本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水通道蛋白在喉組織中的表達(dá)定位方法。

背景技術(shù)：

喉是呼吸道重要的組成部分，是人體的發(fā)聲器官，也是人類語言發(fā)展的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。喉部液體分泌的調(diào)節(jié)與水代謝平衡在維持喉行駛正常生理功能中有重要作用。

水通道蛋白（Aquaporin，AQP）是一族廣泛表達(dá)于動(dòng)物細(xì)胞膜上，選擇性高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異孔道，迄今為止動(dòng)物AQP家族已有13個(gè)成員（AQP0-AQP12）被克隆。水通道在機(jī)體表達(dá)豐富，和多種細(xì)胞的重要生理功能如遷移、分化、粘附、分泌等關(guān)系密切。在呼吸系統(tǒng)中目前已知有4種水通道表達(dá)：AQP1、3、4、5，其分布遍及鼻咽部、氣道及肺組織。水通道對(duì)于維持呼吸系統(tǒng)水平衡，保障其完成正常生理功能有至關(guān)重要的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種人喉組織中水通道的表達(dá)定位方法，該方法首次發(fā)現(xiàn)兩喉組織中水通道的種類及組織定位，對(duì)完善喉生理學(xué)及明確水通道蛋白在喉器官功能中的生理功能具有重要意義。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種人喉組織中水通道的表達(dá)定位方法，包括如下步驟：

一、應(yīng)用RT-PCR法從mRNA水平鑒定喉組織中有水通道蛋白AQP1和AQP3的表達(dá)，此方法可從翻譯前水平初步確定喉組織中有水通道蛋白表達(dá)；

二、對(duì)RT-PCR證實(shí)的在轉(zhuǎn)錄水平有表達(dá)水通道蛋白AQP1和AQP3，利用免疫印跡法，進(jìn)一步在蛋白水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)水通道蛋白AQP1和AQP3在喉組織中表達(dá)；

三、SP（Streptavidin Peroxidase）免疫組化染色法對(duì)喉組織中水通道蛋白AQP1、AQP3進(jìn)行組織定位，發(fā)現(xiàn)AQP1的表達(dá)部位在喉室粘膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮的纖毛、粘膜固有層的血管內(nèi)皮及喉部神經(jīng)纖維及神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)角質(zhì)細(xì)胞；AQP3的表達(dá)部位在人喉粘膜鱗狀上皮細(xì)胞基底邊膜和固有層腺體上。

本發(fā)明具有如下有益效果：

1）完善了水通道在呼吸系統(tǒng)分布的研究：首次發(fā)現(xiàn)喉組織中有水通道蛋白AQP1、AQP3表達(dá)，其中AQP1的表達(dá)部位在喉室粘膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮的纖毛、粘膜固有層的血管內(nèi)皮及喉部神經(jīng)纖維和神經(jīng)節(jié)；AQP3則在人喉粘膜鱗狀上皮細(xì)胞基底邊膜和固有層腺體上有表達(dá)。

2）AQP1與喉返神經(jīng)節(jié)的痛覺調(diào)控密切相關(guān)。

3）AQP1可以向纖毛表面分泌水分；而AQP3則有助于粘液的分泌。這些都利于保持喉室纖毛及周圍環(huán)境的濕潤，使喉室在發(fā)聲時(shí)能更好地引起共鳴，在人類發(fā)聲特別是歌唱時(shí)發(fā)揮了重要作用。

附圖說明

圖1為喉組織中水通道蛋白表達(dá)鑒定，A：應(yīng)用RT-PCR方法和DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)在mRNA水平發(fā)現(xiàn)喉組織中有水通道AQP1和AQP3表達(dá)，AQP11 和AQP12是非特異性條帶；B-應(yīng)用免疫印記法發(fā)現(xiàn)水通道AQP1和AQP3在喉組織中表達(dá)；L-喉組織，LN-癌旁組織，C- AQP1 and AQP3雙敲除小鼠的腎臟組織作為陰性對(duì)照。

圖2為喉神經(jīng)節(jié)中AQP1表達(dá)鑒定，A-C：神經(jīng)節(jié)連續(xù)組織切片，發(fā)現(xiàn)AQP1在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)部位與膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白S100一致；C和F一抗采用兔IgG做為陰性對(duì)照。

圖3為AQP1和AQP3在喉組織中的免疫染色分析，喉室組織連續(xù)切片，采用AQP1和AQP3抗體進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)AQP1在喉室粘膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮的纖毛、粘膜固有層的血管內(nèi)皮及喉部神經(jīng)纖維和神經(jīng)節(jié)中表達(dá)；AQP3在喉粘膜鱗狀上皮和固有層腺體上有表達(dá)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例提供了一種在mRNA水平鑒定喉組織中水通道的表達(dá)方法，具體步驟如下：

喉組織取自喉癌患者手術(shù)后的喉組織和癌旁組織（患者有知情權(quán)）。將新鮮組織按部位分成三份，一份用于提取RNA，一份用于提取總蛋白，一份用于免疫組化。

Superscript II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)。兔抗大鼠水通道多克隆抗體購自Santa Cruze，HRP標(biāo)記的羊抗大鼠二抗購自Sigma，SP試劑盒購自Thermo（95-9643，Histostain-SP IHC Kit, ）。

應(yīng)用Trizol法從喉組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第一股cDNA，用人AQP0-12引物（表1）進(jìn)行PCR分析，RT-PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗(yàn)，將目的片段回收后進(jìn)行DNA測(cè)序分析。

表1：水通道表達(dá)鑒定引物

所有引物的設(shè)計(jì)參照各自的mRNA序列，均跨過內(nèi)含子。

由圖1A可知，應(yīng)用RT-PCR方法和DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在mRNA水平發(fā)現(xiàn)喉組織中有水通道AQP1和AQP3表達(dá)，瓊脂糖電泳圖中在AQP11 和AQP12位置所出現(xiàn)條帶（～300bp和～200bp）與預(yù)期條帶（227bp和434bp）大小不符是非特異性條帶。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例提供了一種免疫印跡法從蛋白水平鑒定喉組織中水通道蛋白的表達(dá)方法，具體步驟如下：

對(duì)RT-PCR證實(shí)表達(dá)陽性的水通道蛋白AQP1、AQP3進(jìn)行免疫印跡分析：

提取喉組織總蛋白：將新鮮組織投入RIPA裂解液（150mM NaCl, 50mM Tri-HCl(pH7.4)，1 mM EDTA，0.1% SDS，1% deoxycholic acid，1% Triton X-100，1mM PMSF，5μg/ml Aprotinin，5μg/ml leupeptin）中，用組織剪切器打碎，13,000 rpm離心10 mins，重復(fù)兩次，取上清保存?zhèn)溆谩？偟鞍诐舛韧ㄟ^BCA protein reagent kit (23225, Pirce)進(jìn)行測(cè)定。取50mg，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜。將膜用5%脫脂牛奶封閉，一抗為兔抗鼠AQPs抗體，(AQP1,3,4,5)，室溫反應(yīng)1小時(shí)，用含有0.01%Tween20的TBS緩沖液，洗膜。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫下孵育，洗膜后Enhanced ECL 試劑盒于暗室中顯影。

由圖1B可知，應(yīng)用免疫印記法發(fā)現(xiàn)水通道AQP1和AQP3在喉組織中表達(dá)，結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例提供了一種SP(Streptavidin Peroxidase)免疫組化染色法對(duì)喉組織中水通道蛋白進(jìn)行組織定位的方法，具體步驟如下：

將喉組織投入4%的多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋、切片脫蠟后，10%雙氧水處理十分鐘進(jìn)行微波修復(fù)。10%山羊血清封閉1小時(shí)，分別加入一抗：AQP1/AQP3抗體作用1 小時(shí)，PBS洗片三次后，加入二抗室溫30分鐘（Goat anti-Rabit IgG/HRP，Sigma），充分洗滌后，經(jīng)DAB顯色，水洗后蘇木素復(fù)染，封片，觀察。

應(yīng)用免疫組化對(duì)水通道AQP1和AQP3在喉組織中表達(dá)進(jìn)行定位分析，發(fā)現(xiàn)：AQP1喉部神經(jīng)纖維和神經(jīng)節(jié)的膠質(zhì)細(xì)胞、喉室粘膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮的纖毛、粘膜固有層的血管內(nèi)皮中表達(dá)（圖2，圖3A）； 而AQP3在喉粘膜鱗狀上皮和固有層腺體上有表達(dá)（圖3B-D）。