鼠雜交繁殖得到，方法同上述基因敲除小鼠的構(gòu)建。

取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取對(duì)應(yīng)組織總蛋白，使用Western Blot方法篩選IRF6表達(dá)量最高的小鼠。將其同窩陽(yáng)性鼠繼續(xù)繁殖，從而獲得穩(wěn)定遺傳心臟特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠品系。為了反映病理生理狀態(tài)下IRF6的改變，本發(fā)明選擇了IRF6-TG5小鼠，Western Blot及定量分析顯示，其心臟組織中IRF6表達(dá)量約為正常組織4.5倍(圖2B)。

實(shí)施例2IRF6在正常人和心肌病患者心臟中的表達(dá)

選用正常人心臟(非心臟原因的死亡捐獻(xiàn)的個(gè)體)、擴(kuò)張型心肌病患者心臟移植手術(shù)病人置換的受體)，對(duì)心臟提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)，結(jié)合特異性識(shí)別IRF6的抗體進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定其IRF6的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，擴(kuò)張型心肌病患者心臟中IRF6的表達(dá)明顯上調(diào)。

實(shí)施例3心肌肥厚模型的獲得

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：通過(guò)主動(dòng)脈縮窄(AB)術(shù)建立心肌肥厚模型。隨機(jī)分為10組，分組如下：對(duì)照組假手術(shù)組(α-MHC-MCM Sham、IRF6-flox Sham)及對(duì)照組AB術(shù)組(α-MHC-MCM AB、IRF6-flox AB)、IRF6基因敲除小鼠假手術(shù)組(IRF6-CKO Sham)及AB術(shù)組(IRF6-CKO AB)、非轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組(NTG Sham)及AB術(shù)組(NTG AB)、心臟特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組(TG Sham)及AB術(shù)組(TG AB)。

2.心肌肥厚模型采用主動(dòng)脈弓縮窄(AB)手術(shù)，模型操作流程：

2.1術(shù)前準(zhǔn)備

(1)麻醉：先給小鼠稱重，按照90mg/kg體重計(jì)算所需麻藥(3％戊巴比妥鈉)量，通過(guò)腹腔注射，并記錄注射時(shí)間點(diǎn)。夾尾、夾趾無(wú)明顯反應(yīng)且小鼠狀態(tài)良好為麻醉成功標(biāo)準(zhǔn)(一般注射后約10min無(wú)明顯反應(yīng)，以麻醉后約50min小鼠夾趾有反應(yīng)，麻醉后30min左右為最佳手術(shù)時(shí)間)。

(2)術(shù)區(qū)準(zhǔn)備：將小鼠左胸部、左側(cè)胸部及左前肢腋下的皮膚去毛。剃毛后用濕紗布擦拭術(shù)區(qū)去除鼠毛，以不影響手術(shù)視野為宜。

(3)氣管插管：用橡皮筋將小鼠上門(mén)齒固定于V形板斜面上，并迅速將氣管插管經(jīng)聲門(mén)準(zhǔn)確插入氣管內(nèi)，隨后右側(cè)臥位置于加熱墊上(加熱墊需提前預(yù)熱)，然后將氣管插管與呼吸機(jī)連接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致，說(shuō)明氣管插管成功。

2.2主動(dòng)脈弓降支結(jié)扎術(shù)

取右側(cè)臥位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用醫(yī)用膠帶將兩前肢固定。右胸部下方墊入棉簽，抬高胸廓，依次用碘酒及體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精對(duì)手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。左手持眼科鑷將左胸部皮膚捏起，右手持眼科剪剪開(kāi)皮膚約1cm，依次分離肌肉及軟組織，于第2-3肋水平打開(kāi)胸腔，用棉簽稍撥開(kāi)左肺，游離主動(dòng)脈弓降支，將7-0手術(shù)縫線穿過(guò)血管，并在血管上方平行放置一段26G(25.0-27.5g小鼠)或者27G(23.5-25.0g)注射器針頭，將血管及針頭一起結(jié)扎好，再抽出針頭即可達(dá)到相應(yīng)程度的血管縮窄。結(jié)扎完畢后依次縫合，關(guān)閉胸腔，用注射器從縫口處插入胸腔并抽出1cc氣體以恢復(fù)胸腔內(nèi)負(fù)壓，拔出注射器后迅速縫合皮膚切口。假手術(shù)組(Sham)在游離出主動(dòng)脈降支后只穿線不結(jié)扎，其余步驟同心肌肥厚模型組。

2.3術(shù)后護(hù)理

主動(dòng)脈弓降支結(jié)扎術(shù)后，待小鼠出現(xiàn)自主呼吸、夾趾出現(xiàn)強(qiáng)烈反應(yīng)，拔出氣管插管，并將小鼠放入裝有高壓滅菌過(guò)的墊料、飼料和飲用水的飼養(yǎng)籠內(nèi)，于飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。IRF6基因敲除小鼠及對(duì)照組小鼠術(shù)后4周、非轉(zhuǎn)基因小鼠及心臟特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠術(shù)后4周分別進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。

實(shí)施例4心肌肥厚模型小鼠病理學(xué)檢測(cè)

1.取材

(1)前期工作：預(yù)先準(zhǔn)備裝有20mL的體積分?jǐn)?shù)10％甲醛的尿杯，并貼好標(biāo)簽(小鼠編號(hào)、組別、手術(shù)類型及取材日期)。將倒?jié)M質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％KCl溶液的培養(yǎng)皿置于取材處。打開(kāi)分析天平，調(diào)零備用。再稱重處死小鼠。

(2)取材：眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％KCl溶液中。待心臟停跳在舒張期后，置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內(nèi)液體，蘸干表面液體后，稱重并記錄，將心臟放入相應(yīng)的尿杯中，固定48h后用于病理學(xué)檢測(cè)。

(3)相關(guān)測(cè)量及計(jì)算：取出小鼠心臟、肺臟，修剪后濾紙吸干，稱重并記錄。剪開(kāi)小鼠后肢脛骨處皮膚，測(cè)量并記錄脛骨長(zhǎng)度。計(jì)算心重與體重的比值(HW/BW)，肺重與體重的比值(LW/BW)以及心重與脛骨長(zhǎng)度的比值(HW/TL)。

2.病理學(xué)檢測(cè)

2.1制備石蠟標(biāo)本切片

主要操作程序包括修剪心臟→包埋框處理→流水沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→攤片→晾干或烘烤后備用。

2.2蘇木精-伊紅(HE)染色

主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→雙蒸水1min→蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL 70％酒精充分混合均勻)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氫鈉0.35g，七水硫酸鎂2g，兩者溶于100mL蒸餾水)1min→水洗1min→伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)3-5min→蒸餾水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。

2.3麥胚凝集素染色(WGA染色)

主要步驟為：將石蠟切片置于烘箱烘烤60min→二甲苯脫蠟5min，3次→100％乙醇5min，2次→95％乙醇5min→70％乙醇5min→雙蒸水浸洗5min，2次→PBS洗5min，2次→甩盡玻片上水分，用免疫組化筆在組織周圍畫(huà)圈→50μg/ml WGA-FITC，濕盒內(nèi)孵育30min→PBS洗5min，3次→DAPI復(fù)染8min→使用水溶性封片劑封片，置于4℃冰箱內(nèi)避光保存。

于熒光顯微鏡400倍下拍照，并使用ImagePro Plus 6.0軟件測(cè)算圓形或近似圓形的左室單個(gè)心肌細(xì)胞橫截面積。要求統(tǒng)計(jì)每組不少于5只小鼠，每只小鼠不少于100個(gè)細(xì)胞。

2.4天狼星紅(PSR)染色

主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水沖洗10min→雙蒸水1min→質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2％磷鉬酸2min→0.1％天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上，濕盒中染色90min→去除殘液→0.01N鹽酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。

心肌組織由心肌細(xì)胞和間質(zhì)組織組成，心臟是一終末分化器官，心肌細(xì)胞失去增殖能力，各種生理或病理性刺激引起的心肌細(xì)胞反應(yīng)，只能是單個(gè)細(xì)胞的體積增大而不能在數(shù)量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理過(guò)程中，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大，肌節(jié)數(shù)量增多，細(xì)胞排列紊亂，心臟間質(zhì)改變包括心肌成纖維細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化，膠原纖維密度增加，膠原分泌增加，膠原比例平衡失調(diào)等。

α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術(shù)后的表型結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5、圖6。Sham(假手術(shù))組中對(duì)照組α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠與IRF6-CKO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠AB術(shù)后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham組；AB術(shù)后4周，IRF6-CKO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均較α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠降低(圖4)。心臟表型，Sham組心臟無(wú)明顯差異，AB組較Sham組的心臟均增大，IRF6-CKO小鼠的心臟增大程度明顯小于對(duì)照組小鼠。HE及WGA染色切片可觀察到：Sham組心肌肌原纖維細(xì)胞排列整齊、致密，形態(tài)完整，胞核及核仁結(jié)構(gòu)清晰；AB組肌絲排列紊亂、松散，心肌細(xì)胞體積明顯增大，形態(tài)不規(guī)整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，而IRF6-CKO組較α-MHC-MCM、IRF6-flox組細(xì)胞肥大減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。PSR染色后，發(fā)現(xiàn)AB組心室心肌間質(zhì)膠原含量較Sham組增加，動(dòng)脈血管周圍膠原增加更為明顯，膠原增粗，排列紊亂成網(wǎng)絡(luò)狀；AB術(shù)后IRF6-CKO小鼠膠原含量及血管周圍膠原含量低于對(duì)照組小鼠(圖6)。以上結(jié)果說(shuō)明經(jīng)AB術(shù)后，小鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚，而IRF6-CKO小鼠的心肌肥厚程度輕于α-MHC-MCM、IRF6-flox對(duì)照組小鼠。

圖7、圖8、圖9是NTG和IRF6-TG小鼠AB術(shù)后的表型結(jié)果。同樣NTG小鼠AB術(shù)后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham組；AB術(shù)后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明顯大于NTG小鼠(圖7)。心臟表型，AB組較Sham組的心臟均增大，且AB術(shù)后TG小鼠心臟增大的程度遠(yuǎn)大于NTG小鼠。HE及WGA染色切片可觀察到：TG小鼠AB術(shù)后心肌細(xì)胞橫截面積大于Sham組，AB組TG小鼠顯著大于NTG小鼠(圖8)。PSR染色可見(jiàn)：TG小鼠AB術(shù)后心肌間質(zhì)膠原含量及血管周圍膠原含量均高于NTG小鼠AB組(圖9)。以上結(jié)果說(shuō)明經(jīng)AB術(shù)后，小鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚，IRF6-TG小鼠的心肌肥厚程度較NTG小鼠更重。

實(shí)施例5心肌肥厚模型小鼠超聲檢測(cè)心功能

1.前期準(zhǔn)備

(1)麻醉機(jī)準(zhǔn)備：先連接氧氣瓶和麻醉機(jī)上的進(jìn)氣接口，再擰開(kāi)麻醉機(jī)上加藥口密封蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度后擰緊密封蓋。擰開(kāi)氧氣瓶上總閥門(mén)，調(diào)整流量控制閥的旋鈕，出氣壓力維持在0.2-0.3mPa。

(2)待測(cè)小鼠準(zhǔn)備：待檢測(cè)小鼠用異氟烷迅速麻醉后，左胸前區(qū)剃毛，將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導(dǎo)管套頭內(nèi)，以1.5-2.0％異氟烷維持小鼠穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)。

2.心功能檢測(cè)

小鼠取左側(cè)臥位或仰臥位，并在剃毛區(qū)均勻涂抹超聲耦合劑(天津成信公司)。采用高頻超聲診斷儀，頻率為15MHz，選取標(biāo)準(zhǔn)左心室乳頭肌短軸切面，測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)及短軸縮短率(FS)。

本實(shí)施例運(yùn)用M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)評(píng)價(jià)心肌肥厚和心功能。圖10是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術(shù)后心功能檢測(cè)結(jié)果。與對(duì)照的Sham組相比，AB組術(shù)后4周表現(xiàn)出心功能減弱和心肌肥厚，主要表現(xiàn)為心肌肥厚的指標(biāo)LVEDD、LVESD均不同程度的增加，而反映心功能的指標(biāo)FS則下降。AB術(shù)后4周，IRF6-CKO小鼠心肌肥厚的指標(biāo)增大的程度及反映心功能的指標(biāo)下降的程度輕于α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠。這些結(jié)果與IRF6-CKO小鼠心肌肥厚減輕的結(jié)果一致。

圖11是NTG和IRF6-TG小鼠AB術(shù)后的超聲檢測(cè)結(jié)果。與NTG Sham組相比，NTG小鼠AB術(shù)后4周表現(xiàn)出心功能降低及心肌肥厚。主要表現(xiàn)為心肌肥厚的指標(biāo)LVEDD、LVESD升高，而反映心功能的指標(biāo)FS則下降。AB術(shù)后4周，與NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚指標(biāo)升高的程度及反映心功能的指標(biāo)下降的程度均明顯高于NTG組。這些結(jié)果與TG小鼠心肌肥厚顯著加重的結(jié)果一致。

實(shí)施例6IRF6干擾(AdshIRF6)及過(guò)表達(dá)(AdIRF6)腺病毒對(duì)Ang II刺激的原代心肌細(xì)胞肥大的影響

1.原代新生SD大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)

(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，頸部以下75％酒精消毒，用眼科剪和顯微鑷取下心臟，放入盛有10mL DMEM/F12培養(yǎng)基的玻璃平皿中。再取另一只，重復(fù)以上過(guò)程。

(2)用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗心臟，并將心臟剪成1-2mm³的碎片。轉(zhuǎn)入到放有轉(zhuǎn)子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。轉(zhuǎn)速為120r/min，消化15min，靜止數(shù)秒鐘，棄去上清液。

(3)加入胰酶消化液，轉(zhuǎn)速為120r/min，消化15min。靜止數(shù)秒鐘，吸取上清液，用含20％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，并置于4℃冰箱保存。重復(fù)該步驟，循環(huán)若干次。取上清時(shí)應(yīng)盡量取盡，當(dāng)組織塊變白并明顯變小時(shí)，終止消化。

(4)將收集好的心肌細(xì)胞懸液以1500rpm轉(zhuǎn)速離心8min，棄去上清液。在離心管中加入適量培養(yǎng)基，輕柔吹打重懸細(xì)胞，集中至1個(gè)50mL離心管中，細(xì)胞懸液用細(xì)胞40μm過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾。

(5)將細(xì)胞接種在100mm的培養(yǎng)皿中，差時(shí)貼壁90min，吸取未貼壁的細(xì)胞懸液過(guò)濾。根據(jù)細(xì)胞懸液的總量加入Brdu(終濃度0.1mM)，混勻之后，加入到用0.1％明膠包被的器皿中。

(6)輕搖分散細(xì)胞，勿漩渦搖晃。37℃、5％CO₂孵育48小時(shí)用PBS清洗1次，更換培養(yǎng)基。

2.IRF6干擾(AdshIRF6)及過(guò)表達(dá)(AdIRF6)腺病毒對(duì)經(jīng)Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型的影響

AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作對(duì)照)、AdshIRF6(含shRNA-IRF6(沉默RNA-IRF6融合蛋白)的腺病毒，沉默IRF6表達(dá))、AdGFP(含GFP(綠色熒光蛋白)的腺病毒，用作對(duì)照)及AdIRF6(含GFP-IRF6(綠色熒光蛋白-IRF6融合蛋白，IRF6過(guò)表達(dá))的腺病毒)。

(1)重組腺病毒構(gòu)建

從美國(guó)InvivoGen公司購(gòu)得IRF6的表達(dá)載體，應(yīng)用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)AdenoVec構(gòu)建重組AdGFP、AdIRF6；從美國(guó)SuperArray公司購(gòu)得shRNA、shIRF6載體，然后應(yīng)用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)AdenoVec構(gòu)建重組AdshRNA、AdshIRF6。

(2)重組腺病毒的鑒定

取病毒粗提液加入裂解液，經(jīng)混勻、離心后取上清液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳鑒定。

(3)重組腺病毒的擴(kuò)增

轉(zhuǎn)染前接種HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到50-70％匯合時(shí)換液，加入含有重組腺病毒載體的新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)90分鐘后再添加新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)至大約有50％的細(xì)胞從培養(yǎng)板上脫落時(shí)，收集細(xì)胞懸液。反復(fù)凍融以制備病毒粗提液，通過(guò)CsCl密度梯度超速離心法純化病毒液。

(4)重組腺病毒滴度測(cè)定

在96孔板中接種HEK293細(xì)胞，24小時(shí)后加入倍比稀釋的病毒液，1-10列加入稀釋的病毒液，每個(gè)濃度8個(gè)重復(fù)孔，11-12列加入無(wú)病毒完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)10天后在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，計(jì)算每個(gè)濃度的陽(yáng)性率。病毒滴度采用Spearman-Karber Method計(jì)算：滴度(pfu/mL)＝10^(x+0.8)，x＝各濃度陽(yáng)性率總和。前提條件：陰性對(duì)照無(wú)CPE和生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象；最小稀釋濃度組均有CPE；最大稀釋濃度組均無(wú)CPE。

(5)重組腺病毒作用的鑒定

用2×10⁸pfu/virus濃度的AdIRF6和AdGFP及AdshIRF6和AdshRNA感染6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的心肌細(xì)胞(約80％匯合度)，24小時(shí)后收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液裂解50分鐘后收集上清，取50μg樣品經(jīng)10％SDS-PAGE電泳分離后，用IRF6特異性抗體做Western Blot分析。根據(jù)IRF6蛋白的表達(dá)，確定腺病毒AdIRF6和AdGFP及AdshIRF6和AdshRNA是否能發(fā)揮預(yù)期作用。由AdGFP和AdshRNA感染的細(xì)胞IRF6蛋白表達(dá)含量不變。由AdshIRF6感染的細(xì)胞IRF6蛋白表達(dá)含量顯著減少；相反的，由AdIRF6感染的細(xì)胞IRF6蛋白表達(dá)含量顯著增加。

腺病毒10MOIs分別感染培養(yǎng)3天的原代心肌細(xì)胞，12小時(shí)后用1μM血管緊張素II(Ang II)(購(gòu)自Sigma，A9525)或?qū)φ誔BS刺激48小時(shí)，然后進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果表明，經(jīng)AdshIRF6腺病毒感染后的心肌細(xì)胞表面積較AdshRNA對(duì)照組顯著減小，而經(jīng)AdIRF6腺病毒感染的心肌細(xì)胞表面積則與對(duì)照組相比AdGFP明顯增大(圖12)。即IRF6的干擾腺病毒抑制心肌細(xì)胞肥大，IRF6過(guò)表達(dá)的腺病毒則促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。

由以上結(jié)果可知，在主動(dòng)脈弓縮窄引起的心肌肥厚疾病模型中，IRF6基因缺陷顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，改善心功能，IRF6基因過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能。因此IRF6基因具有促進(jìn)心肌肥厚及纖維化并使心功能惡化的作用，IRF6基因可促進(jìn)主動(dòng)脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢大學(xué)

<120> 干擾素調(diào)節(jié)因子6（IRF6）及其抑制劑在治療心肌肥厚中的應(yīng)用

<130> 1

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

ggtctggggc gacattgtac agcagg 26

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

ggcgtgttag taagccgaag tcacagg 27

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp1-F

<400> 3

agcttgacgt cataacttcg tatagcatac attatagcaa tttataccgg tgat 54

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp1-R

<400> 4

atcaccggta taaattgcta taatgtatgc tatacgaagt tatgacgtca 50

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp2-F

<400> 5

gatcccttaa gataacttcg tatagcatac attatagcaa tttatacgcg ta 52

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp2-R

<400> 6

ctagtacgcg tataaattgc tataatgtat gctatacgaa gttatcttaa gg 52

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF6 LA-F

<400> 7

ccgctcgagc ggtttagtgt gttcttgttt ga 32

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF6 LA-R

<400> 8

acgcgtcgac gaattccagg tggtggtgag 30

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF6 M-F

<400> 9

tctaccggtc ccagacttca gcttcagca 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF6 M-R

<400> 10

ggcgatatcc ctcctcagag caatggtgg 29

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF6 RA-F

<400> 11

ggactagttc aaagcagtag ggtgtgct 28

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF6 RA-R

<400> 12

ataagaatgc ggccgctgtg ggtccaaaga agcagg 36

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物

<400> 13

gctctagagc caccatggcc ctccaccccc 30

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物

<400> 14

gctctagatt actggggagg cagggc 26