本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及減毒鼠傷寒沙門氏菌的基因工程菌在制備治療肝癌藥物上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝癌是世界上常見的惡性腫瘤之一。中國(guó)是全球肝癌發(fā)病率最高的國(guó)家，在常見腫瘤中僅次于肺癌，居第2位。中國(guó)肝癌發(fā)病率占全球的45％，死亡率高居惡性腫瘤的第三位。肝細(xì)胞癌的治療包括手術(shù)治療、放療和藥物化療。由于肝癌對(duì)放射性治療敏感性差，而常規(guī)化療藥物(如阿霉素、氟尿嘧啶、順鉑)的治療不僅毒副作用嚴(yán)重，而且也不能明顯緩解疾病，因此目前肝癌的治療仍以手術(shù)切除為主。但是肝癌起病隱匿，早期缺乏典型癥狀，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，進(jìn)展快，惡性程度高，能進(jìn)行手術(shù)的患者不到30％，而且即使手術(shù)以后復(fù)發(fā)率也很高，使得肝癌患者的預(yù)后極差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，95％以上的肝癌患者治療失敗。目前，肝癌治療藥物遠(yuǎn)未滿足臨床需求，亟待開發(fā)新的有效的治療藥物。

沙門菌屬是一群在人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的革蘭氏陰性、侵襲性細(xì)胞內(nèi)兼性厭氧菌。VNP20009為msbB、pur I基因缺失的減毒鼠傷寒沙門菌株，遺傳穩(wěn)定，對(duì)抗生素敏感。msbB基因?yàn)橹|(zhì)酰化為內(nèi)毒素所必需，其缺失使類脂質(zhì)A末端不能?；?，降低了毒性；pur I基因參與嘌呤代謝，其缺失使細(xì)菌的繁殖需要外源性腺嘌呤。VNP20009還降低了自身誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)，從而降低炎性反應(yīng)。因此，它的低致病性提高了用于臨床治療的安全性。VNP20009已被廣泛用于癌癥研究，它可作用于多種小鼠實(shí)體瘤模型，包括黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌。VNP20009作為腫瘤基因治療載體的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是它能夠高度靶向聚集于腫瘤部位。研究人員在多種實(shí)體腫瘤的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，VNP20009在腫瘤內(nèi)的數(shù)量較肝臟等主要器官內(nèi)高200～l000倍。VNP20009能在腫瘤組織缺氧壞死區(qū)優(yōu)先聚集并繁殖，相同時(shí)間內(nèi)腫瘤組織內(nèi)細(xì)菌的擴(kuò)增代次顯著高于正常組織，使得減毒沙門菌成為新型抗瘤制劑和腫瘤靶向治療的載體成為可能。沙門菌導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)減慢可能機(jī)制包括：腫瘤生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為細(xì)菌所消耗，細(xì)菌所產(chǎn)生的酶，如天冬酰胺酶，可耗竭腫瘤生長(zhǎng)必需氨基酸；細(xì)菌向胞外微環(huán)境分泌的局部毒素或者產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α，都可影響腫瘤血管形成； 此外，在細(xì)菌生長(zhǎng)部位的非特異性炎癥反應(yīng)可潛在激活抗腫瘤T細(xì)胞。

腫瘤細(xì)胞為了維持其高增殖率，需要足夠的營(yíng)養(yǎng)。除糖之外，對(duì)甲硫氨酸(Methionine,Met)、谷胺酰氨、精氨酸等需要量尤其大。研究證實(shí)Met依賴性是絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的共同特征，如乳腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、腎癌、膀胱癌、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，而正常細(xì)胞不存在Met依賴性。一些體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)相繼證實(shí)，直接食用甲硫氨酸缺乏的膳食可以延緩腫瘤細(xì)胞的增殖。但是若膳食中Met長(zhǎng)期缺乏或不足，將會(huì)引起機(jī)體營(yíng)養(yǎng)不良、代謝障礙，還可因DNA長(zhǎng)期處于低甲基化狀態(tài)加劇癌變。那么，通過(guò)甲硫氨酸酶(L-methioninase)特異性地將Met分解，從而降低體內(nèi)甲硫氨酸水平，則能更加有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或使之消退。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明經(jīng)腹膜內(nèi)注射甲硫氨酸酶可以抑制裸鼠的吉田肉瘤和肺腫瘤的增長(zhǎng)。臨床試驗(yàn)選四個(gè)分別患有乳腺癌、肺癌、腎癌和淋巴瘤的患者每24h靜脈注射一次甲硫氨酸酶，發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸酶可以明顯減少血漿中甲硫氨酸含量。但是，由于哺乳動(dòng)物本身不表達(dá)甲硫氨酸酶，所以外源性給與的方式有一定的副作用，往往引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種基因工程菌在制備治療肝癌的生物藥物上的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提出一種基因工程菌在制備治療肝癌的藥物上的應(yīng)用，所述基因工程菌為攜帶質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，且其中所述質(zhì)粒上克隆有L-methioninase基因。

其中，所述的質(zhì)粒為pSVSPORT質(zhì)粒、pTrc99A質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、pBR322質(zhì)?；騪ET23a質(zhì)粒。

所述基因工程菌的構(gòu)建方法為：將L-methioninase基因亞克隆至質(zhì)粒中，得到L-methioninase表達(dá)質(zhì)粒，將L-methioninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，即得。所述的電轉(zhuǎn)化條件為電壓2400V，電阻400Ω，電容25μF，放電時(shí)間4ms。

最為優(yōu)選，在構(gòu)建基因工程菌的過(guò)程中，當(dāng)選用pSVSPORT質(zhì)粒時(shí)，將L-methioninase基因通過(guò)Kpn I和Hind III酶切位點(diǎn)亞克隆至質(zhì)粒中，得到L-methioninase 表達(dá)質(zhì)粒，然后將L-methioninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中得到基因工程菌。

上述減毒鼠傷寒沙門氏菌及其基因工程菌的給藥方式為靜脈或介入注射。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的用于治療肝癌的生物藥物，是一種安全無(wú)毒具備抗腫瘤活性的新型生物藥物，以減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009為載體，利用基因重組技術(shù)高表達(dá)甲硫氨酸酶，抗腫瘤活性強(qiáng)，能滿足使用需求。制備方法簡(jiǎn)單，容易操作；具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是質(zhì)粒pSVSPORT-L-methioninase酶切鑒定1％瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2是Western blot鑒定methioninase表達(dá)結(jié)果圖。

圖3是檢測(cè)沙門氏菌中methioninase活性結(jié)果圖。

圖4是給與沙門菌后腫瘤體積變化曲線圖。

圖5是給沙門菌4周后將小鼠麻醉，腫瘤的大小拍照結(jié)果圖，黑色框中為腫瘤。

圖6是給沙門菌4周后腫瘤的大小結(jié)果圖。

圖7是給沙門菌4周后腫瘤的重量結(jié)果圖。

圖8是給予L-methioninase腫瘤體積變化曲線圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1：基因工程菌的構(gòu)建。

(1)構(gòu)建表達(dá)L-methioninase基因的質(zhì)粒。

先合成L-methioninase(GenBank：L43133.1)基因亞克隆至pUC57質(zhì)粒(金斯瑞公司)，接著通過(guò)Kpn I和Hind III酶切位點(diǎn)亞克隆至pSVSPORT質(zhì)粒(invitrogen)，得到pSVSPORT-L-methioninase表達(dá)質(zhì)粒。具體構(gòu)建過(guò)程如下：

將pSVSPORT質(zhì)粒用Kpn I和Hind III雙酶切，酶切體系為：2μg質(zhì)粒DNA，3μL 10× buffer，1.5μL Kpn I酶，1.5μL Hind III酶，加入ddH₂O補(bǔ)足體積至30μL，37℃溫浴3h。然后將酶切體系在1％的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離，切出4.1kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。

通過(guò)全基因合成得到L-methioninase編碼區(qū)域DNA片段亞克隆至pUC57質(zhì)粒(金斯瑞公司)，用Kpn I和Hind III雙酶切，酶切體系為：3μg質(zhì)粒DNA，3μL 10×buffer，1.5μL Kpn I酶，1.5μL Hind III酶，加入ddH₂O補(bǔ)足體積至30μL，37℃溫浴3h。然后將酶切體系在1％的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離，切出1.2kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。

將pSVSPORT(Kpn I/Hind III)和L-methioninase編碼區(qū)域DNA片段(Kpn I/Hind III)連接，連接反應(yīng)中加入2μL載體、6μL插入片段、1μL T4DNA連接酶，16℃溫浴16h。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α(Takara)的感受態(tài)細(xì)胞中。取一管50μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待其融化后，向其中加入5μL上述連接產(chǎn)物，輕彈混勻，后于冰上孵育30min；42℃熱擊60s，后冰上靜置2min；加入500μL無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)1h；4000rpm離心5min，吸走，保留100μL左右的培養(yǎng)基，用移液器將細(xì)菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上。然后將平板置于37℃溫箱培養(yǎng)16h。

克隆生長(zhǎng)出來(lái)后，挑單克隆菌落至3mL含氨芐青霉素的LB-O培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)16h，提取質(zhì)粒DNA，用Kpn I和Hind III酶切鑒定，陽(yáng)性克隆中可得到4.1kb、1.2kb的兩條DNA條帶，如圖1所示。再通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆的序列完全正確。

(2)構(gòu)建攜帶質(zhì)粒的VNP20009菌和攜帶克隆有L-methioninase的基因的質(zhì)粒的VNP20009菌。

將pSVSPORT和pSVSPORT-L-methioninase表達(dá)質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至VNP20009菌株(YS1646，ATCC號(hào)202165)，分別命名為VNP20009-V和VNP20009-M。具體構(gòu)建過(guò)程如下：

將感受態(tài)細(xì)菌VNP20009置于冰上，待其融化后移入預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，向其中加入2μL質(zhì)粒，輕彈混勻，于冰上孵育1min。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀，條件設(shè)置為電壓2400V，電阻400Ω，電容25μF，放電時(shí)間4ms。電擊完立刻加入1mL SOC培養(yǎng)基，輕輕混勻。37℃震蕩培養(yǎng)1h；4000rpm離心5min，吸走，保留100μL左右的培養(yǎng)基，用移液器將 細(xì)菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨芐青霉素抗性的LB-O培養(yǎng)基平板上。然后將平板置于37℃溫箱培養(yǎng)16h。VNP20009-V和VNP20009-M用LB-O培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確。

取1×10⁸沙門菌用蛋白裂解液提取蛋白，進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳，再穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜，BSA室溫封閉1h后，TBST漂洗3×5min，加入兔抗L-methioninase抗體(1：2000)，4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗3次，每次5min再加HRP標(biāo)記的抗兔二抗(1：5000)，室溫孵育1h，TBST漂洗3次，每次5min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。結(jié)果如圖2所示，在分子量約43kD處有特異性條帶，說(shuō)明VNP20009-M與VNP20009、VNP20009-V相比，L-methioninase表達(dá)量顯著提高。

將L-甲硫氨酸和吡哆醛分別與VNP20009、VNP20009-V和VNP20009-M菌體混合，37℃孵育10min后用50％三氯乙酸終止，離心取上清，與3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(MBTH)充分混勻，50℃孵育30min后，測(cè)定320nm處的吸光值，以每分鐘催化轉(zhuǎn)化1μmolα-酮丁酸的酶量定義為1個(gè)酶活性單位。結(jié)果顯示(圖3)，沙門菌VNP20009-M的甲硫氨酸酶活性比VNP20009和VNP20009-V高10倍。

實(shí)施例2：VNP20009-L-methioninase菌株的抗腫瘤效果。

1、用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞HCCLM3，以細(xì)胞數(shù)2×10⁶個(gè)皮下接種于裸鼠右側(cè)腋下，并將荷瘤裸鼠隨機(jī)分組：PBS對(duì)照組、VNP20009-V組和VNP20009-M組。

2、用LB-O培養(yǎng)VNP20009-V和VNP20009-M，當(dāng)OD≈0.6時(shí)，收集菌體，然后用PBS重懸。在種瘤后第3天，以1×10⁴CFU/g(約為2×10⁵CFU/只)的劑量，采用尾靜脈注射方式給藥，對(duì)照組注射同等體積PBS。給藥后每隔2～3天，觀察小鼠狀態(tài)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小(體積＝0.52×長(zhǎng)×寬²)，繪制裸鼠腫瘤體積變化曲線(圖4)。給藥后第30天，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各選取3只小鼠，麻醉小鼠拍照(圖5)，并隨機(jī)選取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各2只，剝離裸鼠腫瘤，稱重，拍照(圖6、7)。結(jié)果如圖4、5所示，造模后，PBS以及空菌對(duì)照組小鼠的腫瘤都正常生長(zhǎng)并增長(zhǎng)迅速，而給予沙門菌VNP20009-M治療后，部分小鼠腫瘤減小甚至完全消失。VNP20009-M組的大部分小鼠的腫瘤生長(zhǎng)停滯，腫瘤體積和重量(圖6、7)約為VNP20009-V組的1/2，PBS對(duì)照組的1/5。結(jié)果說(shuō)明沙門菌VNP20009-M對(duì)于該肝癌腫瘤具有顯著的抑制效應(yīng)。

3、操作方法同上述1，將荷瘤裸鼠分為兩組，同樣采取靜脈注射的方式，分別給予PBS、L-methioninase 100ng/只，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小(體積＝0.52×長(zhǎng)×寬²)，繪制裸鼠腫瘤體積變化曲線結(jié)果，如圖8所示，兩組之間腫瘤無(wú)顯著性差異。L-methioninase 1ng/只的劑量等同于2×10⁶CFU的VNP20009-M所含L-methioninase。由此可見，單純給予100倍劑量的L-methioninase無(wú)明顯的抗腫瘤效應(yīng)。這說(shuō)明隨著L-methioninase的耗竭或降解，單次給藥沒(méi)有發(fā)揮作用，而以VNP20009為載體持續(xù)高表達(dá)L-methioninase則彌補(bǔ)了這個(gè)缺陷，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效應(yīng)。

本發(fā)明表明基因工程菌對(duì)肝癌細(xì)胞具有顯著的抑制效應(yīng)，帶有克隆有L-methioninase基因的質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌可以在腫瘤組織持續(xù)表達(dá)L-methioninase，大量消耗甲硫氨酸及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得腫瘤細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)，生長(zhǎng)緩慢，因此可以用于制備治療肝癌的藥物。上述質(zhì)粒并不局限于pSVSPORT質(zhì)粒，pTrc99A質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、pBR322質(zhì)粒或pET23a質(zhì)粒以及克隆有L-methioninase基因的上述質(zhì)粒同樣具有類似效果。