新的疏水蛋白釋放系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是包含與具有主要是疏水性質(zhì)的治療學(xué)和/或生物學(xué)活性蛋白質(zhì)聯(lián)合的特定透明質(zhì)酸酰胺的新釋放系統(tǒng)，用于隨時間推移的持續(xù)緩慢釋放，其提高了藥物功效和患者順從性。
【專利說明】新的疏水蛋白釋放系統(tǒng)
[0001] 本發(fā)明涉及包含與具有治療學(xué)和/或生物學(xué)活性的具有主要是疏水性質(zhì)的蛋白 質(zhì)聯(lián)合的特定透明質(zhì)酸酰胺的藥物組合物，用于制備持續(xù)緩慢的蛋白質(zhì)釋放系統(tǒng)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 通過將活（細(xì)菌）系統(tǒng)進(jìn)行工程化而獲得的第一個藥物是胰島素，其在1982年由 食品藥品管理局（FDA)批準(zhǔn)。以前從尸體中提取的人生長激素也很快進(jìn)行了工程化。在 1986年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第一個重組人疫苗，其對抗乙型肝炎。采用活系統(tǒng)作為生物反應(yīng)器進(jìn)行 藥物的工業(yè)化生產(chǎn)從此變得普及，并且現(xiàn)在是很多藥物的優(yōu)選合成方法，尤其是由于其相 對低的生產(chǎn)成本。
[0004] 通過生物工程技術(shù)生產(chǎn)了很多被設(shè)計(jì)用于治療（和非治療）用途的人蛋白質(zhì)，包 括紅細(xì)胞生成素（用于治療貧血）、白細(xì)胞介素2 (用于治療腎癌）、IL-IRadL-I受體拮抗 劑）、胰高血糖素、干擾素、人DNase酶、降鈣素和很多其它蛋白質(zhì)。
[0005] 所述藥物主要具有蛋白質(zhì)或多肽性質(zhì)，通常經(jīng)胃腸外施用，因?yàn)榭诜┯脤⒁?活性成分快速降解。但是，胃腸外施用可引起患者順從性的問題，因?yàn)樾枰貜?fù)施用以確保 治療效果。這些蛋白質(zhì)通常具有非常短的半衰期；例如，生長激素hGH(通過基因生產(chǎn)）需 要每天注射。因此，為了減少施用次數(shù)和增加患者順從性，已經(jīng)進(jìn)行了很多實(shí)驗(yàn)來開發(fā)具有 增加的半衰期的蛋白質(zhì)/藥物釋放系統(tǒng)。
[0006] 所述釋放系統(tǒng)必須保證藥物的活性得以維持，因此必須確保蛋白質(zhì)/藥物的三維 結(jié)構(gòu)保持完整；然而，在其制備期間可發(fā)生的應(yīng)激狀態(tài)如有機(jī)溶劑的存在和/溫度和PH的 變化可引起蛋白質(zhì)鏈的脫酰胺化或氧化，從而導(dǎo)致變性和治療活性的喪失。
[0007] 例如，已知PLGA(聚乳酸/乙醇酸）微球的使用是用于小肽的釋放系統(tǒng)，其具有優(yōu) 良的結(jié)果（Hutchinson F.G.，Biochem. Soc. Trans.，1985, 13:520-523);然而，將其用于配 制hGH釋放的貯庫制劑是不可能的，因?yàn)樵摰鞍踪|(zhì)的變性產(chǎn)生了炎性問題。
[0008] 對不具有毒性、但是所遞送活性成分的功效未改變的蛋白質(zhì)/藥物釋放系統(tǒng)所進(jìn) 行的持續(xù)尋找已經(jīng)指向了使用用于配制的天然聚合物，其（由于它們與活性成分的聯(lián)合） 可以改變與它們所聯(lián)合的藥物的動力學(xué)。
[0009] 透明質(zhì)酸（HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的交替殘基組成的雜多 糖。它是一種天然的直鏈聚合物，分子量范圍根據(jù)其獲得來源和所用的制備方法為50, 000 至 13xl06Da。
[0010] 它天然存在于細(xì)胞外凝膠中、存在于脊椎動物結(jié)締組織的基質(zhì)（其為其中的主要 組分之一）中以及存在于關(guān)節(jié)滑液、玻璃體液和臍帶中。
[0011] 因此，HA通過給很多組織如皮膚、腱、肌肉和軟骨的細(xì)胞提供機(jī)械支持而在活生物 體中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。
[0012] 由于其性質(zhì)，透明質(zhì)酸保護(hù)組織免受自由基損害、控制炎性過程和刺激血管生成， 并且已經(jīng)證明在創(chuàng)傷愈合的所有主要階段的調(diào)控中特別有效（EP1196179)。
[0013] 在與透明質(zhì)酸的簡單聯(lián)合或成鹽中，使用所述多糖作為多種藥物的載體是已知 的，因?yàn)槠渖锵嗳菪?、生物降解性、無免疫原性、粘度和水合性的特性使得其特別適于 用作局部和全身水平的藥物和分子釋放系統(tǒng)（EP197718、EP445255)。還已經(jīng)研究了所述 多糖用于特定蛋白質(zhì)的藥物遞送，所述蛋白質(zhì)例如有IL-IRa(US 6, 096, 728)、紅細(xì)胞生 成素（Hahn SK?等人，Int J Pharm. ,2006, 28, 322:44-51)、胰島素（Nomura M?等人，J Pharm Pharmacol, 1994, 46:768-770)、生長激素（Kim SJ?等人，Journal of Controlled Release, 2005, 104:323-335)、干擾素和促卵泡激素（US8, 025, 900)。
[0014] 在所有這些情況中，藥物與所述多糖的聯(lián)合已經(jīng)導(dǎo)致了所載蛋白質(zhì)的"緩慢"釋 放，但是不足以緩慢到減少藥物施用次數(shù)。
[0015] HA是完全天然的多糖，其被體內(nèi)存在的酶（透明質(zhì)酸酶）迅速降解，相對迅速地 釋放出所聯(lián)合的藥物。由于這些原因，已經(jīng)對HA的羧基和羥基進(jìn)行了化學(xué)修飾以產(chǎn)生交 聯(lián)衍生物（US 4, 582, 865、US 4, 713, 448、US 5, 676, 964、US 4, 957, 74、US 5,827,937)或 者用其它天然或合成聚合物或用具有不同大小和物理化學(xué)特性的分子進(jìn)行了衍生化（US 4, 851，521);然而，所述衍生物的制備方法往往損害所輸送藥理學(xué)物質(zhì)的完整性。
[0016] 發(fā)明描述
[0017] 本發(fā)明的目的是包含與具有主要是疏水性質(zhì)的治療學(xué)和/或生物學(xué)活性蛋白質(zhì) 聯(lián)合的特定透明質(zhì)酸酰胺的新的釋放系統(tǒng)，用于隨時間推移持續(xù)緩慢釋放，其提高了藥物 功效和患者順從性。
[0018] 下文列出了本發(fā)明的具有主要是疏水性質(zhì)的治療學(xué)和/或生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的 一些實(shí)例：
[0019] 胰島素 是具有合成代謝性質(zhì)的蛋白質(zhì)激素，由胰腺內(nèi)的胰島P細(xì)胞產(chǎn)生；它由兩 條通過兩個硫橋連接的鏈組成。其最知名的功能是調(diào)控血糖水平。因此，該蛋白質(zhì)用于治 療產(chǎn)生非常少胰島素或不產(chǎn)生胰島素的1型或2型糖尿病。該激素通過皮下注射施用（因 為如果將其直接注射到血流中，則藥物吸收過快，可能導(dǎo)致低血糖）。該治療方法基于由患 者進(jìn)行的血糖測試的不同每日次數(shù)，隨后施用校準(zhǔn)劑量（3個或更多）的胰島素。
[0020] 牛長激素（GH)是垂體前葉的肽激素，由191個氨基酸組成，分子量為22, 005Da。 其主要功能是通過促進(jìn)幾乎所有身體組織的細(xì)胞的生長和有絲分裂來刺激人體（和很多 其它脊椎動物的身體）發(fā)育（特別是其促進(jìn)骨、軟骨和結(jié)締組織的生長）。
[0021] 在嬰幼期，GH分泌不足引起垂體性侏儒癥，而分泌過多則引起垂體性巨人癥。如 果分泌過多是在生長結(jié)束后開始（通常是由于腫瘤），則出現(xiàn)肢端肥大癥，其中面部、手和 足的骨頭相當(dāng)大程度地增大。
[0022] 因此，其被用于仍處于生長階段的患者和患有垂體腫瘤的成人。
[0023] GH還用于治療不是由GH缺乏引起的障礙，例如特納綜合征、慢性腎臟疾病、 ISS(特發(fā)性身材矮小癥）和多發(fā)性硬化，以及用于增加肥胖患者的體重減輕，用于纖維肌 痛、節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎。
[0024] 在骨關(guān)節(jié)炎（OA)的治療中，對hGH關(guān)節(jié)內(nèi)施用進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)獲得了極好的結(jié)果， 這也證明了所述激素在修復(fù)由OA造成的軟骨損傷中的功效（EP1153607 ;Kim SB等人，J Korean Med Sci. ,2010, 25:776-80)。
[0025] 降鈣素（CT)是一種由32-氨基酸多肽組成的激素，其在人中由甲狀腺濾泡旁細(xì)胞 (也稱為C細(xì)胞）產(chǎn)生。降鈣素的主要功能是通過抵消甲狀旁腺激素甲狀旁腺素的作用而 降低血液中的鈣濃度。已經(jīng)在魚、爬行動物、鳥和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了這種鈣調(diào)節(jié)機(jī)制。降鈣 素激素也在腎臟水平發(fā)揮作用，刺激腎小管消除鈣。sCT(鮭魚CT)通常被用于治療骨質(zhì)疏 松癥、高鈣血癥、骨轉(zhuǎn)移和佩吉特病。
[0026] 同樣，最新實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已經(jīng)證實(shí)了降鈣素在骨關(guān)節(jié)炎治療中的有效性：已經(jīng)證明它 的施用保護(hù)關(guān)節(jié)面免于OA引起的侵蝕（Manicourt DH等人，J Musculoskelet Neuronal Interact, 2005, 5(3):285-293)。
[0027] ILl-Ra是細(xì)胞因子IL_1的受體拮抗劑，細(xì)胞因子IL_1是局部和全身炎性過程的 強(qiáng)誘導(dǎo)劑。IL-I主要由B和T淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞在細(xì)菌刺激或其它細(xì)胞因子刺激后產(chǎn) 生；它也由肺泡巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、破骨細(xì)胞、滑膜 細(xì)胞和很多其它細(xì)胞類型分泌。IL-I尤其牽涉在嚴(yán)重障礙如銀屑病和敗血癥性休克中以及 牽涉在某些類型腫瘤的發(fā)病機(jī)制中。IL-I與其它細(xì)胞因子組合地代表了炎性過程的主要介 質(zhì)之一，因此牽涉在多種障礙如骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān) 節(jié)炎（OA)中：實(shí)際上，已經(jīng)在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或骨關(guān)節(jié)炎的患者的滑液中發(fā)現(xiàn)了 大量IL_l〇
[0028] IL-I的表達(dá)對于OA的發(fā)病機(jī)制是關(guān)鍵的，因?yàn)镮L-I促進(jìn)金屬蛋白酶（MMP)的合 成、分泌和活化，所述MMP是由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白酶，其負(fù)責(zé)軟骨基質(zhì)的降解。
[0029] 所有有關(guān)OA過程的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均有力地支持如下概念：IL_1和TNFa代表了參與 關(guān)節(jié)組織破壞的主要代謝系統(tǒng)；實(shí)際上，已經(jīng)證明，通過阻斷IL-I的產(chǎn)生和/或活化能夠阻 止和 / 或減少關(guān)節(jié)基質(zhì)的破壞（Caron J. P?等人，Arthritis Rheum, 1996, 39:1535-1544)。
[0030] 目前，含有受體拮抗劑IL-IRa的新藥物用于抵消這種細(xì)胞因子的影響， 因?yàn)橐呀?jīng)證明阻斷該受體是治療其中牽涉IL-I的障礙的有效方法（Burger D.等 人，Cytokine Reference, Oppenheim JJ 和 Feldmann M,編輯，紐約，倫敦，Academic Press，2000，p. 31-336; Jiang Y?等人，Arthritis Rheum, 2000, 43 (5): 1001-9)。
[0031] IL-IRa是作為所述白細(xì)胞介素的抑制劑的蛋白質(zhì)；然而，含有IL-IRa的藥物（如 基于阿那白滯素的JBlMref魏阿那白滯素是人蛋白質(zhì)IL-IRa的重組非糖基化形式）具有 非常短的半衰期，這往往損害臨床結(jié)果。因此，重要的是，配制含有IL-IRa的新藥物組合物 以便以持續(xù)緩慢的方式遞送藥物，保證了較長的半衰期，以確保加強(qiáng)的臨床結(jié)果。
[0032] 粒細(xì)朐集落刺激閔子（G-CSF)是174-180個氨基酸糖蛋白，其刺激骨髓產(chǎn)生粒細(xì) 胞和干細(xì)胞，所述粒細(xì)胞和干細(xì)胞隨后釋放至血液中。已經(jīng)證明這種生長因子具有神經(jīng)營 養(yǎng)蛋白活性，因此目前正被研究用于治療大腦局部缺血和肌萎縮性側(cè)索硬化癥。它通常用 于腫瘤患者，以消解與化療相關(guān)的中性白細(xì)胞減少癥；最后，最近實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明，G-CSF 靜脈治療促進(jìn)了受損心臟細(xì)胞的再生。
[0033] 血小板衍牛牛長閔子（PDGF)是一種由二聚物鉬成的牛物活件蛋白質(zhì)，所沭二聚 物由兩個通過二硫橋連接的多肽（稱為A和B)組成。其主要在巨核細(xì)胞中合成，在人中代 表了間充質(zhì)來源的細(xì)胞的主要血清有絲分裂劑。它被用于促進(jìn)創(chuàng)傷/潰瘍的愈合，因?yàn)樗?是基質(zhì)結(jié)締組織形成的介質(zhì)，由于所有這些原因，其目前還被用于促進(jìn)新骨組織的形成。
[0034] 轉(zhuǎn)化牛長閔子3 (TGF-P)是一種在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和在組織再生、細(xì)胞分化和胚 胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用的肽。其主要用作創(chuàng)傷愈合劑，因?yàn)樗鰪?qiáng)皮膚創(chuàng)傷/潰瘍的愈合 和促進(jìn)骨折的閉合；出于這些原因，其也用于治療骨質(zhì)疏松癥和0A。最后，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明： 在心臟缺血損傷后，TGFP還具有心臟保護(hù)性質(zhì)。
[0035] 表皮牛長因子（EGF)是在調(diào)節(jié)牛長以及在細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用的生 長因子。人EGF是6045道爾頓的蛋白質(zhì)，由53個氨基酸殘基和三個分子內(nèi)二硫橋組成。它 發(fā)現(xiàn)于血小板、巨噬細(xì)胞、尿液、唾液、乳汁和血漿中。
[0036] 其為用作胃保護(hù)劑的蛋白質(zhì)，因?yàn)樗碳の改c粘膜細(xì)胞的增殖；其用于促進(jìn)皮膚 組織再生，因?yàn)槠湓谄つw、靜脈和其它類型的創(chuàng)傷/潰瘍的處理中刺激新肉芽組織的形成。 最后，EGF的局部應(yīng)用已經(jīng)在受損角膜組織的再生中得到了極好的結(jié)果，例如在角膜手術(shù)后 或在退行性疾病如角膜炎的情況下。
[0037] 血管內(nèi)皮牛長閔子（VEGF-B)是參與血管生成（即胚胎期循環(huán)系統(tǒng)的從頭發(fā)生）、 神經(jīng)發(fā)生和血管形成的蛋白質(zhì)生長因子。它也是一種保護(hù)神經(jīng)元免受NMDA介導(dǎo)的缺血性 損傷的神經(jīng)保護(hù)劑。
[0038] 紅細(xì)胞牛成素（EPO)是在人中由腎臟以及在較小稈度上由肝和腦產(chǎn)牛的一種糖 蛋白激素，其主要功能是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成（由骨髓生產(chǎn)血紅細(xì)胞）。
[0039] 也已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生了 EP0,并用作藥物以治療罹患腎臟疾病或血液疾病的患 者的貧血或用于在給癌癥患者施用化療后加速恢復(fù)。在最近的研究中，已經(jīng)觀察到EPO作 為抗炎劑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
[0040] 紅細(xì)胞生成素是一種分子量為約30000D的糖蛋白分子。最后，自1989年以來， EPO已經(jīng)可作為藥物獲得，用于進(jìn)行透析的貧血患者。隨后，其應(yīng)用也擴(kuò)展到接受保守治療 的慢性腎功能衰竭患者，幫助改善他們的生活質(zhì)量。通過重組DNA方法進(jìn)行紅細(xì)胞生成素 的藥物生產(chǎn)。
[0041] 神經(jīng)牛長因子（NGF)是下丘腦中由甲狀腺和垂體分泌的蛋白質(zhì);它也由平滑肌細(xì) 胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。其活性形式是26KDa的NGFP，NGFP是具有兩個二硫橋連接兩個 118-氨基酸蛋白質(zhì)鏈的同二聚體。其負(fù)責(zé)外周NS神經(jīng)元和CNS膽堿能神經(jīng)元的分化和功 能。因此，其用于治療神經(jīng)變性疾病如癡呆；還已經(jīng)證明NGF可用于治療青光眼。
[0042] 轉(zhuǎn)鐵蛋白是血流中的主要鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白由肝和單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞系統(tǒng) 合成，其以非常穩(wěn)定但可逆的方式結(jié)合在腸水平吸收的和源自紅血細(xì)胞降解的鐵，將其攜 帶至使用部位（特別是骨髓）和儲存部位（特別是肝臟）。
[0043] 從結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)來看，它是由分子量為約80KD的679-氨基酸多肽鏈形成的糖蛋白， 具有兩個對亞鐵離子（Fe2+)沒有親合力的鐵離子（Fe3+)結(jié)合位點(diǎn)；其半衰期為約8天。
[0044] 轉(zhuǎn)鐵蛋白主要由肝臟合成，其在血液中的參考值為200_360mg/dL。轉(zhuǎn)鐵蛋白水平 在使用避孕藥期間、妊娠期間、鐵缺乏事件中增加。相反地，它們在腎病綜合征、肝臟疾病、 營養(yǎng)不良、慢性炎性疾病、腫瘤以及鐵或可的松治療的情況中下降。生理性減少可發(fā)生于新 生兒或老年。
[0045] IIIE是抑制金屬蛋白酶（即參與軟骨基質(zhì)降解的酶）的蛋白質(zhì)；TMP家族包括由 軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞及其它 細(xì)胞生產(chǎn)的TMP-2、HMP-3和TMP-4形式。
[0046] 因此，它們對軟骨細(xì)胞和OA引起的軟骨侵蝕發(fā)揮了保護(hù)作用。
[0047] 發(fā)明詳述
[0048] 本發(fā)明涉及包含與具有治療學(xué)和/或生物學(xué)活性的具有主要是疏水性質(zhì)的蛋白 質(zhì)聯(lián)合的特定透明質(zhì)酸酰胺的新藥物組合物，用于制備持續(xù)緩慢的蛋白質(zhì)釋放系統(tǒng)。
[0049] 本發(fā)明的系統(tǒng)導(dǎo)致了 ：
[0050] ?所述蛋白質(zhì)的持續(xù)釋放，持續(xù)很長時間（與"原樣"施用的相同蛋白質(zhì)相比）。 這種連續(xù)釋放增加了藥物的治療窗，因?yàn)榫o接施用后的時間不會（如在施用"原樣"藥物的 情況下通常的那樣）大量釋放所述蛋白質(zhì)。作為與特定HA酰胺聯(lián)合的釋放系統(tǒng)的施用調(diào) 節(jié)了藥物的釋放量（相對于時間）和釋放期（因此獲得了蛋白質(zhì)釋放量隨時間推移逐漸增 力口，導(dǎo)致最終釋放期超過當(dāng)其"原樣"施用時的釋放期）；總之，蛋白質(zhì)的動力學(xué)釋放曲線被 顯著改變，如同其治療功效特征那樣。
[0051] ?新的釋放系統(tǒng)是無毒的，因?yàn)樗巧锵嗳莸暮蜕锟山到獾?，并且其決定了所 載蛋白質(zhì)/藥物的緩慢釋放，保證了治療活性得以維持；活性成分的三維結(jié)構(gòu)未經(jīng)過任何 變性，因此其完整性得以確保。
[0052] ?本發(fā)明的釋放系統(tǒng)未導(dǎo)致所載蛋白質(zhì)發(fā)生任何化學(xué)改變，因?yàn)樗峭ㄟ^特定HA 酰胺與所載蛋白質(zhì)的聯(lián)合而形成的，所述蛋白質(zhì)與特定HA酰胺合并/混合。因此，在載體 和藥物之間沒有建立共價(jià)化學(xué)鍵，由此保證了蛋白質(zhì)/藥物的結(jié)構(gòu)完整性。
[0053] ?這些新特征極大地提高了患者順從性，因?yàn)樗幬锟梢愿鶕?jù)新的藥代動力學(xué)和因 此以不同劑量進(jìn)行施用：施用之間的時間間隔更長，并且改變了藥物的施用量，從而導(dǎo)致功 效更強(qiáng)和副作用更少。
[0054] 形成本發(fā)明的目標(biāo)的藥理學(xué)和/或生物學(xué)活性蛋白質(zhì)必須具有根據(jù)GRAVY(平均 親水性）指數(shù)測定主要是疏水的特性；肽或蛋白質(zhì)的GRAVY值計(jì)算為蛋白質(zhì)中存在的所 有氨基酸的親水值總和除以蛋白質(zhì)序列中它們的殘基數(shù)目。每個氨基酸具有給定的親水 指數(shù)，其范圍是從異亮氨酸（具有由芳香烴基團(tuán)形成的殘基的氨基酸，該芳香烴基團(tuán)賦予 分子明確的非極性并因此是疏水性的）的4. 5至精氨酸（具有帶正電荷殘基的氨基酸） 的-4. 5 (Kyte J.等人，J. Mol. Biol. ,1982, 157:105-132)。該標(biāo)尺表明，所分析氨基酸的 親水指數(shù)越高，則其疏水性就越強(qiáng)（圖1)。為了容易地確定所分析蛋白質(zhì)的GRAVY值，通 常使用 ProtParam(Gasteiger E.等人，Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, JM Walker 編輯，The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press，2005, 571-607)程序，其通過分析所研究蛋白質(zhì)的序列提供了它們的各種理化性質(zhì)； 當(dāng)輸入所述氨基酸序列后，程序?qū)⒂?jì)算其疏水性程度待測量的蛋白質(zhì)的GRAVY值。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明，"具有主要是疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)"指具有不低于-0. 5至正值的GRAVY 指數(shù)的那些蛋白質(zhì)：同樣，所分析蛋白質(zhì)的GRAVY指數(shù)越高，則其疏水性越強(qiáng)。
[0056] 下文列出了本發(fā)明涉及的具有主要是疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)的一些實(shí)例：
[0057] ?胰島素：GRAVY 指數(shù)=0? 2
[0058] ?人生長激素，hGF =GRAVY 指數(shù)=-0. 3
[0059] ?降鈣素，sCT (鮭魚 CT) :GRAVY 指數(shù)=-0? 5
[0060] ? IL-I，IL-IRa 受體拮抗劑：GRAVY 指數(shù)=-0? 4
[0061] ?粒細(xì)胞集落刺激因子，G-CSF =GRAVY指數(shù)=0. 2
[0062] ?血小板衍生生長因子，PDGF :GRAVY指數(shù)=-0. 5, PDGF-BB = -0. 1是優(yōu)選的
[0063] ?轉(zhuǎn)化生長因子TGF- @ :GRAVY指數(shù)=-0? 3
[0064] ?表皮生長因子，EGF :GRAVY指數(shù)=-0? 5
[0065] ?血管內(nèi)皮生長因子B，VEGF-B :GRAVY指數(shù)=-0? 2
[0066] ?紅細(xì)胞生成素（人）或EPO :GRAVY指數(shù)=-0? 03
[0067] ?神經(jīng)生長因子或NGF P :GRAVY指數(shù)=-0. 3
[0068] ?轉(zhuǎn)鐵蛋白（人）：GRAVY指數(shù)=-0? 2
[0069] ?金屬蛋白酶-2 (人）組織抑制劑，TMP-2 :GRAVY指數(shù)=-0? 2
[0070] ?金屬蛋白酶_3 (人）組織抑制劑，TMP-3 :GRAVY指數(shù)=-0? 3
[0071] ?金屬蛋白酶_4(人）組織抑制劑，TMP-4 :GRAVY指數(shù)=-0? 18。
[0072] 本 申請人:已經(jīng)證明下文列出的形成本發(fā)明目的的透明質(zhì)酸酰胺形成了這樣的釋 放系統(tǒng)：該釋放系統(tǒng)決定了包含在其中的疏水性蛋白質(zhì)的持續(xù)緩慢釋放，而與相同酰胺聯(lián) 合的具有主要是親水性質(zhì)的蛋白質(zhì)不形成適于隨時間推移持續(xù)緩慢釋放它們的釋放系統(tǒng)。
[0073] 形成本發(fā)明目的的適于形成所述釋放系統(tǒng)的HA酰胺有：
[0074] ? HA十六烷基酰胺：具有十六烷基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比（通過IH-NMR 測定）為7%至14%、優(yōu)選8%至9% ;
[0075] ? HA辛基酰胺：具有辛胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比(通過IH-NMR測定）為 10%至 15%、優(yōu)選 10%至 11% ;
[0076] ? HA十二烷某酰胺：具有十二烷某胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比（通過IH-NMR 測定）為10%至15%、優(yōu)選10%至11% ;
[0077] ? HA叔丁基酰胺：具有叔丁基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比(通過IH-NMR測 定）為7%至12%、優(yōu)選7%至8% ;
[0078] ? HA芐基酰胺:具有芐胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比（通過IH-NMR測定）為 7%至15%、優(yōu)選8%至9%。
[0079] 本發(fā)明中用于制備所述酰胺的HA可以從任意來源獲得，例如從雞冠花 (cockscombs)提?。‥P138572)或發(fā)酵（例如來自馬鏈球菌（Streptococcus equi)，如 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣）或者通過工藝方法（例如來自芽孢桿菌屬（Bacillus)， W02012/032154)，具有 400 至 3xl06Da、優(yōu)選 50 至 730KDa、750 至 1230KDa 或 1500 至 2500Kda、甚至更優(yōu)選150至250KDa和/或500至730KDa的重均分子量（通過有限粘度值 測定：Terbo jevich 等人，Carbohydrate Research, 1986, 149:363-377 方法）。
[0080] 具有150至250KDa或500至730KDa的重均分子量的HA十六烷基酰胺是優(yōu)選的。
[0081] 形成本發(fā)明目的的上文所列的HA酰胺可以如EP1095064中所述制備，EP1095064 還描述了其不同的用途，包括形成用于藥理活性物質(zhì)的釋放系統(tǒng)，但是對所用藥物的化學(xué) 類型和所選的酰胺類型沒有做出任何區(qū)分，并且最重要的是沒有描述所獲得的效果。然而， 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：與具有治療學(xué)和/或生物學(xué)活性的具有主要是疏水性質(zhì)（和因此超過-0. 5 的GRAVY指數(shù)）的蛋白質(zhì)聯(lián)合的、具有特定酰胺化百分比和所選麗范圍的特定HA酰胺如 十六烷基酰胺、辛基酰胺、十二烷基酰胺、叔丁基酰胺和芐基酰胺可用于制備用于所述蛋白 質(zhì)的新的持續(xù)緩慢釋放系統(tǒng)。
[0082] 以下蛋白質(zhì)是優(yōu)選的：
[0083] ?胰島素
[0084] ? hGH
[0085] ? sCT
[0086] ? IL-IRa
[0087] ? G-CSF
[0088] ? PDGF，優(yōu)選 PDGF-BB
[0089] ? TGF- 3
[0090] ? EGF
[0091] ? VEGF-B
[0092] ? EPO
[0093] ? NGF 旦
[0094] ?轉(zhuǎn)鐵蛋白
[0095] .Hmpumpump-L
[0096] 所述蛋白質(zhì)可通過重組DNA技術(shù)或通過從組織中提取而制備。
[0097] 本發(fā)明的另一目的是新的釋放系統(tǒng)，其包含：
[0098] I. HA十六烷基酰胺、辛基酰胺、十二烷基酰胺、叔丁基酰胺或芐基酰胺，與如下聯(lián) 合：
[0099] 2?胰島素、hGH、sCT、IL-IRa、G-CSF、PDGF、優(yōu)選 PDGF-BB、TGF- P、EGF、VEGF-B、 EPO、NGFP、轉(zhuǎn)鐵蛋白、TMP-2、TMP-3和TMP-4,可能與穩(wěn)定劑（當(dāng)需要時）和賦形劑聯(lián) 合。
[0100] 特別地，本發(fā)明的目的是包含如下的系統(tǒng)：
[0101] I. HA十六烷基酰胺，優(yōu)選具有150至250KDa或500至730KDa的重均分子量的HA 十六烷基酰胺；
[0102] 2.hGH 或 sCT，
[0103] 3.可能與穩(wěn)定劑和賦形劑聯(lián)合。
[0104] 該新系統(tǒng)可用于持續(xù)緩慢地釋放它們所含的活性劑，因?yàn)樗鼈兏淖兞伺c它們聯(lián)合 的蛋白質(zhì)/藥物的治療窗：因此，不同的劑量方案是可能的，導(dǎo)致了較好的患者順從性。
[0105] 存在于釋放系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)將決定系統(tǒng)的用途。例如，包含HA十六烷基酰胺與 hGH或sCT的釋放系統(tǒng)將優(yōu)選通過關(guān)節(jié)內(nèi)施用來治療0A、類風(fēng)濕性和銀屑病關(guān)節(jié)炎以及骨 質(zhì)疏松癥。
[0106] 本 申請人:已經(jīng)證明：這種新釋放系統(tǒng)決定了 hGF在所治療關(guān)節(jié)的滑液中持續(xù)釋 放，產(chǎn)生了更好的治療效果，但是沒有允許活性劑進(jìn)入血漿中（由此降低其在關(guān)節(jié)中的濃 度），因而預(yù)防了藥物的全身副作用。
[0107] 本發(fā)明的目的還有包含如下的系統(tǒng)：
[0108] ?如前文所列和所述的一種或多種HA酰胺，以及胰島素；本 申請人:將這種新系統(tǒng) 描述為緩慢釋放胰島素的新貯庫制劑，其用于治療需要較低藥物施用的糖尿病。
[0109] 本發(fā)明的目的還有包含如下的系統(tǒng)：
[0110] ?如前文所列和所述的一種或多種HA酰胺，優(yōu)選十六烷基酰胺，與蛋白質(zhì)如 I3DGF(優(yōu)選TOGF-BB)、TGF-P、EGF或VEGF-B聯(lián)合，用于注射、關(guān)節(jié)內(nèi)或局部應(yīng)用或用于口 服施用。
[0111] 上述蛋白質(zhì)因子（PDGF、TGF-0、EGF和VEGF-B)是已知其存在的生長因子，特別集 中于人的富血小板血漿（PRP)中。含有它們的新釋放系統(tǒng)將優(yōu)選可用于治療由OA導(dǎo)致的 關(guān)節(jié)損傷、腱炎中和用于修復(fù)心肌損傷、修復(fù)骨撕裂傷/骨折/空腔以促進(jìn)新骨組織形成和 最后可用于皮膚潰瘍/創(chuàng)傷/撕裂傷愈合以促進(jìn)新結(jié)締組織形成。
[0112] 本發(fā)明的目的還有包含如下的系統(tǒng)：
[0113] ?如前文所列和所述的一種或多種HA酰胺，優(yōu)選十六烷基酰胺，與金屬蛋白酶抑 制劑TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4聯(lián)合，用于注射應(yīng)用、優(yōu)選關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用。
[0114] 新釋放系統(tǒng)將優(yōu)選可用于治療由OA引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷和修復(fù)骨軟骨侵蝕。
[0115] 下文描述了新釋放系統(tǒng)的制備實(shí)施例和 申請人:所進(jìn)行的用于證明本發(fā)明的所述 系統(tǒng)的功效的實(shí)驗(yàn)。
[0116] 實(shí)施例1 :重詢MW為500至730kDa的HA十六烷某酰胺衍牛物Hvadd4的合成，具 有8%至9%的靡爾酰胺化百分比
[0117] 將5. OOg發(fā)酵來源的具有500至730KDa麗的透明質(zhì)酸鈉鹽溶于250ml水中，將 所得溶液通過玻璃柱滲濾，所述玻璃柱預(yù)填裝有IOOml四丁基銨形式的Dowex樹脂。洗脫 TBA鹽形式的HA溶液，收集并冷凍干燥。
[0118] 將2g如此獲得的產(chǎn)物溶于200ml二甲亞砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 53mgl，1' -羰二咪唑，將混合物在緩慢攪拌下于室溫放置1小時。然后加入998mg十六烷 基胺，于42°C進(jìn)行酰胺化反應(yīng)24小時。
[0119] 加入5ml飽和NaCl水溶液停止該反應(yīng)，30分鐘后加入1. 5倍體積的無水乙醇以分 離所得衍生物。將沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在無水乙醇中洗滌，然后在高真空 下于40°C干燥。
[0120] 得到I. 3g衍生物，通過IH-NMR測定了其酰胺化程度。
[0121] 實(shí)施例2 :重詢MW為500至730kDa的HA辛某酰胺衍牛物Hvadd2的合成，具有 10%至11 %的靡爾酰胺化百分比
[0122] 將5. OOg發(fā)酵來源的具有500至730KDa MW的透明質(zhì)酸鈉鹽溶于250ml水中，將 所得溶液通過玻璃柱滲濾，所述玻璃柱預(yù)填裝有IOOml四丁基銨形式的Dowex樹脂。洗脫 TBA鹽形式的HA溶液，收集并冷凍干燥。
[0123] 將2g如此獲得的產(chǎn)物溶于200ml二甲亞砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 61. 4mgl，1'-羰二咪唑，將混合物在緩慢攪拌下于室溫放置1小時。然后加入330mg辛胺， 于42°C進(jìn)行酰胺化反應(yīng)24小時。
[0124] 加入5ml飽和NaCl水溶液停止該反應(yīng)，30分鐘后加入1. 5倍體積的無水乙醇以分 離所得衍生物。將沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在無水乙醇中洗滌，然后在高真空 下于40°C干燥。
[0125] 得到I. 2g衍生物，通過IH-NMR測定了其酰胺化程度。
[0126] 實(shí)施例3 :重詢MW為500至730kDa的HA十二烷某酰胺衍牛物Hvadd3的合成，具 有10%至11 %的靡爾酰胺化百分比
[0127] 將5. OOg發(fā)酵來源的具有500至730KDa MW的透明質(zhì)酸鈉鹽溶于250ml水中，將 所得溶液通過玻璃柱滲濾，所述玻璃柱預(yù)填裝有IOOml四丁基銨形式的Dowex樹脂。洗脫 TBA鹽形式的HA溶液，收集并冷凍干燥。
[0128] 將2g如此獲得的產(chǎn)物溶于200ml二甲亞砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 54. 2mgl，1' -羰二咪唑，將混合物在緩慢攪拌下于室溫放置1小時。然后加入448mg十二 烷基胺，于42°C進(jìn)行酰胺化反應(yīng)24小時。
[0129] 加入5ml飽和NaCl水溶液停止該反應(yīng)，30分鐘后加入I. 5倍體積的無水乙醇以分 離所得衍生物。將沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在無水乙醇中洗滌，然后在高真空 下于40°C干燥。
[0130] 得到I. 25g衍生物，通過IH-NMR測定了其酰胺化程度。
[0131] 實(shí)施例4 :重詢MW為500至730kDa的HA叔丁某酰胺衍牛物Hvadd6的合成，具有 7%至8%的靡爾酰胺化百分比
[0132] 將5. OOg發(fā)酵來源的具有500至730KDa MW的透明質(zhì)酸鈉鹽溶于250ml水中，將 所得溶液通過玻璃柱滲濾，所述玻璃柱預(yù)填裝有IOOml四丁基銨形式的Dowex樹脂。洗脫 TBA鹽形式的HA溶液，收集并冷凍干燥。
[0133] 將2g如此獲得的產(chǎn)物溶于200ml二甲亞砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 53mgl，1' -羰二咪唑，將混合物在緩慢攪拌下于室溫放置1小時。然后加入178mg叔丁基 胺，于42°C進(jìn)行酰胺化反應(yīng)24小時。
[0134] 加入5ml飽和NaCl水溶液停止該反應(yīng)，30分鐘后加入1. 5倍體積的無水乙醇以分 離所得衍生物。將沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在無水乙醇中洗滌，然后在高真空 下于40°C干燥。
[0135] 得到I. 25g衍生物，通過IH-NMR測定了其酰胺化程度。
[0136] 實(shí)施例5 :重詢MW為500至730kDa的HA芐某酰胺衍牛物Hvaddl的合成，具有8% 至9%的靡爾酰胺化百分比
[0137] 將5. OOg發(fā)酵來源的具有500至730KDa MW的透明質(zhì)酸鈉鹽溶于250ml水中，將 所得溶液通過玻璃柱滲濾，所述玻璃柱預(yù)填裝有IOOml四丁基銨形式的Dowex樹脂。洗脫 TBA鹽形式的HA溶液，收集并冷凍干燥。
[0138] 將2g如此獲得的產(chǎn)物溶于200ml二甲亞砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 54. Omgl，1' -羰二咪唑，將混合物在緩慢攪拌下于室溫放置1小時。然后加入260mg芐基 胺，于42°C進(jìn)行酰胺化反應(yīng)24小時。
[0139] 加入5ml飽和NaCl水溶液停止該反應(yīng)，30分鐘后加入1. 5倍體積的無水乙醇以分 離所得衍生物。將沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在無水乙醇中洗滌，然后在高真空 下于40°C干燥。
[0140] 得到L 25g衍生物，通過IH-NMR測定了其酰胺化程度。
[0141] 實(shí)施例6 :以10:1和20: lw/w的比例含有HA和hGF的制劑的制各
[0142] 將8mg發(fā)酵來源的具有150至250KDa(LMW)和500至730kDa(MMW)MW的透明質(zhì)酸 鈉鹽溶于Iml pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液中。完全溶解后，加入0. 8mg hGH得到10:1的多 糖/蛋白質(zhì)重量比和加入〇.4mg hGH得到20:1的多糖/蛋白質(zhì)重量比。將兩種成分適宜 混合，使組合物均勻。如下計(jì)算裝載量：將混合物以1:10稀釋于緩沖液中，在280nm處測定 UV吸光度，所述吸收度通過使用校準(zhǔn)曲線提供了 GH濃度值。
[0143] 實(shí)施例7 :含有由10: lw/w比例的HA十六烷某酰胺和hGF形成的釋放系統(tǒng)的制劑 的制各
[0144] 將8mg如實(shí)施例1中所述制備的HA十六燒基酰胺衍生物HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中。完全溶解后，加入預(yù)溶于水溶液中的hGHO. 8mg并適宜混合，以便使 組合物均勻并且蛋白質(zhì)被捕獲入凝膠中。如下計(jì)算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖 液中，在280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準(zhǔn)曲線提供了 GH濃度值。
[0145] 實(shí)施例8 :含有由10: lw/w比例的HA叔丁某酰胺和hGF形成的釋放系統(tǒng)的制劑的 制各
[0146] 將8mg如實(shí)施例4中所述制備的Hyadd6溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入預(yù)溶于水溶液中的hGHO. 8mg并適宜混合，以便使組合物均勻 并且蛋白質(zhì)被捕獲入凝膠中。如下計(jì)算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在 280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準(zhǔn)曲線提供了 GH濃度值。
[0147] 實(shí)施例9 :含有由10: lw/w比例的HA辛某酰胺和hGF形成的釋放系統(tǒng)的制劑的制 備
[0148] 將8mg如實(shí)施例2中所述制備的Hyadd2溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入預(yù)溶于水溶液中的hGHO. 8mg并適宜混合，以便使組合物均勻 并且蛋白質(zhì)被捕獲入凝膠中。如下計(jì)算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在 280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準(zhǔn)曲線提供了 GH濃度值。
[0149] 實(shí)施例10 :含有由10: lw/V比例的HA十二烷某酰胺和hGF形成的釋放系統(tǒng)的制 劑的制各
[0150] 將8mg如實(shí)施例3中所述制備的Hyadd3溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入預(yù)溶于水溶液中的hGHO. 8mg并適宜混合，以便使組合物均勻 并且蛋白質(zhì)被捕獲入凝膠中。如下計(jì)算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在 280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準(zhǔn)曲線提供了 GH濃度值。
[0151] 實(shí)施例11 :含有由10: lw/w比例的HA芐某酰胺和hGF形成的釋放系統(tǒng)的制劑的 制各
[0152] 將8mg如實(shí)施例5中所述制備的Hyaddl溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入預(yù)溶于水溶液中的hGHO. 8mg并適宜混合，以便使組合物均勻 并且蛋白質(zhì)被捕獲入凝膠中。如下計(jì)算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在 280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準(zhǔn)曲線提供了 GH濃度值。
[0153] 實(shí)施例12 :含有由10: lw/w比例的HA十六烷某酰胺和sCT形成的釋放系統(tǒng)的制 劑的制各
[0154] 將8mg如實(shí)施例1中所述制備的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中。 完全溶解后，加入預(yù)溶于磷酸鹽緩沖液中的鮭魚降鈣素（sCT)0. 8mg以獲得10:1的w/w比 例，適宜混合以便使組合物均勻并且蛋白質(zhì)被捕獲入凝膠中。如下計(jì)算凝膠的裝載量：將其 以1:10稀釋于緩沖液中，在280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準(zhǔn)曲線提供了 降鈣素濃度值。
[0155] 實(shí)施例13 :含有由10: lw/w比例的HA十六烷某酰胺和IL-IRa形成的釋放系統(tǒng)的 泡丨齊I丨的泡丨備
[0156] 將8mg如實(shí)施例1中所述制備的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中。 完全溶解后，加入預(yù)溶于水溶液中的IL-IRaO. 8mg，適宜混合以便使組合物均勻并且蛋白質(zhì) 被捕獲入凝膠中。如下計(jì)算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在280nm處測定 UV吸光度，所述吸收度通過使用校準(zhǔn)曲線提供了 IL-IRa濃度值。
[0157] 實(shí)施例14 :基于10: lw/w的HA十六燒基酉先胺和RNase的制齊[j的制備
[0158] 將8mg如實(shí)施例1中所述制備的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中。 完全溶解后，加入預(yù)溶于磷酸鹽緩沖液中的RNaseO. 8mg，適宜混合以便蛋白質(zhì)被捕獲入凝 膠中。如下計(jì)算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在280nm處測定UV吸光度， 所述吸收度通過使用校準(zhǔn)曲線提供了 RNase濃度值。
[0159] 實(shí)施例15 :含有由10: lw/V比例的HA十六烷某酰胺和胰島素形成的釋放系統(tǒng)的 泡丨齊I丨的泡丨備
[0160] 將8mg如實(shí)施例1中所述制備的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中。 完全溶解后，加入預(yù)溶于磷酸鹽緩沖液中的胰島素0. 8mg，適宜混合以便蛋白質(zhì)被捕獲入凝 膠中。如下計(jì)算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在280nm處測定UV吸光度， 所述吸收度通過使用校準(zhǔn)曲線提供了 IL-IRa濃度值。
[0161] 實(shí)施例16 :用HA或HA酰胺配制的hGH的釋放研究
[0162] 將如實(shí)施例6-11所述制備的制劑引入具有IOOkDa截留的透析管中，浸入溫和攪 拌的PH7磷酸鹽緩沖液中，監(jiān)測從供體隔室的釋放。為了比較，將0.8mg hGH與Iml磷酸鹽 緩沖液（PBS)混合，將制劑引入透析管中。
[0163] 在所有實(shí)驗(yàn)中始終維持漏槽狀態(tài)。在預(yù)設(shè)時間，從供體隔室取50 iU等分試樣并 1:10稀釋以確定隨時間推移的蛋白質(zhì)含量。通過在280nm的UV讀數(shù)和220nm的RP-HPLC 平行進(jìn)行分析，以確定剩余蛋白質(zhì)及其降解（如果有的話）的量。還進(jìn)行了散射測量以研 究所配制蛋白質(zhì)的聚集。最后，從接收隔室取出樣品以檢查蛋白質(zhì)的釋放量對應(yīng)于從供體 隔室中消失的量，并且進(jìn)行質(zhì)譜測量（Esi-Tof)以證實(shí)所釋放的GH未經(jīng)歷任何結(jié)構(gòu)降解。 通過顯示隨時間推移釋放的蛋白質(zhì)百分比構(gòu)建了釋放曲線。圖2、3、4和5。
[0164] 結(jié)果
[0165] 圖2顯示了通過由HyadcM和hGH形成的系統(tǒng)確定的hGH釋放特性對比于通過在 PBS中制備的相同蛋白質(zhì)代表的對照。
[0166] Ml顯示了與LMW-HA和MMW-HA聯(lián)合配制的hGH蛋白質(zhì)的釋放特性：在兩種情況 下，測試了兩種不同的HA和hGH重量比(10:1和20:1)，因?yàn)? 申請人:通過該實(shí)驗(yàn)旨在證實(shí)： 對比于通過在PBS、即在水性溶劑中制備所獲得的特性，具有疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)即使與大量 具有不同MW的HA聯(lián)合也不會使蛋白質(zhì)的釋放特性產(chǎn)生任何變化。
[0167] 圖4將由本發(fā)明的酰胺和hGH形成的釋放系統(tǒng)的hGH釋放特件與由hGH在PBS中 所代表的對照進(jìn)行了比較。
[0168] 圖5顯示了由本發(fā)明的酰胺形成的釋放系統(tǒng)的50% hGH釋放時間，同樣對比于如 上文所述的對照。
[0169] 如果將圖3與圖2和4相比較，可以看出：對比于由在PBS中分析的蛋白質(zhì)所代表 的對照以及對比于在具有不同MW的HA中以不同重量比配制的蛋白質(zhì)，由HA酰胺（如上文 所述和所要求）與具有主要是疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)（在此情況中為hGH)形成的釋放系統(tǒng)以 顯然顯著的方式引起了蛋白質(zhì)隨時間推移持續(xù)緩慢釋放。因此，決定所研究的疏水性蛋白 質(zhì)的釋放特性改變的不是所述多糖的濃度和/或MW，而是該聚合物的化學(xué)性質(zhì)。所有這些 在圖5中更清楚，圖5比較了 50% hGH釋放時間：該圖顯示，對比于對照（在PBS中的hGH)， 本發(fā)明涉及的新釋放系統(tǒng)使釋放時間升高一直到3倍。
[0170] 實(shí)施例17 :sCT、ILl_Ra和胰島素的釋放對比于親水件蛋白質(zhì)RNase A的釋放特件 的研究
[0171] 將如實(shí)施例12-15所述制備的制劑各自引入具有IOOkDa截留的透析管中，浸入溫 和攪拌的PH7磷酸鹽緩沖液中。為了比較，將0. 8mg降鈣素、IL-IRa、胰島素或RNase與Iml 磷酸鹽緩沖液混合，將制劑引入透析管中，以監(jiān)測其隨時間推移從供體隔室的釋放。
[0172] 在所有實(shí)驗(yàn)中始終維持漏槽狀態(tài)。在預(yù)設(shè)時間，從供體隔室取IOiU等分試樣并 1:10稀釋以確定隨時間推移的蛋白質(zhì)含量。通過在280nm的UV讀數(shù)平行進(jìn)行分析，以確定 剩余蛋白質(zhì)的量。還進(jìn)行了散射測量以研究所配制蛋白質(zhì)的聚集。最后，從接收隔室取出 樣品以檢查蛋白質(zhì)的釋放量對應(yīng)于從供體隔室中消失的量。構(gòu)建了釋放曲線，對比于對照 顯示了隨時間推移釋放的蛋白質(zhì)百分比。
[0173] 蛋白質(zhì)RNase A的GRAVY指數(shù)=-0. 67,因此不能歸類為主要為疏水性的蛋白質(zhì)， 而是親水性蛋白質(zhì)。下文進(jìn)行了描述以將其釋放特性與由聯(lián)合有主要具有疏水性質(zhì)的蛋白 質(zhì)的Hyadd釋放系統(tǒng)所得到的特性相比較，從而證實(shí)存在差異。
[0174]
[0175] 圖6-8顯示了所分析的三種具有主要是疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)的釋放曲線：在所有三 種情況中，由HA十六烷基酰胺聯(lián)合所述蛋白質(zhì)形成的系統(tǒng)決定其持續(xù)緩慢釋放達(dá)到比對 照長得多的時間。
[0176] 相反，圖9證實(shí)：相同的十六烷基酰胺以相同重量比（10:lw/w)與蛋白質(zhì) RNase(具有主要是親水的性質(zhì)且GRAVY指數(shù)=-0.67)的聯(lián)合決定了與由相同蛋白質(zhì)在 PBS中配制所產(chǎn)生的釋放特性相同的釋放特性。
[0177] 實(shí)施例18 :hGH釋放入源自骨關(guān)節(jié)炎患者的人滑液（LS)的研究
[0178] 首先，將激素hGH與熒光探針（Cy5. 5)共價(jià)結(jié)合，從而可以在其它滑液蛋白質(zhì)存在 的情況下清楚地識別出激素hGH。為此目的，將1.5mg hGH溶于2ml pH8硼酸鹽緩沖液中， 向其中加入2mg預(yù)溶于60 ill DMSO中的Cy5. 5。在遮光和溫和攪拌下進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)18小 時。然后通過針對磷酸鹽緩沖液透析4天和針對MilliQ水透析1天進(jìn)行純化。然后通過 凝膠過濾分析經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)，以驗(yàn)證其純度。
[0179] 如實(shí)施例7所述以10:1重量比制備基于HyadcM和hGH_Cy5. 5的制劑。將兩種成 分適宜混合，以便使組合物均勻并且蛋白質(zhì)被捕獲入凝膠中。將如此獲得的凝膠引入具有 IOOkDa截留的透析管中，浸入由PBS和源自骨關(guān)節(jié)炎患者的滑液組成（v/vl:l)的介質(zhì)中， 維持在溫和攪拌下。
[0180] 在預(yù)設(shè)時間測定隨時間推移釋放到接收隔室的蛋白質(zhì)量。該分析通過具有熒光檢 測器的RP-HPLC進(jìn)行，不僅確定hGH含量，而且還檢查了該蛋白質(zhì)未經(jīng)歷降解。構(gòu)建釋放曲 線，顯示了長達(dá)48小時的隨時間推移釋放的蛋白質(zhì)的百分比。
[0181]
[0182] 圖10顯示了所得結(jié)果：hGH從由HyadcM聯(lián)合所研究蛋白質(zhì)形成的系統(tǒng)向LS中的 釋放證實(shí)，以前在圖2中證實(shí)的持續(xù)緩慢釋放保持不變。因此，可以說明：Hyadd系統(tǒng)中所 包含的蛋白質(zhì)/藥物受到保護(hù)，并且在富含酶、蛋白質(zhì)（有些具有未知性質(zhì)）和促炎分子的 釋放介質(zhì)如OA患者的滑液中未經(jīng)受降解。
[0183] 實(shí)施例19 :由Hvadd4和hGH形成的系統(tǒng)在關(guān)節(jié)內(nèi)施用于大鼠后的藥物動力學(xué)研 究
[0184] 將8mg如實(shí)施例1中所述制備的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9磷酸鹽緩沖液中，于 121°C濕熱滅菌。隨后，在無菌環(huán)境下加入0. SmghGH (預(yù)溶于水溶液中并通過0. 2微米再生 纖維素濾器進(jìn)行過濾滅菌）并適宜混合，以便使組合物均勻并且蛋白質(zhì)被捕獲入凝膠中。
[0185] 對于體內(nèi)研究，將等同于IOOii g蛋白質(zhì)/動物的制劑量注射入大鼠膝蓋中。在預(yù) 定時間（0. 15、1、2、3、4、5、6、7、8、24和4811)取血漿樣品，進(jìn)行￡1154測試以評估1.&.施用 后穿透到血漿中的hGH濃度。該實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。
[0186] 為比較目的，將一組動物用等量的游離hGHdOOyg)同樣通過關(guān)節(jié)內(nèi)施用進(jìn)行處 理。通過將血漿中發(fā)現(xiàn)的hGH濃度（ng/ml)作為時間（一直到48h)的函數(shù)作圖，獲得了藥 物動力學(xué)曲線。
[0187] 益果
[0188] 如圖11所示，在關(guān)節(jié)內(nèi)注射后立即能在血漿中發(fā)現(xiàn)所注射的蛋白質(zhì)。
[0189] 但是，由于Hyadd系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)持續(xù)釋放，其保留在原位、即關(guān)節(jié)腔中并且未 穿透到血流中，從而其全部作用均發(fā)生在注射部位。
【權(quán)利要求】
1. 用于持續(xù)釋放治療學(xué)和/或生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，包含： a) 具有主要是疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)，和 b) 透明質(zhì)酸（HA)酰胺 其中所述具有主要是疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)具有超過_〇. 5的GRAVY指數(shù)，并且所述HA酰 胺選自： ?HA十六烷基酰胺：具有十六烷基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7%至14%、優(yōu)選 8%至 9% ; ? HA辛基酰胺：具有辛胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為10%至15%、優(yōu)選10%至 11% ； ? HA十二烷基酰胺：具有十二烷基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為10%至15%、優(yōu) 選 10%至 11% ; ?HA叔丁基酰胺：具有叔丁基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7%至12%、優(yōu)選7% 至8% ; ?HA芐基酰胺：具有芐胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7%至15%、優(yōu)選8%至9%。
2. 權(quán)利要求1所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，其中用于制備酰胺的HA具有400 至3-106Da、特別是50至730KDa、750至1230KDa或1500至2500KDa、甚至更特別是150至 250KDa或500至730KDa的重均分子量。
3. 權(quán)利要求1-2所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，其中所述的具有主要是疏水 性質(zhì)的治療學(xué)和/或生物學(xué)活性蛋白質(zhì)是胰島素、hGH、sCT、IL-IRa、G-CSF、TOGF、優(yōu)選 PDGF-BB、TGF- P、EGF、VEGF-B、EPO、NGF P、轉(zhuǎn)鐵蛋白、HMP-2、HMP-3 和 TMP-4。
4. 權(quán)利要求1-3所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，其中所述HA酰胺是十六烷基酰 胺，并且用于制備所述酰胺的HA具有150至250KDa或500至730KDa的重均分子量。
5. 權(quán)利要求4所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，其中所述治療學(xué)和/或生物學(xué)活 性蛋白質(zhì)是hGH或sCT，任選與穩(wěn)定劑和賦形劑聯(lián)合。
6. 權(quán)利要求3所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，其中所述治療學(xué)和/或生物學(xué)活 性蛋白質(zhì)是胰島素，任選與穩(wěn)定劑和賦形劑聯(lián)合。
7. 權(quán)利要求4所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，其中所述治療學(xué)和/或生物學(xué)活 性蛋白質(zhì)是TOGF、優(yōu)選TOGF-BB、TGF- 0、EGF或VEGF-B，任選與穩(wěn)定劑和賦形劑聯(lián)合。
8. 權(quán)利要求4所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，其中所述治療學(xué)和/或生物學(xué)活 性蛋白質(zhì)是金屬蛋白酶抑制劑TMP-2、TMP-3或TMP-4,任選與穩(wěn)定劑和賦形劑聯(lián)合。
9. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，用于在治療由骨關(guān)節(jié)炎 導(dǎo)致的關(guān)節(jié)損傷、治療腱炎、修復(fù)心肌損傷、修復(fù)骨折/空腔或愈合皮膚潰瘍/創(chuàng)傷/撕裂 傷中用于注射、關(guān)節(jié)內(nèi)或局部應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求5所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，用于在治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性 或銀屑病性關(guān)節(jié)炎和/或骨質(zhì)疏松癥中用于關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用。
11. 權(quán)利要求3所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，用于在治療由骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的 關(guān)節(jié)損傷、治療腱炎、修復(fù)心肌損傷、修復(fù)骨折/空腔或愈合皮膚潰瘍/創(chuàng)傷/撕裂傷中用 于注射、關(guān)節(jié)內(nèi)或局部應(yīng)用。
12. 權(quán)利要求7所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，用于在治療由骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的 關(guān)節(jié)損傷、治療腱炎、修復(fù)心肌損傷、修復(fù)骨折/空腔或愈合皮膚潰瘍/創(chuàng)傷/撕裂傷中用 于注射、關(guān)節(jié)內(nèi)或局部應(yīng)用。
13. 權(quán)利要求8所要求的用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，用于在治療由骨關(guān)節(jié)炎引起的 關(guān)節(jié)軟骨損傷和/或修復(fù)骨軟骨侵蝕中用于注射或關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用。
14. 透明質(zhì)酸（HA)酰胺和具有主要是疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)在形成用于持續(xù)釋放治療學(xué) 和/或生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的系統(tǒng)中的用途，其中所述具有主要是疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)具有超 過-0. 5的GRAVY指數(shù)，并且其中所述HA酰胺選自： a) HA十六烷基酰胺：具有十六烷基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7%至14%、優(yōu) 選8%至9% ; b) HA辛基酰胺：具有辛胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為10%至15%、優(yōu)選10%至 11% ； c) HA十二烷基酰胺：具有十二烷基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為10%至15%、優(yōu) 選 10%至 11% ; d) HA叔丁基酰胺：具有叔丁基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7 %至12 %、優(yōu)選7 % 至8% ; e) HA芐基酰胺：具有芐胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7%至15%、優(yōu)選8%至9%; 其中用于制備酰胺的HA具有400至3xl06Da、特別是50至730KDa、750至1230KDa或 1500至2500KDa、甚至更特別是150至250KDa或500至730KDa的重均分子量。
15. 權(quán)利要求14所要求的用途，其中所述具有主要是疏水性質(zhì)的治療學(xué)和/或生物學(xué) 活性蛋白質(zhì)是胰島素、hGH、sCT、IL-IRa、G-CSF、PDGF、優(yōu)選 PDGF-BB、TGF- 0、EGF、VEGF-B、 EPO、NGFP、轉(zhuǎn)鐵蛋白、HMP-2、HMP-3 和 TMP-4。
16. 權(quán)利要求15所要求的用途，其中所述HA酰胺是十六烷基酰胺。
17. 權(quán)利要求16所要求的用途，其中所述治療學(xué)和/或生物學(xué)活性蛋白質(zhì)是hGH或 sCT，任選與穩(wěn)定劑和賦形劑聯(lián)合。
18. 權(quán)利要求17所要求的用途，用于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性或銀屑病性關(guān)節(jié)炎和/或骨質(zhì) 疏松癥的關(guān)節(jié)內(nèi)治療。
19. 權(quán)利要求15所要求的用途，用于在治療由骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的關(guān)節(jié)損傷、治療腱炎、修 復(fù)心肌損傷、修復(fù)骨折/空腔或愈合皮膚潰瘍/創(chuàng)傷/撕裂傷中用于注射、關(guān)節(jié)內(nèi)或局部應(yīng) 用。
20. 權(quán)利要求16所要求的用途，其中所述治療學(xué)和/或生物學(xué)活性蛋白質(zhì)是金屬蛋白 酶抑制劑TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4,任選與穩(wěn)定劑和賦形劑聯(lián)合，用于注射或關(guān)節(jié)內(nèi)治療 由骨關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷和/或修復(fù)骨軟骨侵蝕。
【文檔編號】A61K47/36GK104349788SQ201380028007
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】M·坎皮西, C·古麗瑟, D·雷尼爾 申請人:菲迪亞制藥股份公司