本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種藥物組合物及其制備方法，具體涉及該藥物組合物在制備抗感染疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著抗生素的廣泛應(yīng)用及其濫用，越來(lái)越多的細(xì)菌對(duì)抗生素藥物出現(xiàn)了不敏感現(xiàn)象，甚至是產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性。盡管科學(xué)家不斷研究制造抗菌譜更廣、抗菌作用更強(qiáng)的新抗生素，但卻仍然不能控制耐藥菌的產(chǎn)生和發(fā)展。因此，尋找具有抗菌效果的新型藥物迫在眉睫。ausubel實(shí)驗(yàn)室曾利用e.faecalisstrainsmmh594，og1rf，og1rf△fsrb，v583，vs583等感染野生型n2秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)(caenorhabditiselegans，縮寫(xiě)c.elegans)及glp-4(bn2ts)；sek-1(km4)突變株系線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)6000種合成藥及1136種天然提取藥進(jìn)行抗感染藥效的篩選，并成功篩選出16種具有高抗感染活性的藥物。楊再昌等在ausubel的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用c.elegans作為模型評(píng)估了黃連中藥的體內(nèi)抗感染活性，發(fā)現(xiàn)中草藥黃連具有體內(nèi)抗感染作用，而黃連已在感染小鼠實(shí)驗(yàn)中證明具有較好的抗感染效果。因此，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)感染模型能夠?qū)哂锌垢腥咀饔玫乃幬镞M(jìn)行有效的篩選。本發(fā)明公開(kāi)了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括人參、生黃芪、肉桂，該藥物組合物為保元湯的減味方，與保元湯相比，本發(fā)明的藥物組合物在不含炙甘草的情況下，具有同等的體內(nèi)抗感染作用和毒副作用。因此本發(fā)明的藥物組合物與保元湯相比，更經(jīng)濟(jì)，更適合在制備抗感染疾病的藥物中應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物按重量份，包括人參5份，生黃芪15份，肉桂3份。優(yōu)選地，所述的人參為0.125g，生黃芪為0.375g，肉桂為0.075g。其中，所述的藥物組合物的制備方法如下：a、按比例稱(chēng)取藥材人參，生黃芪，肉桂，加蒸餾水，浸泡20min，煮沸30min；b、停止加熱，冷卻后，濾出即得第一次煎煮液；c、將b所得藥渣加與a等體積的蒸餾水，煮沸30min；d、停止加熱，冷卻后，濾出即得第二次煎煮液；e、合并b、d所得煎煮液，定容；f、將e所得煎煮液在12000rpm，10min條件下離心2次，沉淀藥渣，留取上清液；g、將f所得上清液用0.22μm的無(wú)菌濾頭過(guò)濾除菌即得。優(yōu)選地，所述的藥物組合物的生藥濃度為11.5g/l。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。其中，所述的感染是由糞腸球菌或銅綠假單胞菌引起的。另外，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物的制備方法，所述的藥物組合物的制備方法如下：a、按比例稱(chēng)取藥材人參，生黃芪，肉桂，加蒸餾水，浸泡20min，煮沸30min；b、停止加熱，冷卻后，濾出即得第一次煎煮液；c、將b所得藥渣加與a等體積的蒸餾水，煮沸30min；d、停止加熱，冷卻后，濾出即得第二次煎煮液；e、合并b、d所得煎煮液，定容；f、將e所得煎煮液在12000rpm，10min條件下離心2次，沉淀藥渣，留取上清液；g、將f所得上清液用0.22μm的無(wú)菌濾頭過(guò)濾除菌即得。附圖說(shuō)明圖1為不同濃度保元湯對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)ss104-e.faecalisog1rf感染模型的壽命影響的藥效比較。圖2為不同濃度保元湯對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)ss104-e.faecalisog1rf感染模型壽命的半數(shù)致死時(shí)間影響的藥效比較。圖3為20倍稀釋的保元湯及其同倍稀釋的拆方藥物組合物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)ss104-e.faecalisog1rf感染模型壽命影響的藥效比較。圖4為20倍稀釋的保元湯及其同倍稀釋的拆方藥物組合物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)ss104-e.faecalisog1rf感染模型壽命的半數(shù)致死時(shí)間影響的藥效比較。圖5為20倍稀釋的配方2對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)ss104-p.aeruginosa感染模型壽命影響的藥效比較。圖6為20倍稀釋的配方2對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)ss104-p.aeruginosa感染模型壽命的半數(shù)致死時(shí)間影響的藥效比較。圖7為20倍稀釋的保元湯及其同倍稀釋的配方1與配方2對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)n2壽命影響的藥效比較。圖8為20倍稀釋的保元湯及其同倍稀釋的配方1與配方2對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)n2壽命的半數(shù)致死時(shí)間影響的藥效比較。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所述實(shí)施例。實(shí)施例一藥物組合物的制備材料：人參、生黃芪和肉桂購(gòu)買(mǎi)于蘭州惠仁堂藥業(yè)連鎖有限責(zé)任公司。本發(fā)明的藥物組合物(配方2)包括人參2.5g，生黃芪7.5g，肉桂1.5g。制備方法：所述的藥物組合物的制備方法如下：a、稱(chēng)取藥材人參2.5g，生黃芪7.5g，肉桂1.5g，加蒸餾水150ml，浸泡20min，煮沸30min；b、停止加熱，冷卻后，濾出即得第一次煎煮液；c、將b所得藥渣加蒸餾水150ml，煮沸30min；d、停止加熱，冷卻后，濾出即得第二次煎煮液；e、合并b、d所得煎煮液，定容至50ml；f、將e所得煎煮液在12000rpm，10min條件下離心2次，沉淀藥渣，留取上清液；g、將f所得上清液用0.22μm的無(wú)菌濾頭過(guò)濾除菌即得。實(shí)施例二藥物組合物的體外抑菌作用1、生物材料(1)埃希氏菌屬大腸桿菌op50(e.coliop50)，購(gòu)自caenorhabditisgeneticscenter(cgc)。(2)金黃色葡萄球菌staphylococcusaureusatcc29213(s.aureusatcc29213)，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(atcc)，編號(hào)29213。(3)銅綠假單胞菌pseudomonasaeruginosaatcc27853(p.aeruginosaatcc27853)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(atcc)，編號(hào)27853。(4)糞腸球菌enterococcusfaecalisatcc29212(e.faecalisatcc29212)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(atcc)，編號(hào)29212。(5)白色念珠菌canidiaalbicansatcc10231(c.albicansatcc10231)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(atcc)，編號(hào)10231。2、試劑(1)藥物：為實(shí)施例一制備得到的藥物組合物。(2)固體bhi(brainheartinfusion)培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)(bhi培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司)：固體bhi培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(3)固體lb(lysogenybroth)培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：成分含量蛋白胨10.00g酵母粉5.00gnacl10.00g瓊脂粉17.00g補(bǔ)充h2o至1000ml固體lb培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(4)固體mh(mueller-hinton)培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：成分含量牛肉浸膏6.00g可溶性淀粉1.50g酸水解酪蛋白17.50g瓊脂粉17.00g補(bǔ)充h2o至1000ml固體mh培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(5)固體改良馬丁培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：成分含量蛋白胨5.00gk2hpo41.00g酵母粉2.00gmgso40.50g葡萄糖20.00g瓊脂粉17.00g補(bǔ)充h2o至1000ml固體改良馬丁培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(6)固體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：成分含量蛋白胨10.00g牛肉浸膏3.00gnacl5.00g瓊脂粉17.00g補(bǔ)充h2o至1000ml固體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。3、儀器高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)單人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科技有限公司)連續(xù)變倍體視顯微鏡(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)漩渦攪拌器(上海精科儀器有限公司)離心機(jī)(ct15e，日立)4、實(shí)施步驟(1)菌液培養(yǎng)：取20μls.aureus的菌液在營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上劃單克隆，37℃培養(yǎng)48h。挑單克隆于150ml營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基混濁。4℃冷藏，備用。取20μlp.aeruginosa的菌液在lb固體培養(yǎng)基上劃單克隆，37℃培養(yǎng)48h。挑單克隆于150mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基混濁。4℃冷藏，備用。取20μle.coli的菌液在營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上劃單克隆，37℃培養(yǎng)48h。挑單克隆于150ml營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基混濁。4℃冷藏，備用。取20μle.faecalisatcc29212的菌液在bhi固體培養(yǎng)基上劃單克隆，37℃培養(yǎng)48h。挑單克隆于150mlbhi液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基混濁。4℃冷藏，備用。取20μlc.albicans的菌液在改良的馬丁固體培養(yǎng)基上劃單克隆，37℃下培養(yǎng)48h。挑單克隆于150ml馬丁液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基混濁。4℃冷藏，備用。(2)牛津杯法體外抑菌實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組(無(wú)菌蒸餾水)，陽(yáng)性對(duì)照組(0.125g/l左氧氟沙星或100μg/ml制霉素)，藥物組合物水煎液實(shí)驗(yàn)組。采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ孟鄳?yīng)菌的液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至0.5(即細(xì)菌數(shù)在1.5×108/ml，見(jiàn)表1)。在mh固體培養(yǎng)基板上，涂布200μl菌液，其中菌液包括：s.aureus、p.aeruginosa、e.coli、e.faecalisatcc29212(每個(gè)菌株設(shè)置2～3個(gè)平行)。而在馬丁固體培養(yǎng)基上涂布200μlc.albicans菌液，同樣設(shè)置2～3個(gè)平行。待菌液被培養(yǎng)基吸收后，在各個(gè)培養(yǎng)基上各放置三個(gè)牛津杯，s.aureus、p.aeruginosa、e.coli、e.faecalisatcc29212組的菌板分別加入200μl無(wú)菌蒸餾水、200μl0.125g/l左氧氟沙星、200μl藥物組合物水煎液；c.albicans組的菌板分別加入200μl無(wú)菌蒸餾水、200μl100μg/ml制霉素、200μl藥物組合物水煎液。放入37℃恒溫箱培養(yǎng)，12h后進(jìn)行觀察。若12h后出現(xiàn)明顯的抑菌圈，取出s.aureus、p.aeruginosa、e.coli、e.faecalis、c.albicans的各培養(yǎng)基，測(cè)量抑菌圈直徑(mm)。當(dāng)抑菌圈直徑d≥20mm時(shí)定為極敏，記作“+++”；當(dāng)抑菌圈直徑15≤d＜20mm時(shí)定為高敏，記作“++”；當(dāng)抑菌圈直徑10≤d＜15mm時(shí)定為中敏，記作“+”；當(dāng)抑菌圈直徑d＜10mm時(shí)定為低敏或無(wú)效，記作“－”。結(jié)果見(jiàn)表2。表1麥?zhǔn)媳葷岱岫萣acl2(1.175％，g/l)h2so4(1％，v/v)細(xì)菌數(shù)×108/ml0.50.5ml99.5ml1.511.0ml99.0ml3.0表2藥物組合物水煎液的體外抑菌結(jié)果表2中陰性對(duì)照組為無(wú)菌蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照組為0.125g/l左氧氟沙星(可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌生長(zhǎng))或100μg/ml制霉素(可抑制白色念珠菌生長(zhǎng))，實(shí)驗(yàn)組為藥物組合物水煎液。表2中所展示的是陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及藥物組合物水煎液抑菌圈直徑的測(cè)量數(shù)值。從結(jié)果中可以看出，本發(fā)明所公開(kāi)的藥物組合物水煎液在該濃度下對(duì)五種供試菌均無(wú)直接抑制生長(zhǎng)作用，說(shuō)明本發(fā)明所研究的藥物組合物水煎液在該濃度下無(wú)體外抑菌效果。實(shí)施例三藥物組合物及其保元湯的體內(nèi)抗感染作用與毒副作用1、生物材料(1)c.elegansss104購(gòu)自caenorhabditisgeneticscenter；基因型為glp-4(bn2)i，在溫度為20℃的恒溫箱里能正常生長(zhǎng)，并繁殖后代，在溫度為25℃的恒溫箱里生長(zhǎng)可誘導(dǎo)不育。(2)c.elegansn2購(gòu)自caenorhabditisgeneticscenter；為野生型，在溫度為20℃的恒溫箱里能正常生長(zhǎng)，并繁殖后代。(3)埃希氏菌屬大腸桿菌op50(e.coliop50)，購(gòu)自caenorhabditisgeneticscenter，作為c.elegans的食物。(4)糞腸球菌enterococcusfaecalisog1rf(e.faecalisog1rf)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(atcc)，編號(hào)47077。(5)銅綠假單胞菌pseudomonasaeruginosaatcc27853(p.aeruginosaatcc27853)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(atcc)，編號(hào)27853。2、試劑(1)藥物：實(shí)施例一制備得到的藥物組合物水煎液(配方2)；保元湯；配方1；配方3；配方4配方分別為：保元湯：人參2.5g，生黃芪7.5g，肉桂1.5g，炙甘草2.5g；配方1：人參2.5g，生黃芪7.5g，炙甘草2.5g；配方3：人參2.5g，肉桂1.5g，炙甘草2.5g；配方4：生黃芪7.5g，肉桂1.5g，炙甘草2.5g；制備方法如下：a、按配方比例稱(chēng)取藥材，加蒸餾水150ml，浸泡20min，煮沸30min；b、停止加熱，冷卻后，濾出即得第一次煎煮液；c、將b所得藥渣加蒸餾水150ml，煮沸30min；d、停止加熱，冷卻后，濾出即得第二次煎煮液；e、合并b、d所得煎煮液，定容至50ml；f、將e所得煎煮液在12000rpm，10min條件下離心2次，沉淀藥渣，留取上清液；g、將f所得上清液用0.22μm的無(wú)菌濾頭過(guò)濾除菌即得。(2)固體ngm(nematodegrowthmedium)培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：成分含量nacl3.00gk2hpo42.34gkh2po417.23g蛋白胨2.50g瓊脂粉17.00g補(bǔ)充h2o至1000ml固體ngm培養(yǎng)基配制好后，121℃高壓恒溫滅菌20min，在無(wú)菌操作臺(tái)中加入5g/l膽固醇1ml，1mmgso41ml，1mcacl21ml，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(3)固體bhi(brainheartinfusion)培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)(bhi培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司)：成分含量bhi38.50g瓊脂粉17.00g補(bǔ)充h2o至1000ml固體bhi培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(4)改良ngm培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：成分含量nacl3.00gk2hpo42.34gkh2po417.23g蛋白胨3.50g瓊脂粉17.00g補(bǔ)充h2o至1000ml改良ngm培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，在無(wú)菌操作臺(tái)下加入5g/l膽固醇1ml，1mmgso41ml，1mcacl21ml，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(5)m液配方成分含量na2hpo46.00gkh2po43.00gnacl5.00g1mmgso41.00ml補(bǔ)充h2o至1000ml配制好m液之后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，待其冷卻，置于室溫下，備用。(6)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)裂解液的配制取0.32ml的naclo液體溶于4.68ml的m液，再加入5ml1m的naoh溶液，即為秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)裂解液。(7)配制不含藥物的bhi培養(yǎng)基吸取3ml無(wú)菌蒸餾水，溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基中，再把培養(yǎng)基均分至10個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中。(8)配制含有不同濃度保元湯水煎液的bhi培養(yǎng)基吸取3ml的保元湯水煎液溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基，即為10倍稀釋保元湯；吸取4ml的保元湯水煎液溶于4ml的無(wú)菌蒸餾水，記為液體1，吸取3ml液體1溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基，即為20倍稀釋保元湯；吸取4ml的液體1溶于4ml的無(wú)菌蒸餾水，記為液體2，吸取3ml液體2溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基，即為40倍稀釋保元湯；吸取4ml的液體2溶于4ml的無(wú)菌蒸餾水，記為液體3，吸取3ml液體3溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基，即為80倍稀釋保元湯。以此方法得到生藥濃度為28g/l、14g/l、7g/l、3.5g/l的10倍稀釋的保元湯、20倍稀釋的保元湯、40倍稀釋的保元湯、80倍稀釋的保元湯。將含不同濃度保元湯的培養(yǎng)基均分至10個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中。(9)配制含有不同藥物組別水煎液的bhi培養(yǎng)基分別吸取2ml的不同藥物組別水煎液溶于2ml的無(wú)菌蒸餾水，記為液體1，分別吸取3ml液體1溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基，即為20倍稀釋的不同藥物組別水煎液。將含20倍稀釋的不同藥物組別水煎液的培養(yǎng)基均分至10個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中。(10)配制不含藥物水煎液的改良ngm培養(yǎng)基吸取3ml無(wú)菌蒸餾水，溶于27ml滅菌之后的改良ngm培養(yǎng)基中，把培養(yǎng)基均分至10個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中。(11)配制含有20倍稀釋的藥物組合物(配方2)水煎液的改良ngm培養(yǎng)基吸取2ml的藥物組合物(人參、生黃芪和肉桂)水煎液溶于2ml的無(wú)菌蒸餾水，記為液體1。再吸取3ml液體1溶于27ml滅菌之后的改良ngm培養(yǎng)基，即為配方2。將含配方2的培養(yǎng)基均分至10個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中。3、儀器高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)單人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)spx智能型生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科技有限公司)連續(xù)變倍體視顯微鏡(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)漩渦攪拌器(上海精科儀器有限公司)離心機(jī)(ct15e，日立)4、實(shí)施步驟(1)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)：將秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)接在涂布有200μle.coliop50的固體ngm培養(yǎng)基上，然后置于20℃的恒溫箱中培養(yǎng)，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)長(zhǎng)到成蟲(chóng)階段開(kāi)始產(chǎn)卵，當(dāng)固體ngm培養(yǎng)基表面的卵數(shù)與幼蟲(chóng)數(shù)比例大約1:1時(shí)，進(jìn)行同步化處理。(2)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)同步化：挑選含有大量成蟲(chóng)并且有部分蟲(chóng)卵已經(jīng)孵出的ngm培養(yǎng)基，用m液將秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)從培養(yǎng)基上沖下，轉(zhuǎn)移到離心管中，靜置使秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)自由沉降至管底，棄上清。根據(jù)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的數(shù)量向離心管中加入秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)裂解液，在漩禍攪拌器上振蕩5-7min待秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)全部斷裂時(shí)停止渦旋，并分裝于1.5ml離心管中，用m液洗蟲(chóng)卵三次，然后把秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的卵直接加到涂有op50的含有藥物的ngm培養(yǎng)基上。(一)不同濃度保元湯的體內(nèi)抗糞腸球菌感染作用同步化后的c.elegansss10425℃恒溫箱內(nèi)生長(zhǎng)到l4期時(shí)，用m液沖洗下c.elegansss104，收集在1.5ml離心管中，渦旋5s，1500rpm2min離心，重復(fù)操作兩次。將沖洗干凈的c.elegansss104接到涂布有e.faecalisog1rf固體bhi培養(yǎng)基上，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h之后，將被糞腸球菌感染的c.elegansss104挑至涂布有e.faecalisog1rf不含藥物的直徑35mm的bhi培養(yǎng)基(空白對(duì)照組)及各涂布有e.faecalisog1rf含有不同濃度藥物組合物的bhi培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組)上，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行35條c.elegansss104，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔24h進(jìn)行統(tǒng)計(jì)各對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組c.elegansss104的死活數(shù)，直到全部c.elegansss104死亡。圖1、2中10倍稀釋保元湯、20倍稀釋保元湯、40倍稀釋保元湯、80倍稀釋保元湯分別代表10倍稀釋的保元湯水煎液(生藥量為28g/l)，20倍稀釋的保元湯水煎液(生藥量為14g/l)，40倍稀釋的保元湯水煎液(生藥量為7g/l)，80倍稀釋的保元湯水煎液(生藥量為3.5g/l)?？瞻讓?duì)照組是無(wú)菌蒸餾水。圖1的縱坐標(biāo)表示感染狀態(tài)下不同濃度藥物處理的c.elegansss104的生存比例，在同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，此值越大，表明該處理組中存活的c.elegansss104數(shù)量越多，即藥物延長(zhǎng)糞腸球菌感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命的作用越強(qiáng)，由圖1可以看出，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，20倍稀釋的保元湯處理的c.elegansss104存活數(shù)都最大，且從圖2(圖中a、b、c、d表示各組之間的差異顯著性，相同標(biāo)記之間沒(méi)有顯著性差異)中的半數(shù)致死時(shí)間可以看出，20倍稀釋的保元湯與其它組別均具有極顯著的差異，說(shuō)明其在延長(zhǎng)糞腸球菌感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命有明顯作用，即說(shuō)明20倍稀釋的保元湯具有較好的體內(nèi)抗感染效果。(二)20倍稀釋的保元湯及其同倍稀釋的拆方藥物組合物的體內(nèi)抗糞腸球菌感染作用同步化后的c.elegansss10425℃恒溫箱內(nèi)生長(zhǎng)到l4期時(shí)，用m液沖洗下c.elegansss104，收集在1.5ml離心管中，渦旋5s，1500rpm2min離心，重復(fù)操作兩次。將沖洗干凈的c.elegansss104接到涂布有e.faecalisog1rf固體bhi培養(yǎng)基上，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h之后，將被e.faecalisog1rf感染秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的c.elegansss104挑至涂布有e.faecalisog1rf不含藥物的直徑35mm的bhi培養(yǎng)基(空白對(duì)照組)及各涂布有e.faecalisog1rf含有20倍稀釋的不同藥物的bhi培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組)上，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行35條c.elegansss104，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔24h進(jìn)行統(tǒng)計(jì)各對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組c.elegansss104的死活數(shù)，直到全部c.elegansss104死亡。圖3、4中20倍稀釋保元湯、配方1、配方2、配方3、配方4分別代表20倍稀釋的保元湯水煎液，20倍稀釋的藥物組合物(人參、生黃芪和炙甘草)水煎液(生藥量為12.5g/l)，20倍稀釋的藥物組合物(人參、生黃芪和肉桂)水煎液(生藥量為11.5g/l)，20倍稀釋的藥物組合物(人參、炙甘草和肉桂)水煎液(生藥量為6.5g/l)，20倍稀釋的藥物組合物(生黃芪、炙甘草和肉桂)水煎液(生藥量為11.5g/l)?？瞻讓?duì)照組代表無(wú)菌蒸餾水。圖3的縱坐標(biāo)表示感染狀態(tài)下20倍稀釋的不同藥物處理的c.elegansss104的生存比例，在同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，此值越大，表明該處理組中存活的c.elegansss104數(shù)量越多，即藥物延長(zhǎng)糞腸球菌感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命的作用越強(qiáng)，由圖3(圖中a、b、c表示各組之間的差異顯著性，相同標(biāo)記之間沒(méi)有顯著性差異)可以看出，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，20倍稀釋的保元湯處理的c.elegansss104存活數(shù)與配方1和配方2無(wú)顯著性差異，從圖4中的半數(shù)致死時(shí)間結(jié)果也同樣可以看出。說(shuō)明20倍稀釋的保元湯與配方1和配方2均具有很好的體內(nèi)抗感染效果。(三)20倍稀釋的藥物組合物(配方2)的體內(nèi)抗銅綠假單胞菌感染作用為了觀察藥物組合物除了能體內(nèi)抗革蘭氏陽(yáng)性菌糞腸球菌外，是否還能抗革蘭氏陰性菌，因此選擇銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)進(jìn)行了探究。同步化后的c.elegansss10425℃恒溫箱內(nèi)生長(zhǎng)到l4期時(shí)，用m液沖洗下c.elegansss104，收集在1.5ml離心管中，渦旋5s，1500rpm2min離心，重復(fù)操作兩次。將沖洗干凈的c.elegansss104接到涂布有p.aeruginosa固體改良ngm培養(yǎng)基上，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h之后，將感染好的c.elegansss104挑至涂布有p.aeruginosa不含藥物的直徑35mm的改良ngm培養(yǎng)基(空白對(duì)照組)及涂布有p.aeruginosa含有20倍稀釋的保元湯的改良ngm培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組)上，處理設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行35條c.elegansss104，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔24h進(jìn)行統(tǒng)計(jì)各對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組c.elegansss104的死活數(shù)，直到全部c.elegansss104死亡。圖5、6中配方2代表20倍稀釋的藥物組合物(人參、生黃芪和肉桂)水煎液。空白對(duì)照組代表無(wú)菌蒸餾水。圖5的縱坐標(biāo)表示感染狀態(tài)下藥物組合物配方2處理的c.elegansss104的生存比例，在同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，此值越大，表明該處理組中存活的c.elegansss104數(shù)量越多，即藥物延長(zhǎng)p.aeruginosa感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命的作用越強(qiáng)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，配方2處理的c.elegansss104存活數(shù)都比對(duì)照組的大，且從圖6(圖中a、b表示配方2組與空白對(duì)照組之間具有顯著性差異)的半數(shù)致死時(shí)間可以清晰地看出，配方2與對(duì)照組具有極顯著的差異，說(shuō)明配方2同樣也具有較好的體內(nèi)抗革蘭氏陰性菌感染的效果。(四)20倍稀釋的保元湯及同濃度配方1與配方2的毒副作用因?yàn)?0倍稀釋保元湯與配方1和配方2均具有很好的體內(nèi)抗感染效果，考慮到藥物可能存在毒副作用，影響正常機(jī)體。因此進(jìn)行了毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，以此來(lái)評(píng)價(jià)三者的毒副作用。同步化后的c.elegansn220℃恒溫箱內(nèi)生長(zhǎng)到l4期時(shí)，用m液沖洗下c.elegansn2，收集在1.5ml離心管中，渦旋5s，1500rpm2min離心，重復(fù)操作兩次。將沖洗干凈的c.elegansn2接到涂布有e.coliop50固體ngm培養(yǎng)基上，于20℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h之后，將c.elegansn2挑至涂布有e.coliop50不含藥物的直徑35mm的ngm培養(yǎng)基(空白對(duì)照組)及各涂布有e.coliop50含有20倍稀釋的不同藥物組合物的ngm培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組)上，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行35條c.elegansn2，于20℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔24h進(jìn)行統(tǒng)計(jì)各對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組c.elegansn2的死活數(shù)，直到全部c.elegansn2死亡。圖7、8中20倍稀釋保元湯、配方1、配方2分別代表20倍稀釋的保元湯水煎液，20倍稀釋的藥物組合物(人參、生黃芪和炙甘草)水煎液，20倍稀釋的藥物組合物(人參、生黃芪和肉桂)水煎液?？瞻讓?duì)照組代表無(wú)菌蒸餾水。圖5的縱坐標(biāo)表示20倍稀釋的不同藥物組合物處理的c.elegansn2的生存比例，在同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，此值越大，表明該處理組中存活的c.elegansn2數(shù)量越多，即藥物毒副作用越低。圖7顯示，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，配方2與20倍稀釋保元湯處理的c.elegansn2存活數(shù)之間無(wú)顯著性差異，同時(shí)從圖8(圖中a、b表示各組之間的差異顯著性，相同標(biāo)記之間沒(méi)有顯著性差異)的半數(shù)致死時(shí)間也可以清晰地看出，配方2與20倍稀釋保元湯之間無(wú)顯著差異。由于配方2在抗感染效果與毒副作用上與保元湯均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明可以通過(guò)對(duì)保元湯進(jìn)行減味，達(dá)到相同的體內(nèi)抗感染效果。本發(fā)明提供的藥物組合物(配方2，包含人參、生黃芪和肉桂)在體外無(wú)抑菌效果的濃度下，不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的感染有治療作用，對(duì)革蘭氏陰性菌的感染同樣有治療作用。說(shuō)明本發(fā)明所提供的藥物組合物具有很好的體內(nèi)抗感染效果。同時(shí)，本發(fā)明提供的藥物組合物與保元湯毒副作用無(wú)顯著性差異。綜上所述，本發(fā)明提供的藥物組合物可在制備治療感染疾病的藥物中應(yīng)用。當(dāng)前第1頁(yè)12