一種快速檢測(cè)雞傷寒沙門氏菌的pcr-hrm引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病原微生物的診斷及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種快速檢測(cè)雞傷寒沙 門氏菌的PCR-HRM引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙門氏菌（Salmonella)是一種最常見的人獸共患病原菌，有2500種以上血清型， 其宿主范圍廣，能廣泛存活于人類、溫血和冷血?jiǎng)游矬w內(nèi)以及食品和外界環(huán)境中，對(duì)人和許 多動(dòng)物有致病性，在我國(guó)細(xì)菌性食物中毒中70 %~80 %是由沙門菌引起，90 %為肉類等動(dòng) 物性食品。雞傷寒沙門氏菌（Salmonellagallinarum)是沙門氏菌的一種血清型，其能引 起的家禽敗血性傳染病，病雞可迅速死亡，主要侵害3月齡以上的家禽，主要發(fā)生于雞，也 可感染火雞與鴨。其癥狀與雞白痢相似。所以在獸醫(yī)臨床中鑒別診斷這兩種病極其重要。
[0003] 傳統(tǒng)的診斷方法是利用血清學(xué)診斷，但是其與雞白痢沙門氏菌具有很高的交叉凝 集反應(yīng)性。DevendraH(2005年）利用雞白痢沙門氏菌及禽傷寒沙門氏菌rfbS基因規(guī)律性 變化設(shè)計(jì)特異性的引物，建立等位基因特異性PCR方法，與傳統(tǒng)方法比檢測(cè)效率提高。徐耀 輝等（2005年）根據(jù)雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌fliC基因可變區(qū)兩端的保守序列 設(shè)計(jì)1對(duì)引物，PCR擴(kuò)增出約600bp的產(chǎn)物，用Hin6I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，經(jīng)RFLP分析區(qū) 分雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌的生物型。鑒定結(jié)果與生化特性符合，并且靈敏度高。 但是這些方法都檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，并且需要經(jīng)過酶切、電泳等程序來判定結(jié)果，在養(yǎng)殖長(zhǎng)沙門氏 菌凈化中效率過低。
[0004] 高分辨率恪解曲線（HRM，high-resolutionmelting)是根據(jù)核酸的特性，無(wú)需使 用序列特異性探針，利用一種飽和染料，對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行基因分析的一種技術(shù)?？梢圆?用非標(biāo)記的探針對(duì)已知位點(diǎn)的SNP或突變進(jìn)行基因分型研究。采用非標(biāo)記探針法對(duì)已知位 點(diǎn)的基因分型研究具有廉價(jià)、快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，因此被大量應(yīng)用在疾病、及病原菌檢測(cè)方 面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種快速檢測(cè)雞傷 寒沙門氏菌的PCR-HRM引物。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速檢測(cè)雞傷寒沙門氏菌的PCR-HRM方法。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述快速檢測(cè)雞傷寒沙門氏菌的PCR-HRM引物的應(yīng) 用。
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 一種快速檢測(cè)雞傷寒沙門氏菌的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下：
[0010] 上游引物Sg-up:5^ -TGTTAATAATTTCCCCAA-3'或其核苷酸的互補(bǔ)序列；
[0011] 下游引物Sg-lowW-AGTCTCTACATATTCACG-3'或其核苷酸的互補(bǔ)序列。
[0012] 所述的Sg-up和Sg-low是根據(jù)Genbenk上已發(fā)表的雞傷寒沙門氏菌rfbS基因序 列，在598位堿基兩側(cè)設(shè)計(jì)的引物。擴(kuò)增片段大小為79bp。
[0013] 一種快速檢測(cè)雞傷寒沙門氏菌的PCR-HRM方法，包括以下步驟：
[0014]A:提取細(xì)菌DNA;
[0015] B :以DNA為模板，利用上述所述的上游引物Sg-up、下游引物Sg-low和飽和焚光 染料進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0016]C:對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定是否為雞傷寒沙門氏菌。
[0017] 進(jìn)一步的，步驟B所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：
[0018]
[0019] 所述的飽和焚光染料優(yōu)選為Eva green染料。
[0020] 所述的引物rfbS-F和引物rfbS-R的濃度各優(yōu)選為lOnmol/μL;
[0021] 進(jìn)一步的，步驟Β所述的擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[0024] 進(jìn)一步的，步驟C所述的HRM分析的具體分析過程為：以雞傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性 模板擴(kuò)增后的熔解溫度Tm值為參考，待測(cè)樣品熔解溫度Tm值置信值（GCP)大于95%為雞 傷寒沙門氏菌。
[0025] 所述的快速檢測(cè)雞傷寒沙門氏菌的PCR-HRM引物可應(yīng)用于雞傷寒沙門氏菌的檢 測(cè)，養(yǎng)殖場(chǎng)雞傷寒沙門氏菌的凈化，分子流行病學(xué)調(diào)查以及家禽養(yǎng)殖中雞傷寒沙門氏菌的 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
[0026] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0027] (1)本發(fā)明針對(duì)雞傷寒沙門氏菌在rfbS基因上598位點(diǎn)上的規(guī)律性變化設(shè)計(jì) PCR-HRM引物，與飽和熒光染料結(jié)合能力強(qiáng)，熔解曲線分辨率高。高分辨熔解曲線檢測(cè)無(wú)需 特異性的探針，無(wú)需測(cè)序，使用簡(jiǎn)便，并且檢驗(yàn)過程中不消耗PCR產(chǎn)物，可以進(jìn)一步進(jìn)行下 游分析。
[0028] (2)本發(fā)明首次建立了一種快速檢測(cè)雞傷寒沙門氏菌的PCR-HRM引物并應(yīng)用，其 操作方便，檢測(cè)時(shí)只需要在PCR反應(yīng)中加入飽和熒光染料；簡(jiǎn)化了臨床檢驗(yàn)的流程并且大 大縮短了檢測(cè)時(shí)間，與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)鑒定方法相比時(shí)間節(jié)省了 2/3 ;并且該方法具有高通量、低 成本的特點(diǎn)，一次最多可以檢驗(yàn)384個(gè)樣本。與傳統(tǒng)PCR后電泳開放操作相比，本發(fā)明從 PCR過程到HRM分析實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作，整個(gè)過程PCR產(chǎn)物無(wú)需再轉(zhuǎn)入其他裝置，避免 了交叉污染，并且可以完成定量分析。
[0029] (3)本發(fā)明特異性強(qiáng)，能夠很好的從腸炎沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌以及其他細(xì) 菌中區(qū)分雞傷寒沙門氏菌，解決了傳統(tǒng)檢測(cè)方法鑒別雞傷寒沙門氏菌準(zhǔn)確率低的問題。本 發(fā)明靈敏度高，最低檢測(cè)下限能達(dá)到42個(gè)拷貝數(shù)每微升（μL)。在雞傷寒沙門氏菌的快速 診斷中展示了廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0030] 圖1是雞傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌與標(biāo)準(zhǔn)樣品HRM標(biāo)準(zhǔn)化 熔解曲線圖。
[0031] 圖2是雞傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌與其他細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣品 HRM峰型化熔解曲線圖。
[0032]圖3是雞傷寒沙門氏菌靈敏度檢測(cè)峰型化熔解曲線圖。
[0033]圖4是雞傷寒沙門氏菌臨床樣品檢測(cè)峰型化熔解曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0035] 實(shí)施例1用于檢測(cè)雞傷寒沙門氏菌HRM引物與反應(yīng)條件
[0036] (1)引物：根據(jù)NCBI已公布的沙門氏菌全基因組序列以及查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)雞 傷寒沙門氏菌在rfbS基因上598位有規(guī)律性的變化，所有雞傷寒都為Α，而雞白痢、腸炎 等血清型為G，別的一些血清型和別的種類的菌株不含有該基因或者變化較大，固可根據(jù) 此位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物。采用01ig〇7引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)GeneBank發(fā)布的沙門氏菌 rfbS序列（雞白痢沙門氏菌的rfbS序列的GeneBank登錄號(hào)：LK931482 ;雞傷寒沙門氏菌 的rfbS序列的GeneBank登錄號(hào)：AF442573 ;腸炎沙門氏菌rfbS序列的GeneBank登錄號(hào)： CP007267)以及雞傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株測(cè)序獲得的rfbS序列（該rfbS序列與GeneBank 登錄號(hào)：AF442573中的相同），在rfbS基因598位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物對(duì)。上游引物Sg-up: 5' -TGTTAATAATTTCCCCAA-3';下游引物Sg-low:5' -AGTCTCTACATATTCACG-3'。擴(kuò)增的 片段為79bp。
[0037] (2)反應(yīng)條件：根據(jù)引物確定反應(yīng)體系和反應(yīng)程序：
[0038]PCR-HRM反應(yīng)體系為 10μL:
[0039]
[0040]PCR-HRM反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[0041]
[0042] 實(shí)施例2用于檢測(cè)雞傷寒沙門氏菌的PCR-HRM引物的應(yīng)用方法
[0043](一）雞傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品的制備及PCR-HRM分析
[0044] (1)細(xì)菌DNA的提?。?br>[0045] 復(fù)蘇雞傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC