專利名稱：治療皮膚病的方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2004年2月6日提出的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.60/542,311的利益，其全部內(nèi)容因此通過參考結(jié)合在本文中。
背景銀屑病侵襲大約四百五十萬美國成年人。AMEVIVE_(alefacept)是一種經(jīng)核準(zhǔn)用于治療銀屑病的生物藥劑。
發(fā)明概述本發(fā)明提供治療各種疾病的方法，其包括T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，例如記憶T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，例如皮膚病，諸如銀屑病、遺傳過敏性皮炎、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、過敏性和刺激性接觸性皮炎、扁平癬(lichen planus)、簇狀禿頭癥、壞疽性膿皮病、白斑、眼睛疤痕類天皰瘡、UV損傷以及蕁麻疹。本文描述的方法涉及LFA-3/CD2相互作用的抑制劑的多周期施用，例如可溶的LFA-3多肽，例如可溶的LFA-3-免疫球蛋白(Ig)融合蛋白，諸如AMEVIVE_(alefacept)(下文為AMEVIVE)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用所述藥劑的多周期治療比單周期治療或雙周期治療提供更顯著的結(jié)果(如明顯更長久的減緩期)，而且令人驚奇地，不具有明顯的副作用附加風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本文描述的方法涉及銀屑病的治療。
因此，在一方面，本發(fā)明著重描述治療疾病的方法，例如皮膚病，如本文所描述的銀屑病或其它皮膚疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病由記憶效應(yīng)器T細(xì)胞介導(dǎo)。所述方法包括對(duì)受試者施行可溶的CD2結(jié)合LFA-3多肽的多治療療程(優(yōu)選至少3個(gè)治療周期)。
優(yōu)選地，所述可溶的CD2結(jié)合LFA-3多肽是一種LFA-3融合蛋白，例如，LFA-3/免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。示例性的LFA-3/Ig融合蛋白包括可溶的CD2結(jié)合LFA-3多肽，其融合到IgG的Fc區(qū)的全部或部分上，例如，融合到IgG重鏈鉸鏈區(qū)的全部或部分以及重鏈恒定區(qū)的全部或部分上。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Ig融合蛋白由成熟LFA-3的N端92個(gè)氨基酸、人IgG1鉸鏈區(qū)的C端10個(gè)氨基酸、人IgG1重鏈的CH2區(qū)、以及人IgG1重鏈的CH3區(qū)的全部或至少部分組成。一種這樣的融合蛋白是AMEVIVE。AMEVIVE由包含在質(zhì)粒pSAB152中的插入片段所編碼，其保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，保藏號(hào)為ATCC 68720。在下文中對(duì)AMEVIVE進(jìn)行更加詳細(xì)地描述。
多療程的治療包括至少3個(gè)治療周期，每個(gè)周期包括(a)一個(gè)給藥期，在該過程中治療藥劑施用至少2次，接著(b)一個(gè)休息期，在該過程中不施用治療藥劑，其中所述休息期基本上更長于周期中施用之間的時(shí)間間隔(IA，interval betweenadministrations)，并且優(yōu)選地至少和給藥期一樣長。在一些實(shí)施方案中，多療程包括至少4個(gè)周期，5個(gè)周期，6個(gè)周期，7個(gè)周期，8個(gè)周期，9個(gè)周期，10個(gè)周期，12個(gè)治療周期或更多。多療程的每個(gè)周期的給藥期可以由例如具體患者的保健護(hù)理者進(jìn)行預(yù)先選擇或確定。典型地，所述給藥期足夠地長，足以激發(fā)治療應(yīng)答，例如，激發(fā)如通過臨床測量所測得的選擇水平的減緩，所述臨床測量為例如PASI記分。在一些實(shí)施方案中，給藥期至少8周，至少10周，至少12周，至少14周，20周或更久，但是典型地在4-24周之間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個(gè)周期由12周的每周一次的多肽施用接著12周的休息組成，在所述休息期期間，患者被評(píng)估至少一次，以確定藥劑的作用，例如治療作用或副作用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多療程的每個(gè)連續(xù)周期的休息期長于多療程中在先周期的休息期。在一些實(shí)施方案中，多療程的最后周期的休息期可以是至少2年，至少18個(gè)月，至少3年、4年、5年或更久。
所述可溶的、CD2結(jié)合LFA-3多肽可以以每kg體重約0.001-約50mg結(jié)合藥劑范圍內(nèi)的劑量進(jìn)行施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽被全身性地施用，優(yōu)選地通過肌肉內(nèi)(IM)或靜脈內(nèi)(IV)途徑進(jìn)行。給藥期典型地包括多肽的定期施用，例如，一周一次，一周兩次，半周一次，或每月一次。典型地，當(dāng)通過IV途徑施用時(shí)，所述多肽以2-15mg范圍的單位劑量(例如，7.5mgIV大丸劑)以及當(dāng)通過IM途徑施用時(shí)，以2-30mg范圍的單位劑量(例如，10或15mgIM注射)進(jìn)行施用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括對(duì)受試者評(píng)估在多療程中每個(gè)周期的1個(gè)或2個(gè)給藥期以及休息期過程中對(duì)于可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽的作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在多療程治療過程中給受試者施用附加的治療或預(yù)防藥劑，例如，UV輻射(如UVB輻射)、環(huán)孢素A、潑你松、FK506、甲氨喋呤、類固醇類、類視色素類、干擾素，以及氮芥。附加藥劑可以在1個(gè)或多個(gè)周期過程中的給藥期過程中、休息期過程中、或兩者進(jìn)行施用。
所述受試者優(yōu)選為人。優(yōu)選的受試者包括那些具有諸如銀屑病的T細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚病癥狀的患者，所述癥狀例如，真皮細(xì)胞增殖、凸起的紅蝕斑形成(raised red plaque formation)、鱗屑病(scalyness)、瘙癢、裂化、刺痛、燒灼感、或出血斑，以及那些已被確診為銀屑病的患者。
在另一方面，本發(fā)明著重描述治療患有銀屑病的患者的方法。所述方法包括(a)選擇已經(jīng)具有使用可溶的CD2結(jié)合LFA-3多肽治療的至少2個(gè)周期的受試者，例如，基于已經(jīng)具有至少2個(gè)周期選擇受試者，以及(b)對(duì)受試者再施用另外周期，例如，第3個(gè)、第4個(gè)、第5個(gè)、第6個(gè)、第7個(gè)、第8個(gè)、第9個(gè)、第10個(gè)或更多周期的可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽的治療。
在另一方面，本發(fā)明著重描述使用本文所描述的可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽治療受試者，或者建議或推薦受試者進(jìn)行治療的方法。所述方法包括對(duì)受試者或其他個(gè)體教導(dǎo)或提供對(duì)受試者施用本文所描述的多療程治療的指導(dǎo)，所述其它個(gè)體例如保健護(hù)理者，例如醫(yī)生、護(hù)士、醫(yī)院的雇員、HMO或其它提供衛(wèi)生保健的組織。
本文所描述的方法可以用于治療由記憶效應(yīng)器T細(xì)胞介導(dǎo)的任何病況。本文所描述的方法可以用于治療諸如銀屑病和硬皮病的皮膚病，以及諸如炎癥性腸病、眼色素層炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病、和硬皮病的非皮膚病。
附圖簡介

圖1A和1B描述LFA-3/IgG融合蛋白的氨基酸和核苷酸序列。信號(hào)肽對(duì)應(yīng)圖1A的氨基酸1-28；成熟LFA-3區(qū)對(duì)應(yīng)圖1A的氨基酸29-120；以及IgG1區(qū)對(duì)應(yīng)圖1A的氨基酸121-347。
圖2是在使用AMEVIVE多療程治療的A-D周期治療后的2或12周獲得PASI 50的銀屑病患者的百分比的柱狀圖。
圖3是使用AMEVIVE對(duì)于銀屑病的多療程治療中的受益和重復(fù)應(yīng)答的圖表。
圖4是在接受使用AMEVIVE多療程治療的4名銀屑病患者中的最大應(yīng)答時(shí)間長度的柱狀圖。
圖5是對(duì)于具有使用AMEVIVE多療程治療的患者平均CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)的圖表。
圖6A是在使用AMEVIVE多療程靜脈內(nèi)(IV)治療期間的任何時(shí)間獲得PASI 75的患者的百分比的圖表。圖6B是在使用AMEVIVE多療程IV治療期間的任何時(shí)間獲得PASI 50的患者的百分比的圖表。
圖7A是在使用AMEVIVE多療程IV治療期間的任何時(shí)間獲得“清楚”或“幾乎清楚”應(yīng)答的PGA的患者的百分比的圖表。圖7B是在使用AMEVIVE多療程IM治療期間的任何時(shí)間獲得“清楚”或“幾乎清楚”應(yīng)答的PGA的患者的百分比的圖表。
詳述本文所描述的方法一般涉及使用可溶的CD2結(jié)合LFA-3多肽用于T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病(例如，銀屑病)的治療的多療程療法。已發(fā)現(xiàn)多療程療法比單周期療法或雙周期療法提供顯著更長的減緩期，而且令人驚奇地，沒有明顯的副作用附加風(fēng)險(xiǎn)。
多療程治療如本文所用，一個(gè)治療的“周期”包括(a)一個(gè)給藥期，在該過程中治療藥劑施用至少2次(施用之間的時(shí)間間隔稱為IA)，接著(b)一個(gè)休息期，在該過程中不施用治療藥劑。所述休息期基本上比最長的IA更長，例如，至少長4-5倍，并且優(yōu)選地至少與給藥期一樣長。在周期的給藥期過程中，藥劑可以每隔一段時(shí)間(優(yōu)選有規(guī)律的)施用至少2，4，6，8，10，12，14，16，18或20次。典型地，所述給藥期對(duì)于患者足夠地長，足于展現(xiàn)預(yù)選的疾病改善水平，例如，預(yù)選的PASI記分，例如PASI 50或PASI 75。所述休息期可以包括監(jiān)測患者對(duì)治療藥劑的反應(yīng)(例如，療效或副作用)。在一個(gè)優(yōu)選的周期中，所述藥劑在12周的給藥期過程中每周施用一次，接著為12周的休息期，在所述休息期過程中患者由保健護(hù)理者評(píng)估至少一次。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在給藥期過程中將存在少于50，40，30，20或15次的施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述周期的給藥期內(nèi)任意兩次臨近的施用之間的最大時(shí)間間隔(IA)少于30天，少于20天，少于15天或少于10天。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在施用之間的時(shí)間間隔約1周。所述周期的給藥期可以考慮劑量策略而改變。例如，如果給藥期以周或月度量，給藥期可以包括藥劑的每月一次的、每周一次的、雙周一次的、半周一次的或每日一次的施用，持續(xù)指定數(shù)目的周，如保健醫(yī)生為具體的病人確定的那樣。一個(gè)周期的優(yōu)選給藥期包括約6-24次施用，其具有3-15日的IA。更優(yōu)選地，一個(gè)周期的給藥期包括約10-14次施用，其具有5-9日的IA。
在一些情形中，休息期等于或長于這樣的期間，在該期間過程中所述藥劑對(duì)患者具有基本上減緩的作用，如由標(biāo)準(zhǔn)臨床量度所測量的那樣。例如，對(duì)于在治療周期過程中的銀屑病患者的休息期可以是這樣的期間，在該期間過程中特定的銀屑病區(qū)域和嚴(yán)重度指標(biāo)(PASI，Psoriasis Area andSeverity Index)記分(例如，PASI 50或PASI 75)或具體的醫(yī)生綜合評(píng)估(PGA)記分(例如，PGA“清楚”或“幾乎清楚”)得以維持，或更長于該期間。然而，至少等于減緩期的休息期典型地在1年-10年之間，例如，在2年-10年之間，例如，在2年-5年之間。在一些實(shí)施方案中，休息期是至少1年，優(yōu)選地至少18個(gè)月，2年，30個(gè)月，36個(gè)月，42個(gè)月，48個(gè)月或更長。
“多療程的治療”意指至少3個(gè)治療周期。處于多療程治療中的所述周期可以相同但它們不必相同，例如，它們可以在給藥期過程中的劑量策略上不同；或者在IA，給藥期、休息期的長度，或者兩者的持續(xù)時(shí)間上不同。例如，多療程的治療可以包括(a)第一個(gè)周期，其由12周的每周一次的AMEVIVE施用接著12周的休息組成，接著(b)第二個(gè)周期，其由12周的每周一次的AMEVIVE施用接著1年的休息期組成，在該休息期期間，所述藥劑對(duì)患者具有基本上減緩的作用，接著(c)第三個(gè)周期，其由10周的治療藥劑每半周一次的施用接著2年的休息組成，任選地接著(d)后續(xù)周期，例如，附加的第4個(gè)，第5個(gè)，第6個(gè)，第7個(gè)，第8個(gè)周期或更多周期。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述休息期和減緩效果隨著多療程治療過程中周期數(shù)目的增加而增加。在休息期或減緩作用持續(xù)時(shí)間中隨著每一個(gè)增加的治療周期的增加優(yōu)選地是至少10％，更優(yōu)選地至少15％或20％，更優(yōu)選地至少25％、30％、40％、50％或更多。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于多療程治療中第三個(gè)周期(和/或后續(xù)周期)的休息期和減緩效果為至少18個(gè)月，優(yōu)選地至少2年，更優(yōu)選地至少30個(gè)月、36個(gè)月、42個(gè)月、48個(gè)月或更多。
CD2LFA-3相互作用的抑制劑CD2LFA-3相互作用的任何抑制劑都在本發(fā)明的方法中有用。這種抑制劑包括可溶的LFA-3多肽、抗-LFA-3抗體同系物、抗-CD2抗體同系物、可溶的CD2多肽、小分子(例如，具有小于2500Da優(yōu)選地小于1500Da的分子量的化學(xué)試劑，化學(xué)制劑，例如小的有機(jī)分子，例如組合文庫(combinatorial library)的產(chǎn)品)、LFA-3和CD2的模擬藥劑以及其衍生物。
用在本文所描述的方法中的優(yōu)選抑制劑是可溶的、CD2結(jié)合LFA-3多肽。
可溶的CD2和LFA-3多肽抑制LFA-3和CD2相互作用的可溶的LFA-3多肽或可溶的CD2多肽在本發(fā)明的方法中有用。優(yōu)選可溶的LFA-3多肽，特別是可溶的LFA-3/Ig融合體。
如此處所用，“可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽”是一種包括至少LFA-3(SEQ ID NO2)的CD2-結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且不能將自己錨定在膜中的多肽。這種可溶的多肽包括，例如，缺少它們的跨膜結(jié)構(gòu)域的充分部分而不能錨定多肽或被修飾以致跨膜結(jié)構(gòu)域沒有功能的LFA-3多肽?？扇艿腃D2-結(jié)合LFA-3多肽包括可溶的融合蛋白，其包括至少融合到異源多肽上的LFA-3的CD2-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源多肽是免疫球蛋白的Fc區(qū)(例如，IgG1鉸鏈區(qū)和CH2-CH3結(jié)構(gòu)域)或其基本部分。
可溶的LFA-3多肽可以衍生于LFA-3的跨膜形式，特別是細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(例如，US 6,162,432的SEQ ID NO2的氨基酸1-187，其通過參考結(jié)合于此)。這種多肽在美國專利No.4,956,281和美國專利No.6,162,432中描述，其通過參考結(jié)合在本文中。優(yōu)選的可溶LFA-3多肽包括包含SEQID NO2的殘基1-92、SEQ ID NO2的殘基1-80、SEQ ID NO2的殘基50-65以及SEQ ID NO2的殘基20-80的多肽，其中所述SEQ ID NO2在美國專利No.6,162,432中顯示。將包含編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的DNA序列(SEQ ID NO1)的載體保藏在馬里蘭Rockville美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，Maryland)，保藏號(hào)為No.75107，其中所述SEQ ID NO1和2在US6,162,432中顯示。
可溶的LFA-3多肽還可以衍生于LFA-3的PI-連接形式，諸如在PCT專利申請(qǐng)順序號(hào)No.WO 90/02181中描述的那些。將包含編碼PI-連接的LFA-3的DNA序列(SEQ ID NO3)的載體保藏在馬里蘭Rockville美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為No.68788。應(yīng)該明白LFA-3的PI-連接形式和LFA-3的跨膜形式具有貫穿完整的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的相同的氨基酸序列。因此，優(yōu)選的PI-連接的LFA-3多肽與LFA-3的跨模形式相同。
對(duì)于用于本發(fā)明的最優(yōu)選的可溶的CD2結(jié)合LFA-3多肽為LFA-3/Ig融合蛋白。這種融合蛋白的一個(gè)實(shí)例是AMEVIVE_(alefacept)。
AMEVIVE_(alefacept)AMEVIVE是一種融合蛋白，其包括融合到人IgG1的Fc部分的人LFA-3(CD58)的第一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。特別地，AMEVIVE包括成熟LFA-3的N端92個(gè)氨基酸、人IgG1鉸鏈區(qū)的C端10個(gè)氨基酸(所述人IgG1鉸鏈區(qū)含有被認(rèn)為參與鏈間二硫鍵的2個(gè)半胱氨酸殘基)、以及人IgG1重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)的基本部分，(例如，SEQ ID NO3)。所述蛋白是糖基化的、二硫鍵連接的二聚體，在PAGE非還原條件下具有約112kD的分子量。AMEVIVE的恒定區(qū)具有C端可變性，其對(duì)應(yīng)全長融合多肽的剪接變體形式。
將編碼AMEVIVE的質(zhì)粒pSAB152保藏在馬里蘭Rockville美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為ATCC 68720。
pMDR(92)Ig-3是可以用于生產(chǎn)AMEVIVE的的表達(dá)載體的一個(gè)實(shí)例。pMDR(92)Ig-3包括下述元件(a)pBR322片段，其含有ColE1起點(diǎn)和β內(nèi)酰胺酶表達(dá)盒(GenBank登記號(hào)No.J01749)；(b)DHFR表達(dá)盒，其由下述元件組成刪除了增強(qiáng)子的SV40早期啟動(dòng)子(GenBank登記號(hào)No.J02400的一部分)，鼠DHFR cDNA(GenBank登記號(hào)No.L26316)，SV40多聚腺苷酸(SV40 poly A)位點(diǎn)和小t內(nèi)含子(GenBank登記號(hào)No.J02400的部分)，以及人促胃液素轉(zhuǎn)錄終止子序列，3′UTR(Sato等.(1986)Mol CellBiol 61032-1043)；(c)AMEVIVE表達(dá)盒，其包括，優(yōu)選地以下述順序SV40早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(GenBank登記號(hào)No.J02400)，包括剪接供體和內(nèi)含子序列的腺病毒主要末期啟動(dòng)子(Adenovirus Maior Late Promoter)和三聯(lián)前導(dǎo)序列(GenBank登記號(hào)No.J01917的一部分)，鼠Ig重鏈可變區(qū)內(nèi)含子序列和剪接受體(Kaufman和Sharp(1982)Mol Cell Biol.21304-1319)，(任選地)克隆接頭，從人扁桃體cDNA文庫分離的LFA-3基因的前92個(gè)氨基酸，其符合讀框地融合到編碼從人成纖維樣的基因組DNA文庫中分離的人IgG1基因的鉸鏈CH2和CH3區(qū)的核酸上，克隆接頭(任選地)，包含多聚腺苷酸位點(diǎn)的MIS 3′UT區(qū)(GenBank登記號(hào)No.K03474)，以及SV40多聚腺苷酸位點(diǎn)和小t內(nèi)含子(GenBank登記號(hào)No.J02400)；和pBR327的片段(GenBank登記號(hào)No.L08856)。
可以用于生產(chǎn)AMEVIVE的宿主細(xì)胞系可以衍生于CHO-DUkX-B1細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種細(xì)胞系的DHFR(-)突變體可以使用載體pMDR(92)Ig-3進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并且DHFR(+)轉(zhuǎn)化子可以在選擇培養(yǎng)基(例如，含有25nM的甲氨喋呤(MTX))中培養(yǎng)。陽性轉(zhuǎn)化子可以經(jīng)受增加濃度的MTX(例如，50nM)，然后可以選擇生產(chǎn)高水平的AMEVIVE的菌落。
AMEVIVE的生產(chǎn)可以按下述進(jìn)行將CHO宿主細(xì)胞解凍，按比例擴(kuò)大到2000L的培養(yǎng)物，在pH控制和營養(yǎng)給料下(在48hrs.，96hrs.，和120hrs.)在培養(yǎng)物中保持6-7天，此后將條件培養(yǎng)液通過微量過濾收獲下來。優(yōu)選地MTX存在于培養(yǎng)基中。AMEVIVE可以通過進(jìn)行下述步驟從條件培養(yǎng)液中回收(i)A蛋白層析，(ii)陶瓷羥基磷灰石(ceramichydroxyapatite)層析，(iii)在低pH病毒滅活，(iv)疏水相互作用層析，(v)接著進(jìn)行濃縮、滲濾、病毒過濾、和第二次濃縮步驟，其將產(chǎn)生融合產(chǎn)品。
在同時(shí)待審地、普通轉(zhuǎn)讓的美國專利申請(qǐng)順序號(hào)No.07/770,967中描述了生產(chǎn)用于本發(fā)明方法中的AMEVIVE的另一種方法。一般地，將用pSAB152轉(zhuǎn)染的COS7或CHO細(xì)胞的條件培養(yǎng)液使用AMICON S1Y30螺旋筒式系統(tǒng)(AMICON，Danvers，馬薩諸塞州)進(jìn)行濃縮并且經(jīng)受A蛋白-瓊脂糖凝膠4B(Sigma，St.Louis，密蘇里州)層析。將結(jié)合的蛋白洗脫下來并且經(jīng)受Superose-12(Pharmacia/LKB，Piscataway，新澤西州)凝膠過濾層析。
將含有AMEVIVE的Superose-12級(jí)分，其帶有最少量的污染蛋白，其在SDS-PAGE凝膠上和通過蛋白質(zhì)印跡分析所確定，(參見，例如，Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，第4350-54頁(1979)；AntibodiesA Laboratory Manual，第474-510頁(Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，合并并在YM30濃縮管(AMICON)中濃縮。使用兔抗-LFA-3多克隆抗血清，接著通過可檢測的標(biāo)記山羊抗-兔IgG在蛋白質(zhì)印跡上檢測AMEVIVE。純化的COS7或CHO細(xì)胞的AMEVIVE是通過二硫鍵連接的兩個(gè)單體LFA-3-Ig融合蛋白的二聚體。
LFA-3-Ig融合活性可以使用下述生物測定法進(jìn)行測試(1)CD32/64(FcγRI/RII)U937細(xì)胞橋測定法，和(2)CD16(FcγRIII)Jurkat細(xì)胞橋測定法。這兩種測定法測試AMEVIVE將展示細(xì)胞表面CD2的CHO細(xì)胞與表達(dá)Fc-γ受體的細(xì)胞橋接的能力。后述測定法，測定法(2)，包括在96-孔板中培養(yǎng)貼壁CHO-CD2細(xì)胞以形成單層；添加AMEVIVE對(duì)照和樣品；添加熒光標(biāo)記的Jurkat-CD16(+)；以及測量熒光強(qiáng)度。
將LFA-3-Ig融合體結(jié)合到固定到例如芯片的基底上的CD2，也可以用來測試融合蛋白。
CD2多肽可溶的CD2多肽可以衍生于全長CD2，特別是細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。這種多肽可以包含CD2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的全部或部分。在PCT WO 90/08187中描述了典型的可溶CD2多肽，其通過參考結(jié)合在本文中。
可溶的多肽的生產(chǎn)本發(fā)明有用的可溶的多肽的生產(chǎn)可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法實(shí)現(xiàn)。例如，所述多肽可以通過蛋白酶解、Edman降解法、或結(jié)合兩者衍生于完整的跨膜LFA-3或CD2分子或者完整的PI-結(jié)合的LFA-3分子，所述蛋白酶解使用特異的內(nèi)肽酶結(jié)合外肽酶。所述完整的LFA-3分子或完整的CD2分子又可以使用常規(guī)方法從其天然來源中純化出來。備選地，可以通過使用cDNAs的已知重組DNA技術(shù)生產(chǎn)完整的LFA-3或CD2分子(參見，例如，授予Wallner等的美國專利號(hào)No.4,956,281；Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.，84，第2941-45頁(1987)；Sayre等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，第2941-45頁(1987))。
優(yōu)選地，直接生產(chǎn)本發(fā)明有用的所述可溶的多肽，這樣消除對(duì)于作為起始原料的完整LFA-3分子或完整CD2分子的需要。這可以通過常規(guī)化學(xué)合成技術(shù)或通過公知的重組DNA技術(shù)而實(shí)現(xiàn)，其中所述重組DNA技術(shù)中只有那些編碼需要的肽的DNA序列在轉(zhuǎn)化的宿主中表達(dá)。例如，編碼需要的可溶LFA-3多肽或可溶CD2多肽的基因可以使用寡聚核苷酸合成器通過化學(xué)方法合成?；谛枰目扇躄FA-3多肽或可溶CD2多肽的氨基酸序列設(shè)計(jì)所述寡聚核苷酸。編碼需要的肽的特異DNA序列還可以衍生于全長DNA序列，其通過分離特異限制性核酸內(nèi)切酶片段或通過PCR合成特定的區(qū)域。
可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法來合成編碼本發(fā)明中有用的可溶LFA-3多肽或可溶CD2多肽的基因。例如，可以應(yīng)用完整的氨基酸序列構(gòu)建反翻譯基因(back-translated gene)。可以在單一步驟中合成DNA寡聚體，其含有編碼本發(fā)明有用的可溶LFA-3多肽或可溶CD2多肽的核苷酸序列。備選地，可以合成一些編碼需要的多肽的部分的更小的寡聚核苷酸，然后將其連接。優(yōu)選地，本發(fā)明有用的可溶LFA-3多肽或可溶CD2多肽將作為一些單獨(dú)的寡聚核苷酸合成，其中所述寡聚核苷酸隨后連接在一起。所述單獨(dú)的寡聚核苷酸典型地含有5′或3′突出端，用于互補(bǔ)裝配。
一旦裝配，優(yōu)選的基因?qū)⒁韵率鲂蛄袨樘卣?，由限制性核酸?nèi)切酶識(shí)別的序列(包括獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)，用于直接裝配到克隆或表達(dá)載體中)，考慮宿主表達(dá)系統(tǒng)使用的優(yōu)選密碼子，以及在轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生穩(wěn)定的有效翻譯的rnRNA的序列。正確的裝配可以通過核苷酸測序、限制酶切作圖、以及在適宜的宿主中表達(dá)生物活性的多肽進(jìn)行確定。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，由于遺傳密碼的簡并性，包含許多其它核苷酸序列的DNA分子也能夠編碼由上文所描述的特異的DNA序列編碼的可溶LFA-3多肽或可溶CD2多肽。這些簡并的序列還編碼本發(fā)明有用的多肽。
所述DNA序列可以在單細(xì)胞宿主，或優(yōu)選地在分離的哺乳宿主細(xì)胞中表達(dá)。正如本領(lǐng)域所公知的，為了在宿主中獲得轉(zhuǎn)染基因的高表達(dá)水平，必須將所述基因有效地連接到轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)控制序列上，其在選擇的表達(dá)宿主中有功能。優(yōu)選地，所述表達(dá)控制序列，以及目的基因，將被包含在表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體還包括細(xì)菌選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)。如果表達(dá)宿主為真核細(xì)胞，所述表達(dá)載體還可以包括用于表達(dá)宿主的附加的表達(dá)標(biāo)記。
編碼需要的可溶的多肽的DNA序列可以或可以不編碼信號(hào)序列。如果表達(dá)宿主是原核的，一般地優(yōu)選DNA序列不編碼信號(hào)序列。如果表達(dá)宿主是真核的，一般地優(yōu)選應(yīng)該編碼信號(hào)序列。
N端甲硫氨酸可以或可以不存在表達(dá)的產(chǎn)物上。如果末端甲硫氨酸沒有被表達(dá)宿主切除，如果需要的話，可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其化學(xué)去除。
可以應(yīng)用廣泛種類的表達(dá)宿主/載體組合。對(duì)于真核宿主有用的表達(dá)載體，包括，例如，包含來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒以及巨細(xì)胞病毒的表達(dá)控制序列的載體。對(duì)于細(xì)菌宿主可用的表達(dá)載體包括已知的細(xì)菌質(zhì)粒，諸如來自大腸桿菌(E.coli)的質(zhì)粒，其包括colE1、pCR1、pBR322、pMB9以及它們的衍生體，更廣的宿主范圍質(zhì)粒，諸如RP4、噬菌體DNAs，例如λ噬菌體的眾多衍生體，例如NM989，以及其它DNA噬菌體，諸如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。對(duì)于酵母菌細(xì)胞可用的載體包括2μ質(zhì)粒及其衍生物。對(duì)于昆蟲細(xì)胞可用的載體包括pVL 941。
另外，任一種廣泛種類的表達(dá)控制序列可以應(yīng)用在所述質(zhì)粒中。所述有用的表達(dá)控制序列包括與前述表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)基因相關(guān)的表達(dá)控制序列。有用的表達(dá)控制序列的實(shí)例包括，例如，SV40或腺病毒的早期或晚期啟動(dòng)子，乳糖系統(tǒng)(lac system)，色氨酸系統(tǒng)(trp system)，TAC或TRC系統(tǒng)，λ噬菌體的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)，fd外殼蛋白的控制區(qū)，用于3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子，酸性磷酸酶的啟動(dòng)子，例如Pho5，酵母菌α-交配系統(tǒng)和已知控制原核或真核細(xì)胞或它們的病毒的基因表達(dá)的其它序列的啟動(dòng)子，及其各種組合。
廣泛種類的宿主細(xì)胞是可用的。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞機(jī)體，或可以從多細(xì)胞機(jī)體獲得，例如，從多細(xì)胞宿主分離的細(xì)胞。這些宿主可以包括廣為人知的真核和原核宿主，諸如大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、真菌、酵母菌的菌株，諸如Spodoptera frugiperda(SF9)的昆蟲細(xì)胞，諸如CHO和鼠細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞，諸如COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40和BMT 10的非洲綠猴細(xì)胞，和人細(xì)胞，以及組織培養(yǎng)中的植物細(xì)胞。對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，優(yōu)選CHO細(xì)胞COS 7細(xì)胞。
應(yīng)該理解，不是所有的載體和表達(dá)控制序列將會(huì)同等好地起作用來表達(dá)本文所描述的DNA序列。不是所有的宿主將會(huì)同等好地與同一表達(dá)系統(tǒng)起作用。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在所述載體、表達(dá)控制序列和宿主中選擇，而無需過度實(shí)驗(yàn)。例如，在選擇載體時(shí)，由于載體必須在宿主中復(fù)制，必須考慮宿主。還應(yīng)該考慮載體的拷貝數(shù)、控制拷貝數(shù)的能力、以及由載體編碼的任何其它蛋白的表達(dá)，諸如抗生素標(biāo)記。
在選擇表達(dá)控制序列時(shí)，還應(yīng)該考慮各種因素。這些因素包括，例如，所述序列的相對(duì)濃度(relative strength)、其控制能力、以及其與此處所討論的DNA序列的兼容性、特別是關(guān)于潛在的二級(jí)結(jié)構(gòu)。單細(xì)胞宿主的選擇應(yīng)該考慮它們與所選載體的兼容性、由所述DNA序列編碼的產(chǎn)物的毒性、它們的分泌特征、它們正確折疊可溶多肽的能力、它們的發(fā)酵或培養(yǎng)的要求、以及純化由所述DNA序列編碼的產(chǎn)物的容易度。
在這些參量內(nèi)，本領(lǐng)域的一個(gè)技術(shù)人員可以選擇各種載體/表達(dá)控制序列/宿主組合，其將在發(fā)酵或大規(guī)模動(dòng)物培養(yǎng)中表達(dá)需要的DNA序列，例如使用CHO細(xì)胞或COS 7細(xì)胞。
可以將可溶的LFA-3和CD2多肽從發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離，并應(yīng)用各種常規(guī)方法的任一種進(jìn)行純化。本領(lǐng)域的一個(gè)技術(shù)人員可以選擇最適當(dāng)?shù)姆蛛x和純化技術(shù)。
盡管重組DNA技術(shù)是生產(chǎn)具有多于20個(gè)氨基酸的序列的有用的可溶CD2多肽或可溶LFA-3多肽的優(yōu)選方法，具有少于約20個(gè)氨基酸的更短的CD2或LFA-3多肽優(yōu)選地通過常規(guī)化學(xué)合成技術(shù)生產(chǎn)。用于本發(fā)明的合成生產(chǎn)的多肽可以有利地以非常高的產(chǎn)量生產(chǎn)并且易于純化。
優(yōu)選地，這樣的可溶CD2多肽或可溶LFA-3多肽通過液相或固相多肽合成而合成，并且任選地，用羧肽酶消化(以去除C-端氨基酸)或通過人工Edman降解法降解(以去除N-端氨基酸)。液相合成的應(yīng)用有利地允許直接插入某些衍生的氨基酸到正在生長的多肽鏈，諸如酪氨酸的O-硫酸酯。這避免需要后續(xù)的衍生步驟來修飾用于本發(fā)明的多肽的任何殘基。
多肽的正確折疊可以在氧化條件下獲得，所述氧化條件利于二硫鍵的形成，如Kent所描述的那樣，″Chemical Synthesis of Polypeptides andProteins″，Ann.Rev.Biochem.，57，第957-89頁(1988)。然后，可以通過本領(lǐng)域公知的分離技術(shù)純化這種方法生產(chǎn)的多肽。
抗-LFA-3和抗-CD2抗體同系物如此處所用，“抗體同系物”是一種包含一種或多種選自下述多肽的多肽的蛋白質(zhì)免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈以及其能夠結(jié)合到抗原上的抗原結(jié)合片段。包括多于1種多肽的抗體同系物的組成多肽可以任選地為二硫鍵結(jié)合或者共價(jià)交聯(lián)。因此，抗體同系物包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM類型(以及其亞型)的完整的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是κ或λ類型。抗體同系物還包括完整免疫球蛋白的部分，其保持抗原結(jié)合特異性，例如，F(xiàn)ab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、F(v)片段、重鏈單聚體或二聚體、輕鏈單聚體或二聚體、由一條重鏈和一條輕鏈組成的二聚體、等等。這一術(shù)語包括重組抗體、嵌合的、CDR-移植的以及人源化的抗體、或經(jīng)過修飾在人體中更少免疫原性的其它抗體。
如此處所用，“人源化重組或人源化抗體同系物”是通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的抗體同系物，其中抗原結(jié)合所需要的人免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的一些或全部氨基酸已經(jīng)取代來自非人哺乳動(dòng)物免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的對(duì)應(yīng)的氨基酸。
如此處所用，“嵌合的重組抗體同系物”是通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的抗體同系物，其中免疫球蛋白輕鏈、重鏈、或二者的鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)的全部或部分已經(jīng)取代來自另一免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的對(duì)應(yīng)的區(qū)域。
許多類型的抗-LFA-3或抗-CD2抗體同系物可用在本發(fā)明的方法中。這些抗體包括單克隆抗體、重組抗體、嵌合重組抗體、人源化重組抗體、以及前述抗體的抗原結(jié)合部分。
在抗-LFA-3抗體同系物中，優(yōu)選使用單克隆抗-LFA-3抗體。更優(yōu)選地使用由雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗-LFA-3抗體，所述雜交瘤選自具有保藏號(hào)Nos.ATCC HB 10693(1E6)、ATCC HB 10694(HC-1B11)、ATCC HB10695(7A6)、和ATCC HB 10696(8B8)的雜交瘤組，或者已知為TS2/9的單克隆抗體(Sanchez-Madrid等，″Three Distinct Antigens Associated withHuman T-Lymphocyte-Mediated CytolysisLFA-1，LFA-2 and LFA-3″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，第7489-93頁(1982))。最優(yōu)選地，所述單克隆抗-LFA-3抗體由選自具有保藏號(hào)Nos.ATCC HB 10695(7A6)和ATCC HB10693(1E6)的雜交瘤組的雜交瘤生產(chǎn)。
在抗-CD2抗體同系物中，優(yōu)選使用單克隆抗-CD2抗體，諸如已知為T111表位抗體的抗-CD2單克隆抗體，其包括TS2/18(Sanchez-Madrid等，″Three Distinct Antigens Associated with Human T-Lymphocyte-MediatedCytolysisLFA-1，LFA-2 and LFA-3″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，第7489-93頁(1982))。
用于生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)是公知的。通常參考，Harlow，E.和Lane，D.(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY；Kohler等，Nature，″Continuous Cultures ofFused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity″，256，第495-97頁(1975)。對(duì)于本發(fā)明的目的可用的免疫原包括攜帶CD2或LFA-3的細(xì)胞(CD2-或LFA-3-bearing cells)，以及含有LFA-3、CD2或其反受體-結(jié)合片段(例如，結(jié)合到LFA-3上的CD2片段或結(jié)合到CD2上的LFA-3片段)的無細(xì)胞制劑(cell free preparations)。
免疫接種可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法完成。單位劑量和免疫方案(immunizationregimen)取決于免疫的哺乳動(dòng)物的種屬、其免疫狀況、哺乳動(dòng)物的體重、等等。典型地，從所述免疫的哺乳動(dòng)物上采血，并且使用適當(dāng)?shù)暮Y選測定法測定來自每一份血液樣品的血清的特異抗體。例如，有用的抗-LFA-3抗體或抗-CD2抗體可以通過測試免疫血清阻滯Jurkat細(xì)胞的綿羊紅血細(xì)胞玫瑰花結(jié)化(rosetting)的能力來鑒別，所述能力由LFA-3和CD2存在于這些細(xì)胞各自的表面而導(dǎo)致。在雜交瘤的生產(chǎn)中應(yīng)用的淋巴細(xì)胞典型地從免疫的哺乳動(dòng)物分離，所述免疫動(dòng)物的血清已經(jīng)使用所述篩選測定法測試為陽性存在需要的抗體。
用于本發(fā)明的抗-CD2和抗-LFA-3抗體同系物還可以是重組抗體，其由用編碼需要的抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞所生產(chǎn)。重組抗體可以通過公知的基因工程技術(shù)生產(chǎn)。參見，例如，美國專利No.4,816,397，其通過參考結(jié)合在本文中。例如，重組抗體可以通過從雜交瘤細(xì)胞克隆編碼需要的抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的cDNA和基因組DNA而生產(chǎn)，其中所述雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)用于本發(fā)明的抗體同系物。然后，將編碼所述多肽的cDNA和基因組DNA插入表達(dá)載體中，以致將2個(gè)基因可操作地結(jié)合到它們各自的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)控制序列上。選擇所述表達(dá)載體和表達(dá)控制序列以與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞兼容。典型地，將2個(gè)基因插入同一個(gè)表達(dá)載體。
可以使用原核或真核宿主細(xì)胞。優(yōu)選在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)，原因在于所述細(xì)胞比原核細(xì)胞更可能組裝并分泌正確折疊的并且免疫活性的抗體?？赡艿兀鏊拗骷?xì)胞將生產(chǎn)完整的抗體的部分，諸如輕鏈二聚體或重鏈二聚體，其也是按照本發(fā)明的抗體同系物。
應(yīng)該理解上述方法的變化可用于本發(fā)明。例如，可以需要用編碼抗體同系物的輕鏈或重鏈(但不是二者)的DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。還可以應(yīng)用重組DNA技術(shù)去除編碼輕鏈和重鏈兩者之一或兩者的DNA的一些或全部，所述去除的部分對(duì)于CD2或LFA-3反受體結(jié)合不是必需的。從這些截短的DNA分子表達(dá)的分子用于本發(fā)明的方法中。另外，雙功能抗體可以這樣的形式生產(chǎn)，其中1條重鏈和1條輕鏈為抗-CD2或抗-LFA-3抗體同系物，另一條重鏈和輕鏈對(duì)除CD2或LFA-3外的抗原或者CD2或LFA-3的另外的表位特異。
嵌合重組抗-LFA-3或抗-CD2抗體同系物可以通過用包含編碼需要的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA的適宜的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而生產(chǎn)，其中編碼重鏈和/或輕鏈的鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)的DNA的全部或一些已經(jīng)用來自不同物種的免疫球蛋白輕鏈或重鏈的對(duì)應(yīng)區(qū)域的DNA取代。當(dāng)原始的重組抗體是非人源的，并且所述抑制劑要施用給人時(shí)，優(yōu)選對(duì)應(yīng)的人的序列的取代。一個(gè)示例性的嵌合重組抗體具有小鼠可變區(qū)以及人的鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)。一般地參見，美國專利No.4,816,397；Morrison等，″ChimericHuman Antibody MoleculesMouse Antigen-Binding Domains With HumanConstant Region Domains″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，第6851-55頁(1984)；Robinson等，國際專利公布PCT/US86/02269；Akira，等，歐洲專利申請(qǐng)184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請(qǐng)171,496；Neuberger等，國際申請(qǐng)WO 86/01533；Better等，(1988，Science 2401041-1043)；Liu等，(1987)PNAS 843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等，(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood等，(1985)Nature 314446-449；以及Shaw等，1988，J.Natl.Cancer.Inst.801553-1559。
人源化重組抗-LFA-3或抗-CD2抗體可以通過用來自人Fv可變區(qū)的同等序列替代不直接參與抗原結(jié)合的Fv可變區(qū)的序列而產(chǎn)生。產(chǎn)生人源化抗體的常規(guī)方法由Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207，Oi等，1986，BioTechniques 4214，和Queen等，US 5,585,089，US 5,693,761和US5,693,762提供，全部這些的內(nèi)容通過參考結(jié)合于此。所述方法包括分離、操作、和表達(dá)編碼來自至少1條重鏈或輕鏈的免疫球蛋白Fv可變區(qū)的全部或部分的核酸序列。所述核酸的來源對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的，并且，例如，可以從生產(chǎn)抗-LFA-3或抗-CD2抗體的雜交瘤獲得。然后可以將編碼人源化抗體、或其片段的核酸克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。
可以通過CDR-移植或CDR取代生產(chǎn)人源化或CDR-移植的抗體分子或免疫球蛋白，其中可以替代免疫球蛋白鏈的1個(gè)、2個(gè)、或全部CDR’s。參見例如，美國專利5,225,539；Jones等，1986 Nature 321552-525；Verhoeyan等，1988 Science 2391534；Beidler等，1988 J.Immunol.1414053-4060；Winter US 5,225,539，所有這些的內(nèi)容通過參考清楚地結(jié)合于此。Winter描述一種可以用于制備本發(fā)明的人源化抗體的CDR-移植方法(英國專利申請(qǐng)GB 2188638A，1987年3月26日遞交；Winter US5,225,539)，其內(nèi)容通過參考而清楚地結(jié)合。具體的人抗體的全部CDR’s可以用至少一部分非人CDR替代，或者只有一些CDR’s可以用非人CDR’s替代。只是有必要替代對(duì)于結(jié)合人源化抗體與預(yù)定抗原，例如LFA-3或CD2，所需要的CDR’s數(shù)量。
人源化的抗體也在本發(fā)明范圍內(nèi)，其包括免疫球蛋白，其中特異的氨基酸已被取代、刪除或插入。特別地，優(yōu)選的人源化抗體具有在構(gòu)架區(qū)內(nèi)的氨基酸取代，這樣以改進(jìn)對(duì)抗原的結(jié)合。例如，人源化免疫球蛋白鏈的選擇的、少量的受體構(gòu)架殘基可以用對(duì)應(yīng)的供體氨基酸替代。取代的優(yōu)選位置包括鄰近CDR或能夠與CDR相互作用(參見例如，US 5,585,089)的氨基酸殘基。US 5,585,089中描述了從供體選擇氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)，例如，US 5,585,089的12-16欄，其內(nèi)容通過參考結(jié)合于此。在1992年12月23日公布的Padlan等EP 519596 A1中描述了用于人源化免疫球蛋白鏈包括抗體的其它技術(shù)。
可以使用攜帶完整的人免疫系統(tǒng)而非鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生針對(duì)人LFA-3或CD2的人單克隆抗體(mAbs)。將來自用目的抗原免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞用于生產(chǎn)雜交瘤，其分泌具有對(duì)來自人的蛋白的表位的特異性親和力的人mAbs(參見，例如，Wood等.國際申請(qǐng)WO 91/00906；Kucherlapati等.PCT公布WO 91/10741；Lonberg等.國際申請(qǐng)WO92/03918；Kay等.國際申請(qǐng)92/03917；Lonberg，N.等.1994 Nature 368856-859；Green，L.L.等.1994 Nature Genet.713-21；Morrison，S.L.等.1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855；Bruggeman等.1993 YearImmunol 733-40；Tuaillon等.1993 PNAS 903720-3724；Bruggeman等.1991 Eur J Immunol 211323-1326)。
還可以通過重組DNA技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它方法產(chǎn)生單克隆抗體。已開發(fā)一種稱為“組合抗體文庫展示(combinatorial antibodydisplay)”方法的備選方法來識(shí)別并分離具有特殊抗原特異性的抗體片段，并且可以應(yīng)用所述方法生產(chǎn)單克隆抗體(對(duì)于組合抗體文庫展示的描述參見，例如，Sastry等.1989 PNAS 865728；Huse等.1989 Science 2461275；和Orlandi等.1989 PNAS 863833)。按上文所述用免疫原免疫動(dòng)物后，克隆由此導(dǎo)致的B細(xì)胞庫的抗體所有組成成分。對(duì)于通過使用低聚體引物混合物和PCR獲得不同人群的免疫球蛋白分子的可變區(qū)DNA序列，其方法是普遍已知的(Larrick等，1991，Biotechniques 11152-156；Larrick等，1991，MethodsCompanion to Methods in Enzymology 2106-110)。
特別適合用于產(chǎn)生多樣化的抗體展示文庫的方法和試劑的實(shí)例，例如，可以在下述文獻(xiàn)中找到Ladner等.美國專利No.5,223,409；Kang等.國際公布No.WO 92/18619；Dower等.國際公布No.WO 91/17271；Winter等.國際公布WO 92/20791；Markland等.國際公布No.WO92/15679；Breitling等.國際公布WO 93/01288；McCafferty等.國際公布No.WO 92/01047；Garrard等.國際公布No.WO 92/09690；Ladner等.國際公布No.WO 90/02809；Fuchs等.(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等.(1992)Hum Antibod Hybridomas 381-85；Huse等.(1989)Science2461275-1281；Griffths等.(1993)EMBO J 12725-734；Hawkins等.(1992)J Mol Biol 226889-896；Clackson等.(1991)Nature 352624-628；Gram等.(1992)PNAS 893576-3580；Garrad等.(1991)Bio/Technology 91373-1377；Hoogenboom等.(1991)Nuc Acid Res 194133-4137；和Barbas等.(1991)PNAS 887978-7982。用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫的試劑盒可商購(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)27-9400-01；和StratageneSurfZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)240612)。
在某些實(shí)施方案中，重鏈和輕鏈的V區(qū)結(jié)構(gòu)域可以在同一多肽上表達(dá)，通過柔性接頭結(jié)合，以形成單鏈Fv片段，并且隨后將scFV基因克隆到需要的表達(dá)載體或噬菌體基因組中。一般地，如在McCafferty等，Nature(1990)348552-554中描述的，通過柔性(Gly4-Ser)3接頭連接的抗體的完整的VH和VL結(jié)構(gòu)域可以用來生產(chǎn)單鏈抗體，其基于抗原的親和力可以賦予展示噬菌體可分離的包裝。隨后可以將分離的與抗原免疫反應(yīng)的scFV抗體配制到在主題方法中應(yīng)用的藥用制劑中。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如，包括文庫篩選的方法(Ladner，R.C.，等，U.S.專利5,233,409；Ladner，R.C.，等，U.S.專利5,403,484)，可以制備具有對(duì)表面蛋白有高親和力的特異抗體。并且，這些文庫的方法可以用在篩選中，以獲得結(jié)合決定簇，其為抗體的結(jié)構(gòu)決定簇的模擬。例如，參見Baiorath，J.和S.Sheriff，1996，ProteinsStruct.，F(xiàn)unct.，and Genet.24(2)，152-157；Webster，D.M.和A.R.Rees，1995，″Molecular modeling ofantibody-combining sites，″S.Paul，Ed.，Methods in Molecular Biol.51，Antibody Engineering Protocols，Humana Press，Totowa，NJ，第17-49頁；和Johnson，G，Wu，T.T.和E.A.Kabat，1995，″SeqhuntA program to screenaligned nucleotide and amino acid sequences，″Methods in Molecular Biol.51，op.cit.，第1-15頁。
本發(fā)明還可以用不是完整抗體的抗-CD2抗體和抗-LFA-3抗體同系物。所述同系物可以衍生于上文描述的抗體同系物的任一種。例如，衍生于上文描述的抗體的抗原結(jié)合片段，以及全長單體、二聚體或三聚體多肽本身是有用的。這種類型的有用的抗體同系物包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab′)2片段，在鉸鏈區(qū)包括通過二硫鍵連接的2個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341544-546)，其由一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。而且，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，VL和VH，是由分開的基因編碼的，但是應(yīng)用重組方法，通過合成的接頭可以使它們連接，所述接頭能使它們制備成單蛋白鏈，其中VL和VH區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子(已知為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等(1988)Science242423-426；和Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。所述單鏈抗體也意欲包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”之內(nèi)。應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，并且篩選這些片段在如完整的抗體應(yīng)用的相同方式中的用途?？?LFA-3重鏈?zhǔn)莾?yōu)選的抗-LFA-3抗體片段。
還可以通過化學(xué)方法生產(chǎn)抗體片段，例如，通過用諸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的蛋白酶裂解完整的抗體，并且任選地用還原劑處理裂解的產(chǎn)物。備選地，通過應(yīng)用截短的重鏈和/或輕鏈基因轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生產(chǎn)有用的片段。重鏈和輕鏈單體的生產(chǎn)可以通過用諸如二硫蘇糖醇的還原劑處理完整的抗體，接著進(jìn)行純化以分離這些鏈而實(shí)現(xiàn)。重鏈和輕鏈單體的生產(chǎn)還可以通過用編碼任一條需要的重鏈或輕鏈但不是兩者的DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。參見，例如，Ward等，″Binding Activities of a Repertoireof Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli″，Nature，341，第544-46頁(1989)；Sastry等，″Cloning of a the ImmunologicalRespertoire inEscherichia colifor Generation of Monoclonal CatalyticAntibodiesConstruction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNALibrary″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，第5728-32頁(1989)。
LFA-3和CD-2擬態(tài)或小分子試劑還可用于本發(fā)明的方法中的是LFA-3和CD-2擬態(tài)試劑。這些試劑是CD2LFA-3相互作用的抑制劑，其中所述試劑可以是肽、半肽化合物或非肽化合物(例如，小的有機(jī)分子)。優(yōu)選的CD2和LFA-3擬態(tài)試劑將抑制CD2LFA-3相互作用，其抑制作用至少如抗-LFA-3單克隆抗體7A6或抗CD2單克隆抗體TS2/18一樣好(前文所述)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，測試試劑是組合文庫的一個(gè)成員，例如，肽或有機(jī)組合文庫，或天然產(chǎn)品文庫。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多個(gè)測試化合物，例如文庫成員，包括至少10，102，103，104，105，106，107，或108的化合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多個(gè)測試化合物，例如文庫成員，共有結(jié)構(gòu)或功能特征。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供LFA-3和/或CD2抑制劑的文庫。組合文庫的合成在本領(lǐng)域內(nèi)公知并且已被綜述(參見，例如，E.M.Gordon等，J.Med.Chem.(1994)371385-1401；DeWitt，S.H.；Czarnik，A.W.Acc.Chem.Res.(1996)29114；Armstrong，R.W；Combs，A.P；Tempest，P.A.；Brown，S.D.；Keating，T.A.Acc.Chem.Res.(1996)29123；Ellman，J.A.Acc.Chem.Res.(1996)29132；Gordon，E.M.；Gallop，M.A.；Patel，D.V.Acc.Chem.Res.(1996)29144；Lowe，G.Chem.Soc.Rev.(1995)309，Blondelle等.Trends Anal.Chem.(1995)1483；Chen等.J.Am.Chem.Soc.(1994)1162661；U.S.專利5,359,115，5,362,899，和5,288,514；PCT公布Nos.WO92/10092，WO93/09668，WO91/07087，WO93/20242，WO94/08051)。
本發(fā)明的化合物的文庫可以按照各種方法制備，其中的一些是本領(lǐng)域已知的。例如，“裂解池(split-pool)”策略可以按下述方法實(shí)施將官能化多聚體支持物的珠粒(beads)放入多個(gè)反應(yīng)容器中；已知適用于固相肽合成的多種多聚體支持物，并且一些可商購(參見，例如，M.Bodansky″Principles of Peptides Synthesis″，第二版，Springer-Verlag，柏林(1993))。將不同的活化氨基酸溶液添加到珠粒的每一份等分試樣中，并且允許反應(yīng)進(jìn)行，以產(chǎn)生多種固定的氨基酸，每個(gè)反應(yīng)容器中一種。然后洗滌衍生出的珠粒的等分試樣，“混合(pooled)”(即，重新結(jié)合)，并且將珠粒庫再劃分，將每一份等分試樣放入分離的反應(yīng)容器中。然后將另一種活化的氨基酸添加到珠粒的每一份等分試樣中。重復(fù)合成的循環(huán)，直到獲得需要的肽長度?？梢噪S機(jī)選擇在每一個(gè)合成循環(huán)中所添加的氨基酸殘基；備選地，可以選擇氨基酸以提供“偏好(biased)”文庫，例如，這樣的文庫其中抑制劑的某些部分是非隨機(jī)選擇的，例如，以提供與能夠與抗體相互作用的已知肽具有已知的結(jié)構(gòu)相似性或同源性的抑制劑，例如，抗-特應(yīng)抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)該理解按這種方法可以容易地產(chǎn)生廣泛種類的肽的、擬肽的、或非肽的化合物。
“裂解池”策略導(dǎo)致形成肽文庫，例如，抑制劑，其可以用于制備本發(fā)明的測試化合物的文庫。在另一個(gè)示例性合成中，通過Hobbs DeWitt等的方法制成了“多樣性文庫(diversomer library)”(Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.906909(1993))。其它的合成方法，包括Houghten“茶標(biāo)記(tea-tag)”技術(shù)(參見，例如，Houghten等.Nature35484-86(1991))，也可以用于合成按照本發(fā)明目的的化合物的文庫。
可以篩選化合物文庫以確定是否所述文庫的任一成員都具有需要的活性，并且，如果這樣，要鑒定活性種類。已經(jīng)描述了篩選組合文庫的方法(參見，例如，Gordon等.J Med.Chem.，如前所述)?？梢酝ㄟ^使用適當(dāng)受體的親和層析篩選可溶的化合物文庫，以分離受體的配體，接著通過常規(guī)技術(shù)鑒定分離出來的配體(例如，質(zhì)譜、NMR等)?？梢酝ㄟ^將所述化合物與可溶的受體接觸來篩選固定的化合物；優(yōu)選地，將可溶的受體與可以檢測的標(biāo)記(例如，熒光團(tuán)，比色分析酶，放射性同位素、發(fā)光化合物等)偶聯(lián)，以指示配體結(jié)合。備選地，可以選擇性地釋放固定的化合物并允許其擴(kuò)散通過膜以與受體相互作用。下文描述用于本發(fā)明的文庫篩選的示例性測定法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以篩選本發(fā)明的化合物與CD2或LFA-3多肽相互作用的能力，其通過測定每一種化合物直接結(jié)合所述多肽或抑制CD2LFA-3相互作用的活性，例如，通過將測試化合物與CD2或LFA-3多肽和溶解產(chǎn)物，例如T或APC細(xì)胞溶解產(chǎn)物，例如在諸如標(biāo)準(zhǔn)96-孔微量培養(yǎng)板的多孔培養(yǎng)板的一孔中進(jìn)行溫育。在這一實(shí)施方案中，可以確定每種單獨(dú)的化合物的活性。沒有測試化合物的一孔或多孔可以用作對(duì)照。溫育后，通過測定每一個(gè)孔可以確定每種測試化合物的活性。因此，可以平行確定多種測試化合物的活性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以同時(shí)測定許多測試化合物的結(jié)合活性。例如，在“一珠-一化合物(one bead-one compound)”合成中，可以在固體樹脂珠粒上合成測試化合物；可以將所述化合物通過光不穩(wěn)定接頭(photolabile linker)固定在樹脂支持物上。然后可以將多個(gè)珠粒(例如，多達(dá)100,000個(gè)珠?；蚋?與酵母菌細(xì)胞結(jié)合并且將其噴霧形成多個(gè)“毫微滴(nano-droplets)”，其中每個(gè)毫微滴包含單個(gè)珠粒(并且，因此，單個(gè)測試化合物)。然后將所述毫微滴暴露于UV光線導(dǎo)致化合物從珠粒上分裂開。應(yīng)該理解這種測定方式允許以快速方式篩選測試化合物的大文庫。
化合物的組合文庫可以用“標(biāo)簽(tags)”合成，以編碼文庫的每一成員的身份(identity)(參見，例如W.C.Still等，U.S.專利No.5,565,324和PCT公布Nos.WO 94/08051和WO95/28640)。一般地，這種方法著重描述惰性但易于檢測的附著到固體支持物或化合物上的標(biāo)簽的應(yīng)用。當(dāng)檢測到活性化合物時(shí)(例如，通過上文所描述的技術(shù)之一)，通過獨(dú)特伴隨標(biāo)簽的鑒別確定所述化合物的身份。這種標(biāo)簽方法允許合成可以在很低水平識(shí)別的化合物的大文庫。這種標(biāo)簽方案可以用于，例如，在上文所描述的“毫微滴”篩選測定中，鑒別從珠粒釋放的化合物。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物文庫含有至少30種化合物，更優(yōu)選地至少100種化合物，和更優(yōu)選地至少500種化合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物文庫含有少于109種化合物，更優(yōu)選地少于108種化合物，和更優(yōu)選地少于107種化合物。
衍生的抑制劑CD2LFA-3相互作用的衍生的抑制劑也可用于本發(fā)明的方法，其中，例如，本文所描述的任何抗體同系物、可溶的CD2和LFA-3多肽、或CD2和LFA-3模擬試劑，其官能化結(jié)合到(通過化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合或其它方法)一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自由下列物質(zhì)組成的組的成員上抗-LFA-3和抗-CD2抗體同系物、可溶的LFA-3和CD2多肽、CD2和LFA-3模擬試劑、細(xì)胞毒素試劑以及藥用試劑。
一種類型的衍生抑制劑通過將2個(gè)或多個(gè)抑制劑(相同類型的或不同類型的)交聯(lián)而生產(chǎn)。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑包括那些具有2個(gè)不同的由適當(dāng)?shù)拈g隔基(例如m-馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯)分開的反應(yīng)基的異雙功能試劑(heterobifunctional)或那些同雙功能試劑(homobifunctional)(例如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)。所述連接劑可從Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois獲得。
對(duì)于交聯(lián)的另一種可能是利用在PI-連接的LFA-3或其片段中的PI鍵合信號(hào)序列。具體地，將編碼PI鍵合信號(hào)序列(例如，SEQ ID NO4的氨基酸162-212)的DNA連接到編碼需要的多肽優(yōu)選可溶的LFA-3多肽的DNA的下游。如果將這一構(gòu)建體在適當(dāng)?shù)恼婧思?xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞將識(shí)別所述PI鍵合信號(hào)序列，并將共價(jià)連接PI到多肽上。然后可以利用PI的疏水性形成多肽的膠束聚集體(micellar aggregates)。
還可以用連接到1種或多種細(xì)胞毒性或藥用試劑上的抑制劑。有用的藥用試劑包括生物活性肽、多肽和蛋白，諸如對(duì)除了CD2或LFA-3、或其片段的人多肽特異的抗體同系物。有用的藥用試劑和細(xì)胞毒性試劑還包括UV輻射(例如UVB)、環(huán)孢素A、潑你松、FK506、甲氨蝶呤、類固醇類、類視色素類、干擾素，以及氮芥。
用藥用試劑衍生化的優(yōu)選的抑制劑包括重組生產(chǎn)的多肽，其中將可溶的LFA-3多肽、可溶的CD2多肽、或肽基CD2或肽基LFA-3模擬試劑融合到免疫球蛋白重鏈鉸鏈區(qū)的全部或部分或者重鏈恒定區(qū)的全部或部分。用于制備所述融合蛋白的優(yōu)選的多肽是可溶的LFA-3多肽。最優(yōu)選的是這樣的融合蛋白，其含有融合到人IgG1鉸鏈區(qū)的一部分上的成熟LFA-3的氨基酸1-92(包括鉸鏈區(qū)的C端10個(gè)氨基酸，所述鉸鏈區(qū)含有被認(rèn)為參與鏈間二硫鍵的2個(gè)半胱氨酸殘基)，和IgG1重鏈恒定域的CH2和CH3區(qū)。期望這樣的融合蛋白表現(xiàn)出延長的血清半衰期并能夠使抑制劑二聚體化。
通過測定它們抑制LFA-3/CD2相互作用的能力，可以容易地確定特異的可溶CD2多肽、可溶LFA-3多肽、抗-LFA-3抗體同系物、抗-CD2抗體同系物或者CD2和LFA-3模擬試劑在本發(fā)明的方法中的效用。這一能力可以，例如，應(yīng)用簡單的細(xì)胞結(jié)合測定法進(jìn)行測定，所述細(xì)胞結(jié)合測定法允許假定的抑制劑在攜帶這些分子的細(xì)胞上抑制LFA-3和CD2之間的相互作用的能力的可見(在放大下)評(píng)估。Jurkat細(xì)胞優(yōu)選作為CD2+底物，和綿羊紅血細(xì)胞或人JY細(xì)胞優(yōu)選作為LFA-3+底物。用于本發(fā)明的可溶多肽、抗體同系物和模擬試劑的結(jié)合特征可以通過一些已知的方法進(jìn)行測定，諸如通過將抗體同系物、多肽或試劑放射性標(biāo)記(例如，用35S或125I)，然后適當(dāng)?shù)貙?biāo)記的多肽、模擬試劑或抗體同系物與CD2+和LFA-3+細(xì)胞接觸。還可以應(yīng)用適當(dāng)?shù)拿复贅?biāo)記二次抗體測定結(jié)合特征。還可以應(yīng)用諸如Seed等描述的玫瑰花結(jié)競爭測定法(rosetting competitionassays)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，第3365-69頁(1987))。
組合治療所述藥劑，例如可溶的CD2結(jié)合LFA-3多肽，可以用在與其它治療，例如其它藥劑的組合中。其它藥劑在此處稱為“第二藥劑”或“附加藥劑”，并且包含1種或多種的免疫抑制劑(例如，甲氨喋呤、環(huán)胞素、或苯丁酸氮芥)、環(huán)磷酰胺、潑你松、FK506、類固醇類、類視色素類、干擾素、氮芥、細(xì)胞因子結(jié)合試劑(例如，2型細(xì)胞因子結(jié)合試劑，例如，IL-2或IL-8結(jié)合試劑，例如，抗IL-2或IL-8單克隆抗體(Abgenix))、ICAM/LFA-1相互作用的抑制劑、例如抗ICAM-1(例如，人源化的、嵌合的、或人抗-ICAM-1抗體)的ICAM-結(jié)合試劑(例如，抗體，例如，單克隆抗體)；或抗LFA-1(例如，人源化的、嵌合的、或人抗-LFA-1抗體，例如，Raptiva(Genentech/Xoma))的LFA-1(也已知為CDlla)結(jié)合試劑(例如，抗體，例如，單克隆抗體)；共刺激分子結(jié)合試劑，例如B7-1(CD80)結(jié)合試劑(抗B7-1單克隆抗體(IDEC))；血管舒張劑(例如，ACE抑制劑或米諾地爾)；皮質(zhì)甾類或青霉胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，將試劑，例如CD2LFA-3相互作用的抑制劑，與1種或多種白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TGF-β、PDGF、粒酶A或白三烯B4抑制劑組合施用。這樣的組合治療可以有利地利用更低劑量的治療或預(yù)防藥劑。
“組合”施用，如此處所用，意指在受試者經(jīng)受所述疾病的折磨的過程中對(duì)受試者給予兩種(或更多)不同的治療，例如，在受試者確診患有所述疾病后并且在疾病尚未治愈或消除前，給予兩種或更多的治療。在一些實(shí)施方案中，在第二種治療的給予開始時(shí)，一種治療的給予還在發(fā)生，以致存在交迭。這在本文中有時(shí)稱為“同時(shí)”或“并發(fā)給予”。在其它實(shí)施方案中，在另一治療開始前停止一種治療的給予。在另一情形的一些實(shí)施方案中，由于組合施用，治療更加有效。例如，第二種治療更加有效，例如，使用更少的第二種治療看到等同的效果，或第二種治療更大程度地減少癥狀，大于如果在沒有第一種治療存在時(shí)施用第二種治療將見到的效果，或用第一種治療見到的類似情況。在一些實(shí)施方案中，這樣給予導(dǎo)致的癥狀、或與疾病相關(guān)的其它參量的減少，例如，在T細(xì)胞水平或活性中的減少，大于在沒有另一種治療存在的情況下給予一種治療可能觀察到的減少。兩種治療的效果可以部分地加合、完全加合、或大于加合。給予可以這樣，當(dāng)給予第二種治療時(shí)，給予的第一種治療的效果還可以檢測到，例如，當(dāng)首先給予CD2-或LFA-3結(jié)合藥劑時(shí)，在給予第二種藥劑時(shí)還可以檢測到在T細(xì)胞水平或活性中的減少。在優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種治療和第二種治療的給予發(fā)生在彼此的1，2，5，10，15，或30天內(nèi)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，全身性施用CD2-結(jié)合藥劑(例如，LFA-3/Ig融合體)、第二種藥劑(或兩者)或含有其的藥用組合物，例如，靜脈內(nèi)地、肌內(nèi)地、皮下地、關(guān)節(jié)內(nèi)地、經(jīng)皮地、鞘內(nèi)地、骨膜地、腫瘤內(nèi)地、損害內(nèi)地、損害周圍地、通過灌輸(例如，使用灌輸裝置)、口服地、局部地或通過吸入施用。優(yōu)選地，肌內(nèi)或靜脈內(nèi)地施用CD2-結(jié)合藥劑。在其它實(shí)施方案中，對(duì)受影響的區(qū)域局部施用CD2-結(jié)合藥劑，例如，局部地或通過無針注射(needleless injection)。
使用有針或無針注射器通過本領(lǐng)域已知的方法可以實(shí)施CD2-結(jié)合藥劑(例如，LFA-3/Ig融合體)、第二種藥劑(或兩者)或含有其的藥用組合物的腸胃外施用。在US 6,132,395，US 6,096,002，US 5,993,412，US5,893,397，US 5,520,639，US 5,503,627，US 5,399,163，US 5,383,851，US5,312,577，US 5,312,335中描述了無針注射器系統(tǒng)的實(shí)例和施用模式，所有這些的內(nèi)容通過參考結(jié)合于此。
藥用組合物優(yōu)選地，施用有效量的CD2LFA-3抑制劑(例如，本文所描述的可溶的、CD2-結(jié)合LFA-3多肽)?！坝行Я俊币庵改軌驕p輕本文所描述的疾病的擴(kuò)散或嚴(yán)重性的量。在治療實(shí)施方案中，所述藥劑的有效量是指在給受試者單一或多劑量施用時(shí)有效地抑制、減輕、或改善所述疾病(例如，提高銀屑病患者的PASI記分或PGA記分)，或者有效地延長患有所述疾病的患者超出在沒有這樣的治療存在時(shí)所期望的壽命的藥劑的量。例如，預(yù)計(jì)銀屑病的改善將導(dǎo)致生命質(zhì)量的提高，例如，如通過RANDCorporation(Santa Monica，加利福尼亞州)的一個(gè)部門RAND Health開展的SF-36健康調(diào)查表所評(píng)估的那樣。有效量的劑量不必定指示疾病的完全消除。在預(yù)防實(shí)施方案中，本文所描述的CD2-或LFA-3結(jié)合藥劑的有效量指在給受試者單一或多劑量施用時(shí)有效地預(yù)防或延緩發(fā)作的發(fā)生或疾病的復(fù)發(fā)的藥劑的量。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明白藥劑的有效量將取決于，除其它事物外，所治療的疾病(例如，T細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚疾病對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的除皮膚疾病外的器官疾病)、給藥計(jì)劃、施用的單位劑量、藥劑是否與其它治療藥劑組合施用、患者的免疫狀況和健康、施用的具體藥劑的治療或預(yù)防活性以及血清的半衰期。取決于要治療的疾病，所述藥劑可以不同地包裝。
優(yōu)選地，可溶的、CD2-結(jié)合LFA-3多肽(例如，LFA3TIP)以約0.001-約50mg藥劑每kg體重，更優(yōu)選地，約0.01-約10mg藥劑每kg體重，最優(yōu)選地，約0.1-約4mg藥劑每kg體重的劑量施用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可溶的、CD2-結(jié)合LFA-3多肽在通過IV途徑施用時(shí)以2-15mg的單位劑量(例如，7.5mg IV推注)，和在通過IM途徑施用時(shí)以2-30mg的劑量(例如，10mg或15mg IM注射)施用。優(yōu)選IM和IV施用。
單位劑量典型地施用直到觀察到效果。所述效果可以通過各種方法測量，包括體外T細(xì)胞活性測定法和受影響的皮膚區(qū)域的清除或改善，或在其它可能與具體疾病相關(guān)的受影響的身體區(qū)域的改善。優(yōu)選地，在治療周期過程中，定期施用單位劑量，諸如每周一次。更優(yōu)選地，它被定期施用，例如，對(duì)于幾周的施用周期，例如12周，以每周的時(shí)間間隔。如果受試者的疾病嚴(yán)重或如果顯示出緊急介入，還設(shè)想了更加頻繁的施用，例如，每周2次或3次，并且可能是適合的。如果受試者對(duì)治療反應(yīng)良好以致適合維持劑量，還設(shè)想了更不頻繁的施用，例如，每月1次或2次，并且可以采用。然而，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，在施用的任何一個(gè)具體周期期間，可以應(yīng)用更低或更高的劑量和其它給藥計(jì)劃。
所述藥劑，例如，CD2-結(jié)合LFA-3多肽(例如，AMEVIVE)，還優(yōu)選地以包含藥用載體的組合物的形式施用?！八幱幂d體”意指在施用其的患者中不引起過敏反應(yīng)或其它不適當(dāng)?shù)男Ч妮d體。
合適的藥用載體包括，例如，水、鹽、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等、以及其組合的一種或多種。藥用載體還可以包括少量的輔助物質(zhì)，諸如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液，其增加藥劑的保藏期或效力。
CD2-結(jié)合藥劑的制劑，例如藥用制劑，可以制備成水相或非水相形式，例如凍干的形式。優(yōu)選的藥用制劑適合用于注射。本發(fā)明包括的水相制劑的實(shí)例包括磷酸緩沖鹽水(PBS)冷凍的液態(tài)制劑。凍干制劑的實(shí)例包括一種或多種的檸檬酸、甘氨酸和蔗糖。例如，一種優(yōu)選的凍干制劑包括1-5％的蔗糖，優(yōu)選地2.5％的蔗糖，和0.5％-2％的甘氨酸，優(yōu)選地1％的甘氨酸，在檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(至少10mM，優(yōu)選25mM)中，其緩沖到至少約4，優(yōu)選地5，更加優(yōu)選地約6(或者甚至更加優(yōu)選地，6.8)的pH值。
第二種藥劑可以與CD2-結(jié)合藥劑以單一劑量形式(即，作為同一藥用組合物的一部分)、與CD2-結(jié)合藥劑分離但同時(shí)施用的多劑量形式、或者其中兩種成分獨(dú)立地并且順序施用的多劑量形式施用。備選地，CD2-結(jié)合藥劑和其它活性藥劑可以以單一的綴合分子的形式。兩種成分的偶聯(lián)可以通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)交聯(lián)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。單一分子還可以采取重組融合蛋白的形式。另外，用于本發(fā)明的藥用組合物可以用于和其它治療的組合中，諸如PUVA、化學(xué)治療和UV光線。這樣的組合治療可以有利地利用更低劑量的治療或預(yù)防藥劑。
CD2-結(jié)合藥劑，或藥用組合物，可以是各種形式。這些形式包括，例如，固體、半固體和液體劑量形式，諸如片劑、丸劑、粉劑、液體溶液、擴(kuò)散液或混懸液、脂質(zhì)體、栓劑、注射液、輸注液(infusible)、和局部制劑。優(yōu)選的形式取決于施用和治療應(yīng)用需要的模式。優(yōu)選形式為注射或輸注液溶液。
本發(fā)明包括適于用作局部應(yīng)用的防曬劑或UV防護(hù)劑的制劑。優(yōu)選實(shí)施方案包括AMEVIVE制劑?；钚越M分可以配制成脂質(zhì)體。所述產(chǎn)品可以在UV曝曬之前、之中、或之后，或者在發(fā)紅(redness)發(fā)展之前、之中、或之后應(yīng)用。
序列下列是在US 6,162,432中描述的和貫穿本申請(qǐng)所涉及的序列的總結(jié)SEQ ID NO1跨膜LFA-3的DNA序列SEQ ID NO2跨膜LFA-3的氨基酸序列SEQ ID NO3PI連接的LFA-3的DNA序列SEQ ID NO4PI連接的LFA-3的氨基酸序列SEQ ID NO5CD2的DNA序列SEQ ID NO6CD2的氨基酸序列SEQ ID NO7AMEVIVE的DNA序列SEQ ID NO8AMEVIVE的氨基酸序列實(shí)施例實(shí)施例1使用AMEVIVE_(alefacept)對(duì)銀屑病的多療程治療本實(shí)施例檢驗(yàn)在接受使用AMEVIVE_長達(dá)4.5年的達(dá)9個(gè)治療周期的多療程治療的患者中的功效和安全性。
治療在公開標(biāo)記(open-label)研究中的初始治療周期稱為周期A。后續(xù)周期標(biāo)記為周期B，C，D，等。在每一周期中，患者接受每周一次的治療達(dá)12周(給藥期)，接著是12周的觀察(休息期)。
通過靜脈(IV)推注注射施用7.5mg AMEVIVE。
在延伸研究的起始治療前，基于醫(yī)生對(duì)疾病嚴(yán)重性的評(píng)估，以及CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)處于或高于正常的下限(LLN；404個(gè)細(xì)胞/mm3)，建立全身性治療的需要。
對(duì)于后續(xù)周期的合格性是基于前述的標(biāo)準(zhǔn)，以及，另外在前一周期的12周的治療期間，患者必須已經(jīng)接受≥8劑量的AMEVIVE，以及對(duì)于周期C和后續(xù)周期，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)要求≥75％的在本研究的檢診隨訪(screening visit)所記錄的計(jì)數(shù)。
在任何給出的周期內(nèi)，如果患者具有CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)＜300但是＞200個(gè)細(xì)胞/mm3，將AMEVIVE的劑量減少50％(3.75mg)。如果CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)＜200個(gè)細(xì)胞/mm3，保持計(jì)劃的劑量。如果CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)＜200個(gè)細(xì)胞/mm3持續(xù)4個(gè)連續(xù)的隨訪，持久地保持AMEVIVE。當(dāng)看到臨床顯著感染的跡象時(shí)，保持AMEVIVE的劑量2周。
評(píng)估通過銀屑病面積和嚴(yán)重性指數(shù)(PASI)以及通過醫(yī)生綜合評(píng)估(PGA)評(píng)估功效。對(duì)于周期A，在治療期間的1，3，5，7，9，11，和12周以及在治療后的2，4，6，8，和12周進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于后續(xù)周期，在治療期間的1和7周以及在治療后的2和12周進(jìn)行評(píng)估。報(bào)道在PASI方面相對(duì)于基線獲得≥50％和≥75％的改善(分別地，PASI 50和PASI 75)的患者以及獲得“清楚(clear)”或“幾乎清楚”的PGA的患者的比例。
在每個(gè)研究隨訪，除了在周期A的治療后的4周和在全部后續(xù)周期的治療后的4和8周之外，實(shí)行全部淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞型的分析。在全部隨訪監(jiān)測患有新的或正在發(fā)生的病毒、細(xì)菌、或真菌感染的患者。貫穿本研究整個(gè)過程監(jiān)測不利事件。
結(jié)果在這一分析時(shí)，患者已經(jīng)接受使用AMEVIVE長達(dá)4.5年的重復(fù)周期的治療。在本研究中，175名患者已經(jīng)接受≥1個(gè)周期的AMEVIVE；126名接受≥2個(gè)周期；96名接受≥3個(gè)周期；71名接受≥4個(gè)周期。作為在前面的2期研究中暴露于AMEVIVE的結(jié)果，一些患者已經(jīng)接受多達(dá)9個(gè)周期的AMEVIVE。
功效圖2中顯示在周期A-D治療后2或12周獲得PASI 50的患者的比例。與周期A和B相比，周期C和D的應(yīng)答率顯著地增加。在周期A、B、C、和D中，獲得PASI 75的患者比例分別為29％、33％、34％、和52％。對(duì)于“清楚”或“幾乎清楚”的PGA對(duì)應(yīng)的應(yīng)答率分別為24％、29％、33％、和34％。
對(duì)于周期A-D，圖3中顯示使用AMEVIVE的附加治療周期的遞增受益(incremental benefit)和重復(fù)應(yīng)答。對(duì)于接受AMEVIVE附加周期的周期A應(yīng)答者(即，在周期A中獲得PASI 50的患者)，獲得PASI 50的患者比例隨著每一后續(xù)周期而增加。一般地，患者繼續(xù)應(yīng)答使用AMEVIVE的重復(fù)治療，而沒有快速減敏性(tachyphylaxis)的跡象。在給出的周期中獲得PASI 50的那些患者中，75％-90％的患者在后續(xù)周期(即，重復(fù)應(yīng)答)中獲得PASI 50。
不利事件一般地，不利事件的發(fā)生率在周期中沒有改變很多。隨著多周期(多療程治療)的施用，AMEVIVE的全面安全曲線(overall safety profile)與在3期研究中報(bào)道的結(jié)果相似。在任何周期中，嚴(yán)重不利事件的發(fā)生率為7％或更少，并且嚴(yán)重不利事件的譜圖與先前的2和3期研究相似。
由于不利事件，在周期A和B的每個(gè)周期中的2名患者和周期E中的1名患者停止了治療。毒性的發(fā)生率低在任何周期中3％或更少；大多數(shù)為皮膚癌。
無治療(Treatment-Free)應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間在3期研究中，用保持PASI 50應(yīng)答持續(xù)中值為7個(gè)月的患者證明了AMEVIVE的減緩作用。在這一實(shí)例中，一些患者已被跟蹤持續(xù)成功治療周期后的延長期間。圖4顯示在4名這樣的患者中應(yīng)答時(shí)間的最大長度。在一些患者中，對(duì)使用AMEVIVE的治療的應(yīng)答保持了18-24個(gè)月。
淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)貫穿使用AMEVIVE的多周期治療，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少是一致的。隨著每個(gè)周期觀察到的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少不是累積的。
對(duì)于全部周期，CD4+T細(xì)胞的平均計(jì)數(shù)保持在LLN之上，并且不因多療程暴露于AMEVIVE而減少(圖5)。
總之，本研究表明多療程治療(3個(gè)治療周期或更多)提供比單療程治療更顯著的結(jié)果，而且沒有明顯的副作用的附加風(fēng)險(xiǎn)?；颊吆芎玫啬褪芏嘀芷诘腁MEVIVE，并且貫穿周期不利事件的發(fā)生率變化不多。
實(shí)施例2使用AMEVIVE對(duì)銀屑病的多療程治療本實(shí)施例檢驗(yàn)銀屑病患者中對(duì)使用AMEVIVE第二周期治療的臨床應(yīng)答以及多周期治療的功效，其中所述銀屑病患者在使用AMEVIVE的第一周期治療期間沒能獲得≥50％的銀屑病面積和嚴(yán)重度指數(shù)(PASI 50)減少或≥25％的減少(PASI 25)。
患者患者≥16歲，并且患有慢性蝕斑銀屑病的時(shí)間≥12個(gè)月，其涉及≥10％的體表面積。CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)要求高于正常的下限(LLN)。在使用AMEVIVE治療前4周內(nèi)并貫穿整個(gè)研究過程，禁止使用光線療法、全身性類視色素、全身性皮質(zhì)甾類、全身性富馬酸鹽、免疫抑制(甲氨蝶呤、環(huán)胞菌素、硫唑嘌呤、和硫鳥嘌呤)、以及高效的局部皮質(zhì)甾類。在使用AMEVIVE治療前2周內(nèi)并貫穿整個(gè)研究過程，除了在頭皮、手掌、腹股溝和足底以外，禁止使用中效的局部皮質(zhì)甾類、局部類視色素、煤焦油、角質(zhì)層分離劑、以及維生素D類似物。為了合格地參與本延伸研究中，要求患者已經(jīng)接受≥8劑量的AMEVIVE，并且完成前一治療周期的最終隨訪(follow-up visit)。如果他們參與任何其它的藥物或非藥物治療的調(diào)查性研究，或者在前一周期8周前開始備選的全身性銀屑病治療、光線療法、或其它禁止的治療，這些患者被排除在本延伸研究之外。
治療3期研究是多中心的、隨機(jī)化的、雙盲的和安慰劑對(duì)照的(Krueger等，J.Am.Acad.Dermatol.47821-833，2002；Lebwohl等，Arch.Dermatol.139719-727，2003)。在使用AMEVIVE的靜脈內(nèi)(IV)治療的3期研究中，患者接受2個(gè)周期的治療，其中每個(gè)周期由下列階段組成(i)12周的給藥期，每周一次AMEVIVE(7.5mg)或安慰劑，和(ii)12周隨訪(follow-up)(休息期)。在使用AMEVIVE的肌內(nèi)(IM)治療的3期研究中，患者接受單周期的治療，其由12周的給藥期接著12周的觀察期(休息期)組成，在給藥期內(nèi)每周一次AMEVIVE(10mg或15mg)或安慰劑。
在多療程治療的研究中，接受使用AMEVIVE的附加周期的治療(相同的劑量方案)的患者是那些研究者確定其疾病已經(jīng)進(jìn)展到需要全身性治療或光線治療，并且具有處于或高于LLN的循環(huán)CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)的患者(Gordon等，J.Drugs Dermatol.2624-628，2003)。
評(píng)估在3期研究期間，在基線處評(píng)估PASI和醫(yī)生綜合評(píng)估(PGA)，在治療期間每隔2周1次，和在隨訪期間每隔2-4周1次。還在IV多療程研究期間的一些時(shí)間點(diǎn)評(píng)估PASI和PGA，但是在IM多療程研究期間只評(píng)估PGA。
分析應(yīng)用來自使用AMEVIVE的IV治療的2周期3期研究的數(shù)據(jù)來確定2組患者中使用AMEVIVE的治療的第二周期的功效(a)在第一周期中沒能獲得PASI 50的那些患者和(b)在第一周期中沒能獲得PASI 25的那些患者。確定在使用AMEVIVE的治療的周期1期間沒能獲得PASI 50和PASI 25的患者在治療的第二周期期間的任何時(shí)間獲得PASI 50或PASI減少≥75(PASI 75)的患者比例。計(jì)算出可能性比率和對(duì)應(yīng)95％的置信區(qū)間(CIs)來比較在接受使用AMEVIVE的治療的第二個(gè)周期的患者和接受安慰劑的患者之間的應(yīng)答率。還確定了在IV治療的每一個(gè)周期期間的任何時(shí)間獲得PASI 50、PASI 75和“清楚”或“幾乎清楚”的PGA的患者比例，和在IM治療的每一個(gè)周期期間的任何時(shí)間獲得“清楚”或“幾乎清楚”的PGA的患者比例。
結(jié)果患者的平均年齡～45歲，并且～70％為男性。銀屑病的持續(xù)時(shí)間為～19年，并且涉及的平均體表面積為～22％。表1中總結(jié)了接受使用AMEVIVE的IV和IM治療的每一個(gè)周期的患者人數(shù)。
表1接受AMEVIVE的多周期的患者人數(shù)。
在先前沒能獲得PASI 50或PASI 75的患者中第二治療周期的功效在使用AMEVIVE的IV治療的第二周期期間，在第一周期期間沒能獲得PASI 50的患者中的93％的患者和在第一周期期間沒能獲得PASI 25的患者中的89％的患者中觀察到PASI的改善。在第二周期內(nèi)使用AMEVIVE治療導(dǎo)致比安慰劑治療有顯著更高的比例的患者獲得PASI 50和PASI 75(表2)。在使用AMEVIVE治療的初始周期期間沒能獲得PASI50的患者中有19％的患者在第二周期期間獲得PASI 75，和53％獲得PASI50。在使用AMEVIVE治療的初始周期期間沒能獲得PASI 25的患者中有14％的患者在第二周期期間獲得PASI 75，和47％獲得PASI 50(表2)?？赡苄员嚷时砻鳎c沒有接受另一周期的患者相比，在周期1中沒能獲得PASI 50或PASI 25的患者有2-3倍更大的可能在周期2中獲得PASI 50或PASI 75(表2)。
表2在第一周期期間沒能獲得PASI 50或PASI 25的患者中在AMEVIVE的第二周期期間的任何時(shí)間的PASI改善。
多療程治療的功效在每一個(gè)后續(xù)治療周期期間，接受使用AMEVIVE的多周期IV治療的患者表現(xiàn)出在PASI方面的遞增的改善。獲得PASI 75的患者比例從周期1期間的29％增加到周期5期間的最大值54％(圖6A)。同樣地，獲得PASI 50的患者比例從周期1期間的56％增加到周期5期間的最大值74％(圖6B)。
PGA結(jié)果進(jìn)一步支持在銀屑病使用AMEVIVE的多周期治療中觀察到的遞增的臨床改善。在使用AMEVIVE的IV治療的周期1期間，23％的患者具有“清楚”或“幾乎清楚”的PGA。在周期5期間，44％的患者獲得這一水平的應(yīng)答(圖7A)。對(duì)于使用AMEVIVE的IM治療，PGA“清楚”/“幾乎清楚”應(yīng)答率從周期1期間的21％增加到周期4期間的最大值41％(圖7B)。
總之，隨著使用AMEVIVE的連續(xù)周期的治療看到遞增的臨床改善，這表明其對(duì)于患有慢性蝕斑銀屑病的患者的長期治療的功效。多療程治療的數(shù)據(jù)表明，不管對(duì)初始治療的應(yīng)答，患者對(duì)使用AMEVIVE的附加治療的應(yīng)答是遞增受益的。
權(quán)利要求
1.一種治療患有銀屑病的受試者的方法，該方法包括對(duì)所述受試者施行可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽的多療程治療，其中所述多療程包括多個(gè)治療周期，以及其中所述每個(gè)周期包括1個(gè)給藥期和1個(gè)休息期。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽是LFA-3融合蛋白。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽是LFA-3/免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽包括與Ig重鏈鉸鏈區(qū)的全部或部分以及重鏈恒定區(qū)的全部或部分融合的可溶的LFA-3多肽。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽包括由成熟LFA-3的N端92個(gè)氨基酸、人IgG1鉸鏈區(qū)的C端10個(gè)氨基酸、人IgG1重鏈的CH2區(qū)、以及至少部分的人IgG1重鏈的CH3區(qū)組成的融合蛋白。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽為AMEVIVE(圖1)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽由包含在質(zhì)粒pSAB152中的插入片段所編碼，質(zhì)粒pSAB152保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為ATCC 68720。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多療程包括至少4個(gè)治療周期。
9.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多療程包括至少5個(gè)治療周期。
10.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多療程包括至少6個(gè)治療周期。
11.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多療程包括至少7個(gè)治療周期。
12.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多療程包括至少8個(gè)治療周期。
13.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多療程的每個(gè)連續(xù)周期的休息期長于在多療程中在先周期的休息期。
14.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多療程的最后周期的休息期是至少2年。
15.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多療程的最后周期的休息期是至少3年。
16.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多療程的每個(gè)周期的給藥期是至少8周。
17.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多療程的每個(gè)周期的給藥期是至少10周。
18.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多療程的每個(gè)周期的給藥期是至少12周。
19.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽被肌內(nèi)施用。
20.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽被靜脈內(nèi)施用。
21.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽以2-30mg范圍內(nèi)的單位劑量施用。
22.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括在多療程治療期間給受試者施用附加的治療或預(yù)防藥劑。
23.一種治療需要治療銀屑病的受試者的方法，該方法包括對(duì)受試者施行AMEVIVE(圖1)的多療程的治療，其中所述多療程的治療包括至少3個(gè)治療周期，每一個(gè)治療周期包括AMEVIVE(圖1)的每周1次施用并持續(xù)12周的給藥期，接著是至少12周的休息期。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述多療程的治療包括至少4個(gè)治療周期。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述多療程的治療包括至少5個(gè)治療周期。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述方法包括在多療程中每個(gè)周期的給藥期以及休息期之一或兩者期間，關(guān)于AMEVIVE(圖1)的作用對(duì)受試者進(jìn)行評(píng)估。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述方法還包括在多療程治療期間給受試者施用附加的治療或預(yù)防藥劑。
28.一種治療患有銀屑病的患者的方法，該方法包括(a)基于已經(jīng)具有使用可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽的至少2個(gè)治療周期，選擇受試者和(b)給所述受試者施用可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽的第3個(gè)治療周期。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述可溶的CD2-結(jié)合LFA-3多肽是AMEVIVE(圖1)。
30.一種試劑盒，其包括包含AMEVIVE的藥用組合物和給早先已經(jīng)具有使用AMEVIVE(圖1)的2個(gè)治療周期的患者施用所述藥用組合物的用法說明。
全文摘要
本發(fā)明提供治療皮膚疾病的方法。
文檔編號(hào)C07K14/705GK1953766SQ200580011939
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月6日
發(fā)明者D·馬吉勒維 申請(qǐng)人:安斯泰來美國有限公司