專利名稱：新的產(chǎn)黃青霉苯乙酰輔酶a連接酶基因及提高青霉素產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的分離的核苷酸序列，具體地說(shuō)涉及來(lái)自產(chǎn)黃青霉的新的苯乙酰輔酶A連接酶基因(pclB)。
本發(fā)明還涉及該基因編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及含有該基因的表達(dá)載體。
本發(fā)明還涉及一種提高產(chǎn)黃青霉的青霉素產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
以青霉素和頭孢菌素為代表的β-內(nèi)酰胺類抗生素作為最重要的抗菌藥物，占據(jù)了世界抗感染藥物市場(chǎng)的2/3，是目前已知的抗生素中毒性最低，品種最多，臨床應(yīng)用最廣的一類抗生素。
青霉素由絲狀真菌產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)生產(chǎn)，由于廣大的市場(chǎng)需求，人們對(duì)青霉素生產(chǎn)菌的改良投入了巨大的精力?；趥鹘y(tǒng)的誘變篩選技術(shù)，現(xiàn)在的工業(yè)生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)水平達(dá)到了相當(dāng)高的水平。而分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為我們揭示β-內(nèi)酰胺類抗生素的生物合成機(jī)制提供了幫助。
研究表明，青霉素的生物合成步驟由三個(gè)前體氨基酸，α-氨基己二酸、半胱氨酸、纈氨酸開(kāi)始，經(jīng)三肽合成酶(ACVS)催化縮合成LLD-ACV三肽，在異青霉素N合成酶作用下環(huán)化形成異青霉素N，最終在乙酰輔酶A6-氨基青霉烷酸?；D(zhuǎn)移酶(AAT)催化下側(cè)鏈交換得到青霉素。其中前2步反應(yīng)在細(xì)胞質(zhì)中完成，最后一步側(cè)鏈交換是在微體中完成的，催化該步反應(yīng)的AAT具有保守的微體定位信號(hào)序列ARL(Muller et al.EMBO J 10489-495，1991)，為其功能所必需，生物合成相關(guān)的三個(gè)關(guān)鍵酶的編碼基因都已克隆(Ingolia&Queener，Med.Res.Rev.9245-264，1989；Aharonowitz，etal.，Ann.Rev.Microbiol.46461-495，1992)。
在青霉素的工業(yè)生產(chǎn)中，苯乙酸(Phenylacetic acid，PA)被用來(lái)作為青霉素G的側(cè)鏈前體。在發(fā)酵過(guò)程中，苯乙酸首先被活化為輔酶A硫脂，再在AAT作用下經(jīng)轉(zhuǎn)?；饔?，替代異青霉素N的L-α-氨基己二酰側(cè)鏈，形成青霉素G。由于AAT具有較寬的底物范圍，因此在發(fā)酵過(guò)程中添加苯乙酸可以促進(jìn)青霉素G的生物合成。作為青霉素G的側(cè)鏈前體，其利用效率很大程度上取決于它的毒性以及青霉菌對(duì)其的氧化能力。苯乙酸在生產(chǎn)成本中占有相當(dāng)?shù)谋戎?，提高苯乙酸的利用效率是青霉素菌種改良過(guò)程中非常重要的內(nèi)容。
苯乙酸的活化由苯乙酰輔酶A連接酶完成。國(guó)際專利WO97/02349公開(kāi)了一個(gè)產(chǎn)黃青霉的苯乙酰連接酶及其編碼序列pclA。該酶由578個(gè)氨基酸組成，分子量約63kDa。其最后3個(gè)氨基酸為S-K-I，是保守的微體定位信號(hào)序列，為蛋白定位于微體所必需。這說(shuō)明該連接酶要定位在微體起作用。這與青霉素生物合成的最后一步側(cè)鏈交換是在微體中完成的研究結(jié)果一致。
另外，Minambres等從假單胞菌(Pseudomonas putida U)中克隆了一個(gè)苯乙酰輔酶A連接酶基因pcl，將其與三肽合成酶基因pcbAB的啟動(dòng)子融合轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉Wis54-1255，使青霉素產(chǎn)量提高了1.8～2.2倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供新的產(chǎn)黃青霉苯乙酰輔酶A連接酶基因，定名為pclB。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述基因編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供含有上述基因序列的表達(dá)載體。
本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供新的產(chǎn)黃青霉工程菌株和提高青霉素產(chǎn)量的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，新的產(chǎn)黃青霉苯乙酰輔酶A連接酶基因pclB是從產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)中鑒別、克隆的，該基因的表達(dá)明顯受到苯乙酸的誘導(dǎo)，其編碼的蛋白質(zhì)由562個(gè)氨基酸組成，推測(cè)的分子量為62.6kDa，最后3個(gè)氨基酸為微體定位信號(hào)序列A-K-L，表明該酶同樣定位于微體中。PclB與PclA氨基酸序列的一致性為35％。在187～198位是保守的AMP結(jié)合域-LVYSSGTTGvPK-(PROSITE database entry PS00455[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLIVM]-[KR])，其開(kāi)放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)為自5’端的第59到第1744位堿基，長(zhǎng)度為1686bp。具體地說(shuō)本發(fā)明提供了含有SEQID NO.1所示序列的分離的多核苷酸。
上述涉及的多核苷酸還包括取代、缺失、和插入變體以及等位變體、剪接變體、片段、衍生物等，其中可以通過(guò)取代、缺失、插入或衍生一個(gè)或多個(gè)核苷酸。優(yōu)選的這些多核苷酸是那些編碼具有生物學(xué)活性的苯乙酰輔酶A連接酶的多核苷酸。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，分離的多核苷酸包括苯乙酰輔酶A連接酶基因的全部編碼序列。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸包括如SEQ ID NO1的第59位～1744位核苷酸所示的序列。這種分離的多核苷酸包含1686個(gè)核苷酸的苯乙酰輔酶A連接酶的開(kāi)放閱讀框架，并且編碼562個(gè)氨基酸的多肽，如上所述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，上述的分離的多核苷酸也包括那些與SEQID NO.1所示序列或SEQ ID NO1的第59位～1744位核苷酸所示的序列具有較高同源性的序列，例如同源性大于90％、甚至95％、甚至98％的序列；還包括那些在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ ID NO.1所示序列或SEQ ID NO1的第59位～1744位核苷酸所示的序列雜交的序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供新的多肽序列，其含有上述核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，即含有SEQ ID NO.2所示的序列，表達(dá)的苯乙酰輔酶A連接酶的推測(cè)分子量為62.6kDa，最后3個(gè)氨基酸為微體定位信號(hào)序列A-K-L，表明該酶同樣定位于微體中。PclB與PclA氨基酸序列的一致性為35％。在187-198位是保守的AMP結(jié)合域-LVYSSGTTGvPK-(PROSITE databaseentry PS00455[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLIVM]-[KR])。
同樣地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，上述的多肽序列也包括取代、缺失及插入變體，以及其等位突變體、拼接變體、片段、衍生物或同系物。優(yōu)選的多肽或多肽片段包括那些具有苯乙酰輔酶A連接酶生物活性的多肽及片段。取代、缺失及插入變體是指與SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列相比，所述氨基酸序列中包含一處或多處氨基酸序列的取代、缺失和/或添加。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明亦提供包括一種或多種上述多核苷酸的重組載體，以及包含上述多核苷酸的載體的基因工程宿主細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種重組載體包括上述的多核苷酸，它編碼含SEQ ID NO2的多肽，其含SEQ ID NO1的序列所示的多核苷酸，或含SEQ ID NO1序列中59～1744的多核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，構(gòu)建了含本發(fā)明多核苷酸的原核表達(dá)載體。
本發(fā)明也涉及到包括任何一種上述重組載體的宿主細(xì)胞。在已經(jīng)構(gòu)建載體之后，可以插入全部或部分載體至適合的宿主細(xì)胞，以便擴(kuò)增和/或多肽表達(dá)。宿主細(xì)胞可以是原核生物宿主細(xì)胞(例如E.coli)或者真核生物宿主細(xì)胞(例如絲狀真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，或脊椎動(dòng)物細(xì)胞)。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了用基因工程手段構(gòu)建的新的產(chǎn)黃青霉工程菌菌株，使用含有本發(fā)明多核苷酸的產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉，篩選陽(yáng)性菌株后獲得本發(fā)明的產(chǎn)黃青霉工程菌菌株，與原始菌株相比，轉(zhuǎn)基因菌株的青霉素產(chǎn)量明顯提高，最高提高幅度超過(guò)了23％。
因此，本發(fā)明也提供了提高產(chǎn)黃青霉青霉素產(chǎn)量的方法，即構(gòu)建含有本發(fā)明多核苷酸的產(chǎn)黃青霉工程菌，將構(gòu)建的工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)獲得青霉素。
本發(fā)明從產(chǎn)黃青霉中成功地分離獲得了編碼新的產(chǎn)黃青霉苯乙酰輔酶A連接酶的基因，并證明了該基因的表達(dá)受苯乙酸的誘導(dǎo)，進(jìn)而構(gòu)建了含有本發(fā)明新基因的表達(dá)載體和產(chǎn)黃青霉工程菌菌株，該轉(zhuǎn)基因菌株的青霉素產(chǎn)量明顯提高，本發(fā)明對(duì)于青霉素的生產(chǎn)具有重要意義。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1為pclA基因與pclB基因序列比較圖；圖2為苯乙酸誘導(dǎo)的pclA基因和pclB基因的表達(dá)對(duì)照?qǐng)D，其中54-PAA為不添加苯乙酸Wis54-1255菌株RNA樣品，54+PAA為添加苯乙酸Wis54-1255菌株RNA樣品；圖3為重組pclB蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖，其中泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為含空載體的對(duì)照菌，3-10分別為誘導(dǎo)0小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)的菌體。
發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖，通過(guò)對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施例的描述，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
在下面使用的試劑材料如無(wú)特別說(shuō)明，均為市售購(gòu)買(mǎi)。
實(shí)施例1pclB基因克隆將產(chǎn)黃青霉菌Wis54-1255(ATCC28089)在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，過(guò)濾收菌絲，取0.1g濕菌絲液N2研磨，加1ml Trizol試劑(Invitrogen公司，15596-026)抽提產(chǎn)黃青霉總RNA，將所得產(chǎn)黃青霉總RNA溶解于DEPC水中，-70℃下保存?zhèn)溆谩?br> 為去除可能的DNA污染，取產(chǎn)黃青霉總RNA 5μg，在100μl反應(yīng)體系內(nèi)，加入5μl RQ1 RNase-Free DNase(Promega公司，M6101)，10μl RQ1 RNase-FreeDNase反應(yīng)緩沖液(10×)，37℃保溫30分，用酚氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于10μl DEPC水。取5μl去除DNA的RNA樣品，用隨機(jī)引物(RandomHexamers，Promega公司，C1181)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，所用反轉(zhuǎn)錄酶為SuperScriptTM II RNase H-(Invitrogen公司，18064-022)。
以T220-15’-TCCCTTTGAGCCTCTATTCACATTC-3’和T220-25’-TATCAATATCAACATGGACAGGTC-3’為引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94℃，5分；94℃1分，60℃1分，72℃2分-40循環(huán)；72℃7分；4℃保存。將RT-PCR產(chǎn)物按常規(guī)方法克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明RT-PCR產(chǎn)物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，長(zhǎng)度為1808bp。通過(guò)序列分析和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，表明該序列的開(kāi)放閱讀框架(OpenReading Frame，ORF)為自5’端的第59到第1744位堿基，長(zhǎng)度為1686bp。在ORF起始密碼子ATG前18bp處，同相位有終止密碼子TAG，由此說(shuō)明我們得到了該基因的全長(zhǎng)序列，定名為pclB。
該基因ORF片段的讀碼框編碼562個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為62.6kDa，如序列表中SEQ ID NO.2所示。最后3個(gè)氨基酸為微體定位信號(hào)序列A-K-L，表明該酶同樣定位于微體中。PclB與PclA氨基酸序列的一致性為35％。在187-198位是保守的AMP結(jié)合域-LVYSSGTTGvPK-(PROSITE database entry PS00455[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLIVM]-[KR])同時(shí)以提取的Wis54-1255菌株的基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物及反應(yīng)條件同上，得到1954bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其與RT-PCR產(chǎn)物序列比較，確認(rèn)pclB基因有2個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度分別為92bp、54bp。比較結(jié)果見(jiàn)圖1。
實(shí)施例2pclB基因的表達(dá)受苯乙酸的誘導(dǎo)將產(chǎn)黃青霉菌Wis54-1255(ATCC28089)按2×106分生孢子/ml接種到種子培養(yǎng)基，在26℃下培養(yǎng)24小時(shí)，種子培養(yǎng)基配方為(g/l)葡萄糖，30；乳糖，1O；棉籽餅粉，10；酵母粉，10；玉米漿，10；(NH4)2SO4，2；KH2PO4，1；CaCO3，5；pH5.8。然后將種子培養(yǎng)物以5％接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃下培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/l)乳糖，120；棉籽餅粉，30；玉米漿，20；(NH4)2SO4，5；KH2PO4，1；K2SO4，5；CaCO3，10；pH6.5。
實(shí)驗(yàn)分為2組，一組每天正常補(bǔ)加苯乙酸前體，另一組為對(duì)照，不加苯乙酸，72小時(shí)后收取菌體提取總RNA，提取及處理方法見(jiàn)實(shí)施例1。
用SYBR Green試劑作實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)pclB基因的表達(dá)，儀器為ABIPRISM 7000定量PCR儀。根據(jù)pclB基因的cDNA序列，利用Primer Express軟件設(shè)計(jì)定量PCR引物，TS2205′-GATGCTATTGATGATGTTGCTGTC-3′TA2205′-TGCTTCAGAATCCGACGTAGG-3′。以產(chǎn)黃青霉γ-actin基因(AF056975)為內(nèi)標(biāo)，act15′-CTCGCTGAGCGTGGTTACAC-3′，act25′-TTGATGTCACGGACGATTTCA-3′。同時(shí)做pclA的定量PCR對(duì)照，AS013CTGCCGATTTCCTCAAACTCTAC，AA013CTCCGTGCCTCCTTCTCTTG。引物由上海生工合成。定量PCR試劑為SYBRPremix Ex TagTM試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)。反應(yīng)條件為95℃，1分鐘；95℃，15秒，60℃，1分鐘，40循環(huán)。對(duì)定量PCR的結(jié)果CT值進(jìn)行換算，采用2-ΔΔCT法(Livak K.J.and T.D.Schmittgen Methods 25402-408，2001)。結(jié)果，苯乙酸能顯著誘導(dǎo)pclB基因的表達(dá)，以不添加苯乙酸的表達(dá)量為1，則添加苯乙酸時(shí)pclB的表達(dá)提高了4倍。而pclA提高的幅度將近8倍。結(jié)果見(jiàn)圖2。
實(shí)施例3pclB基因的原核表達(dá)原核表達(dá)載體pET-39b(+)購(gòu)自Novagen公司。
以產(chǎn)黃青霉Wis54-1255 cDNA為模版，引物T220a5’-CATATGCCCGTATCCTCTAACTACC-3’/T220b5’-CTCGAGCAGCTTGGCTTTTGGTGCC-3’，擴(kuò)增出pclB的編碼序列，兩端引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Nde I，Xho I，連接到用同樣酶切的載體pET-39b(+)，得到質(zhì)粒pET39/pclB。
將構(gòu)建好的質(zhì)粒pET39/pclB轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)-RP(Stratgene公司)，挑取陽(yáng)性克隆至LB培養(yǎng)基(酵母粉蛋白胨NaCl)37℃培養(yǎng)至OD6000.6，加入0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，37℃200rpm繼續(xù)培養(yǎng)，收集菌體，SDS-PAGE分析。
稱取菌體0.4g用16ml Buffer A(50mmol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mmol/LEDTA，50mmol/L NaCl，5％甘油)重懸，超聲破碎，10,000g4℃10min離心，分別取上清和沉淀，SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明重組表達(dá)的PclB絕大多數(shù)為包涵體的形式存在。
實(shí)施例4通過(guò)增加產(chǎn)黃青霉中pclB的基因表達(dá)提高青霉素的產(chǎn)量根據(jù)文獻(xiàn)(Carr et al.，1986，Gene 48257～266)，設(shè)計(jì)兩對(duì)合成引物Pip15′TCGCGGATCCTGTCCCTAGTGCTGGGCTTGAAGTATG3′/Pip25′TGGAAGCATATGTGTCTAGAAAAATAATGGTGAAAACT3′，和Tip15′ATGGTACCAAGGGCCCATGGATGGGACCGGGGAT3′/Tip35′TAAGCTTGAGAGCTCGTGCCGAATCTGCTTGGC3′以產(chǎn)黃青霉Wis54-1255(ATCC28089)菌株基因組DNA為模板，分別克隆了異青霉素N合成酶基因1.16kb的啟動(dòng)子序列Pipns(兩端分別引入BamH I和NdeI酶切位點(diǎn))，及640bp的終止子序列Tipns(兩端分別引入Kpn I和Hind III酶切位點(diǎn))。
以T220-a5’-CATATGCCCGTATCCTCTAACTACC-3’/T220-c5’-GGTACCCAGCTTGGCTTTTGGTGCC-3’重新擴(kuò)增出pclB的編碼序列，兩端酶切位點(diǎn)為Nde I/Kpn I。將此三段序列連接，得到可在產(chǎn)黃青霉中表達(dá)的pclB基因的表達(dá)盒ibt。
轉(zhuǎn)化載體的制備采用申請(qǐng)?zhí)枮?00410012139.4的中國(guó)發(fā)明專利所描述的方法制備，主要步驟如下將產(chǎn)黃青霉菌ATCC10003(X-1612)培養(yǎng)在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，菌絲過(guò)濾后，加液N2磨碎，用Easy-DNA kit(Invitrogen公司，K1800-01)提取得到產(chǎn)黃青霉基因組DNA。
根據(jù)文獻(xiàn)(Carr et al.，1986，Gene 48257～266)，以pip15’-TCGCGGATCCTGTCCCTAGTGCTGGGCTTGAAGTATG-3’pip25’-TGGAAGCCATGGTGTCTAGAAAAATAATGGTGAAAACT-3’為引物，以產(chǎn)黃青霉ATCC10003(x-1612)菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94℃，3分；94℃1分，60℃1分，72℃1.5分-40循環(huán)；72℃7分；4℃保存。將PCR產(chǎn)物采用常規(guī)方法克隆測(cè)序，結(jié)果表明克隆產(chǎn)物長(zhǎng)度為1168bp，和文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，只在589位由G變?yōu)锳，證明得到了Pipns序列。在克隆得到1.16kb的Pipns序列5’和3’端分別引入BamH I和NcoI酶切位點(diǎn)，然后用DNA連接酶與pGEM-T載體在16℃溫度下連接12小時(shí)，得到質(zhì)粒pGEM-T/Pipns。
酵母表達(dá)載體pPICZA和原核生物基因克隆載體pCR4Blunt-TOPO均購(gòu)自Invitrogen公司。
利用引物pk1 5’-TGAAGCTTGTCAGCTACTGGGCTATCAGGAC-3’pk2 5’-ACA GATCTAAAGTGCCACCTGTATGCGGTGTG-3’，以pCR4Blunt-TOPO質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到卡那霉素的抗性基因(kanr)，并在其5’端和3’端分別引入Hind III、Bgl II酶切位點(diǎn)。
pPICZA質(zhì)粒用Hind III/Bgl II雙酶切后回收2.46kb片段，與經(jīng)過(guò)同樣酶切的kanr片段在16℃溫度下連接12小時(shí)，然后采用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基中篩選同時(shí)具有卡那霉素和腐草霉素抗性的陽(yáng)性克隆，從中提取得到pPICZA/kan質(zhì)粒。
pPICZA/kan質(zhì)粒經(jīng)BamH I/Nco I部分消化，回收3.1kb片段。pGEM-T/Pipns同樣用BamH I/Nco I酶切，回收1.16kb小片段。將兩片段在16℃溫度下連接12小時(shí)，得到產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化載體，定名為pPIPKA。
將產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化載體pPIPKA用Hind III和BamH I酶切后，回收大片段，與ibt表達(dá)盒連接得到載體pPCLB。按上述方法將pPCLB轉(zhuǎn)化菌株Wis54-1255，篩選陽(yáng)性克隆用于青霉素產(chǎn)量檢測(cè)。檢測(cè)按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Brownlee et al，J GenMicrobiol，1949)進(jìn)行。對(duì)篩選到的高單位菌株利用搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)試，方法參照Lein(Overproduction of microbial metabolites，Z.Vanek and Z Hostalekeds，pp105-139)。通過(guò)89株菌的試驗(yàn)結(jié)果，與出發(fā)菌株相比，轉(zhuǎn)基因菌株的青霉素產(chǎn)量明顯提高，最高提高幅度超過(guò)了23％。
以上對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明做出各種改變和變形，只要未脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明權(quán)利要求所定義的范圍。
05P101404.ST25.txtSEQUENCE LISTING<110>華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司<120>新的產(chǎn)黃青霉苯乙酰輔酶A連接酶基因及提高青霉素產(chǎn)量的方法<130>05P101404<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1808<212>DNA<213>產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)<220>
<221>CDS<222>(59)..(1744)<223>開(kāi)放閱讀框架<400>1tccctttgag cctctattca cattcgcatt accggctcca tagctttgtt tcgccgca 58atg ccc gta tcc tct aac tac ccc ctg gtc gac arc cca gaa gtg gat106Met Pro Val Ser Ser Asn Tyr Pro Leu Val Asp Ile Pro Glu Val Asp1 5 10 15ctt tgg acc ttt cta ttt gag cgc aag gac aga gct tac cca gat gac154Leu Trp Thr Phe Leu Phe Glu Arg Lys Asp Arg Ala Tyr Pro Asp Asp20 25 30aag att atc tac caa gat ggc gat acc caa cgt cat tac aca tac aaa202Lys Ile Ile Tyr Gln Asp Ala Asp Thr Gln Arg His Tyr Thr Tyr Lys35 40 45tcg cta cgt gat gcc tcg cta gat ttc ggc aag ggc ctc aaa gcc ctg250Ser Leu Arg Asp Ala Ser Leu Asp Phe Gly Lys Gly Leu Lys Ala Leu50 55 60tat gag tgg cgc aag ggc gat gta ctg gcc ctc ttc acg cca aac agc298Tyr Glu Trp Arg Lys Gly Asp Val Leu Ala Leu Phe Thr Pro Asn Ser65 70 75 80atc gat aca ccc gtg gtg atg tgg ggc aca ctt tgg gcc ggc gga acc346Ile Asn Thr Pro Val Val Met Trp Gly Thr Leu Trp Ala Gly Gly Thr85 90 95atc tcg cct gca aac ccg ggt tac acg gtt gac gag ctg gcc ttc cag394Ile Ser Pro Ala Asn Pro Gly Tyr Thr Val Asp Glu Leu Ala Phe Gln100 105 110
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權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ IDNO1的第59位～1744位核苷酸所示的序列。
2.一種分離的多核苷酸，含有與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQID NO1的第59位～1744位核苷酸所示的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
3.由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的氨基酸序列，其具有SEQ ID NO.2所示的序列，編碼的蛋白具有苯乙酰輔酶A連接酶活性。
5.含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列的表達(dá)載體。
6.權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體為原核表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)黃青霉工程菌菌株，含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
9.一種提高產(chǎn)黃青霉青霉素產(chǎn)量的方法，包括下述步驟1)將權(quán)利要求1所述的多核苷酸可操作地連接于表達(dá)載體；2)以所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉菌獲得含有權(quán)利要求1所述多核苷酸的工程菌菌株；3)發(fā)酵培養(yǎng)所述工程菌菌株，分離純化獲得青霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的來(lái)自產(chǎn)黃青霉的新的苯乙酰輔酶A連接酶基因(pclB)、其氨基酸序列和表達(dá)載體，并證明了該基因的表達(dá)受苯乙酸的誘導(dǎo)，進(jìn)而構(gòu)建了含有本發(fā)明新基因的表達(dá)載體和產(chǎn)黃青霉工程菌菌株，該轉(zhuǎn)基因菌株的青霉素產(chǎn)量明顯提高，本發(fā)明對(duì)于青霉素的生產(chǎn)具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1978650SQ20051012615
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者王富強(qiáng), 劉靜, 戴夢(mèng), 任志紅, 韋春玲, 張佳, 趙穎, 代明偉, 賈茜, 賀建功 申請(qǐng)人:華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司