本發(fā)明涉及診斷NK/T細(xì)胞淋巴瘤，尤其涉及一種檢測(cè)NK/T細(xì)胞淋巴瘤拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤，是鼻型的一種少見類型，約占非霍奇金淋巴瘤的2%～10%，其惡性細(xì)胞大部分來源于成熟的NK細(xì)胞，少部分來源于NK樣T細(xì)胞，因此稱之為NK/T細(xì)胞淋巴瘤。多數(shù)病例原發(fā)于鼻腔和咽喉部以上部位，少數(shù)病例原發(fā)于鼻外，如皮膚、胃腸道、肺等，極少數(shù)病例發(fā)病初期即表現(xiàn)為全身播散， 而無明顯鼻腔受累。其病理表現(xiàn)獨(dú)特，具有以血管為中心的多形性淋巴細(xì)胞浸潤， 瘤細(xì)胞浸潤破壞血管繼而引起壞死等特點(diǎn)，多數(shù)病例存在EB病毒感染證據(jù)。
結(jié)外 NK/T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病有地域或種族易感性，多發(fā)于亞洲以及南美洲，特別高發(fā)于中國、韓國、日本，西歐及北美少見。
現(xiàn)在，結(jié)外 NK/T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病率逐漸變高，臨床癥狀常表現(xiàn)為鼻塞、流涕、血涕或鼻衄、耳鳴、聲嘶、咽痛、吞咽不適及黏膜潰瘍等嚴(yán)重侵害了患者的健康。其他結(jié)外病變部位如皮膚,可表現(xiàn)為結(jié)節(jié)、潰瘍和黏膜紅斑等;胃腸道受累可引起腹痛、腸梗阻或穿孔等;肺部受累可有咳嗽、咯血等。由于結(jié)外 NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制與EBV感染密切相關(guān)，因此該腫瘤一個(gè)重要的臨床特點(diǎn)即容易發(fā)生噬血細(xì)胞綜合征，表現(xiàn)為發(fā)熱、肝脾腫大、血細(xì)胞減少、組織可見噬血細(xì)胞現(xiàn)象、肝功能異常、血乳酸脫氫酶升高、血清鐵蛋白升高等。
各部位發(fā)生的結(jié)外 NK/T細(xì)胞淋巴瘤病理組織學(xué)形態(tài)及免疫表型基本相似。組織學(xué)方面,瘤細(xì)胞呈彌漫性浸潤,常圍繞并侵入、破壞血管壁,伴組織大片壞死。瘤細(xì)胞大小不等，以小到中等的淋巴細(xì)胞混合為主,常常可出現(xiàn)數(shù)量不等的大細(xì)胞，背景中可有大量混合性炎性細(xì)胞。雖然大細(xì)胞數(shù)量不一,但并不代表腫瘤的惡性度不同。
結(jié)外 NK/T細(xì)胞淋巴瘤容易誤診,主要有以下原因:1)本病發(fā)病率低,早期臨床表現(xiàn)不典型,造成對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)不足;2)病理取材不當(dāng)。該疾病以壞死性病變?yōu)橹?，故病灶中心多為壞死組織，因此活檢部位應(yīng)在壞死灶與病變組織交界處取材，必要時(shí)反復(fù)多次并多點(diǎn)取材，組織塊要足夠大,并采用"咬切",避免擠壓導(dǎo)致細(xì)胞變形,以提高活檢的正確率;3)由于腫瘤細(xì)胞變異較大，可見大、中、小多樣細(xì)胞,甚至有的病變并發(fā)感染,這都導(dǎo)致病理診斷相當(dāng)困難,很容易與壞死組織伴炎性浸潤混淆。
結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤對(duì)放療敏感，對(duì)于早期鼻腔結(jié)外 NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者，給予單純放療效果較好，且較大劑量的放療遠(yuǎn)期生存率較高。但考慮到患者治療后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，提示采用合理的化療仍有必要，目前對(duì)于早期結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤提倡放化療聯(lián)合的治療方案。
結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤化學(xué)治療。所以前期的體外分子診斷對(duì)NK/T細(xì)胞淋巴瘤的治療有很好的指導(dǎo)意義。
但現(xiàn)有NK/T細(xì)胞淋巴瘤的檢測(cè)存在檢測(cè)準(zhǔn)確性低，檢測(cè)結(jié)果不清晰、重復(fù)性差，檢測(cè)成本高等問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)NK/T細(xì)胞淋巴瘤拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法，其準(zhǔn)確性高，信號(hào)清晰，重復(fù)性好，檢測(cè)成本低。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種檢測(cè)NK/T細(xì)胞淋巴瘤拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法，包括如下步驟：
（1）樣本的制備與預(yù)處理；
（2）樣本DNA和無重復(fù)序列探針共變性和雜交；
（3）雜交后洗滌、復(fù)染；
（4）觀察判讀結(jié)果。
所述樣本為確診為NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的石蠟包埋組織切片。
所述確診為NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的石蠟包埋組織切片的制備與預(yù)處理包括如下步驟：首先將患者新鮮組織取下1小時(shí)內(nèi)放入10%中性福爾馬林溶液中固定，固定時(shí)間為6—48小時(shí)；接著用切片機(jī)將石蠟切成3—5um，然后將3—5um的石蠟放入溫度為40℃的超純水中漂浮展開，接著將展開的石蠟切片附在帶正電荷的玻璃片上，然后將附著有石蠟切片的玻璃片風(fēng)干后再在56℃的溫度下烤片備用。
10%中性福爾馬林溶液是一種使用廣泛、簡便的固定劑，同時(shí)又是一種良好別的標(biāo)本保存液。經(jīng)它固定的標(biāo)本，可適應(yīng)一些特殊染色。它的滲透性較強(qiáng)，固定均勻，能增加組織的韌性，組織 縮輕微，硬性大于酒精。
所述無重復(fù)序列探針是通過Genome Browser 搜索特異序列，經(jīng)過合成，標(biāo)記、純化制得。
所述玻片上混合無重復(fù)序列探針混合液，蓋上蓋玻片，封膠；接著將無重復(fù)序列探針與樣本DNA通過ThermoBrite雜交儀變性、雜交。
所述ThermoBrite雜交儀內(nèi)變性的溫度為75℃，變性時(shí)間為5分針；所述ThermoBrite雜交儀內(nèi)雜交的溫度為37℃，雜交的時(shí)間為18小時(shí)。
所述雜交后洗滌包括如下步驟：首先去除樹膠，放入第一缸雜交后洗液中，室溫，浸泡1-5分針后除去蓋玻片；接著取出玻片，放入第二缸雜交后洗液中，溫度為72—74℃，漂洗2分鐘；然后取出玻片，吸取殘留液體，暗處自然干燥玻片，備用。
所述雜交后復(fù)染包括如下步驟：首先將玻片完全干燥，接著將15μl DAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，然后在暗處且-20℃避光儲(chǔ)存。暗處且-20℃避光儲(chǔ)存能防止熒光信號(hào)淬滅。
本發(fā)明的有益效果是：一種檢測(cè)NK/T細(xì)胞淋巴瘤拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法，其準(zhǔn)確性高，信號(hào)清晰，重復(fù)性好，檢測(cè)成本低。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種檢測(cè)NK/T細(xì)胞淋巴瘤拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法，包括如下步驟：
（1）樣本的制備與預(yù)處理；
（2）樣本DNA和無重復(fù)序列探針共變性和雜交；
（3）雜交后洗滌、復(fù)染；
（4）觀察判讀結(jié)果。
所述樣本為確診為NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的石蠟包埋組織切片。
所述確診為NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的石蠟包埋組織切片的制備與預(yù)處理包括如下步驟：首先將患者新鮮組織取下1小時(shí)內(nèi)放入10%中性福爾馬林溶液中固定，固定時(shí)間為6—48小時(shí)；接著用切片機(jī)將石蠟切成3—5um，然后將3—5um的石蠟放入溫度為40℃的超純水中漂浮展開，接著將展開的石蠟切片附在帶正電荷的玻璃片上，然后將附著有石蠟切片的玻璃片風(fēng)干后再在56℃的溫度下烤片備用。
所述無重復(fù)序列探針是通過Genome Browser 搜索特異序列，經(jīng)過合成，標(biāo)記、純化制得。
所述玻片上混合無重復(fù)序列探針混合液，蓋上蓋玻片，封膠；接著將無重復(fù)序列探針與樣本DNA通過ThermoBrite雜交儀變性、雜交。
所述ThermoBrite雜交儀內(nèi)變性的溫度為75℃，變性時(shí)間為5分針；所述ThermoBrite雜交儀內(nèi)雜交的溫度為37℃，雜交的時(shí)間為18小時(shí)。
所述雜交后洗滌包括如下步驟：首先去除樹膠，放入第一缸雜交后洗液中，室溫，浸泡1-5分針后除去蓋玻片；接著取出玻片，放入第二缸雜交后洗液中，溫度為72—74℃，漂洗2分鐘；然后取出玻片，吸取殘留液體，暗處自然干燥玻片，備用。
所述雜交后復(fù)染包括如下步驟：首先將玻片完全干燥，接著將15μl DAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，然后在暗處且-20℃避光儲(chǔ)存。
本實(shí)施例的一種檢測(cè)NK/T細(xì)胞淋巴瘤拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法，其準(zhǔn)確性高，信號(hào)清晰，重復(fù)性好，檢測(cè)成本低。