專利名稱：：疏水蛋白用作可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒的包被劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有含疏水蛋白包被的可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，和其制備方法。
背景技術(shù)：
：為了使可發(fā)型聚苯乙烯能夠無故障的運(yùn)輸，并減少預(yù)發(fā)泡聚苯乙烯泡沫顆粒上的靜電荷，通常用抗靜電物質(zhì)涂布EPS顆粒。時(shí)常由于包被劑從顆粒表面被刮掉或洗掉而導(dǎo)致抗靜電性質(zhì)不令人滿意。抗靜電包被也會(huì)導(dǎo)致顆粒結(jié)塊和流動(dòng)性能較弱。EP-A470455描述了具有含季銨鹽和細(xì)粒二氧化硅包被的串珠狀抗靜電可發(fā)型苯乙烯聚合體，其具有良好的流動(dòng)性能。疏水蛋白是約100-150個(gè)氨基酸的小蛋白，其為絲狀真菌(例如普通裂褶菌(^/^印/^//"附"附附"加))的特征蛋白。它們通常含有8個(gè)半胱氨酸單位。疏水蛋白對于接觸面有顯著的親和力，因此適合用于包被表面。因此可能通過用疏水蛋白涂布例如聚四氟乙烯(Teflon)來獲得親水表面。疏水蛋白可以從天然物質(zhì)中分離出來。我們先前的申請DE102005007480.47>開了制備疏水蛋白的方法。疏水蛋白對于多種應(yīng)用的用途也已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中提出。WO96/41882提出疏水蛋白作為乳化劑、增稠劑、表面活性劑，用于使疏水表面親水、改良親7JC底物的抗水性、制備水包油型乳劑或油包水乳劑的用途。也提出了在藥物上的應(yīng)用，例如制備軟膏或乳膏，還有在化妝品上的應(yīng)用，例如護(hù)膚或制備洗發(fā)香波或洗發(fā)劑。WO01/57528公開了在30-80。C溫度下用含有疏水蛋白的溶液涂布窗戶、隱性眼鏡、生物傳感器、醫(yī)療器械、用于實(shí)驗(yàn)或儲(chǔ)存的器皿、船外殼、固體顆?；蜉d客運(yùn)輸工具的底盤或車體。WO03/53383公開了疏水蛋白用于處理化妝品應(yīng)用中的角蛋白材料的用途。WO03/10331公開了疏水蛋白包被的傳感器，(例如測量電極)，該傳感器上非共價(jià)連有其他物質(zhì)如電活性物質(zhì)、抗體或酶。
發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明的主題是除去所提及的缺點(diǎn)，并找到可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒的抗靜電包被劑，其減少顆粒在發(fā)泡前或發(fā)泡過程中結(jié)塊而降低密度的趨勢。相應(yīng)地，找到了上述的可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒。根據(jù)熱塑性聚合體，包被優(yōu)選包含1-5000ppm、尤其10-1000ppm的疏水蛋白。包被可能還包含防靜電劑和/或包被輔劑，或者可能被應(yīng)用于含有不同包被劑的進(jìn)一步涂布。尤其優(yōu)選只由疏水蛋白或疏水蛋白混合物組成的包被，并且其在可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒上形成單分子層。優(yōu)選用于可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒苯乙烯聚合體，例如聚苯乙烯(EPS)，或聚烯烴(polyolefin)，例如聚乙烯(EPE)或聚丙烯(EPP)?？砂l(fā)型熱塑性聚合體顆粒是那些能夠例如借助熱空氣或蒸汽而發(fā)泡產(chǎn)生膨"長的熱塑性聚合體顆粒。它們通常包含化學(xué)的或物理的發(fā)泡劑，其量為熱塑性聚合體重量的2-10%，優(yōu)選3-7%。優(yōu)選的物理發(fā)泡劑是氣體，例如氮或二氧化碳或具有2-7個(gè)碳原子的脂肪族烴、乙醇、酮、醚或鹵代烴。尤其優(yōu)選使用異丁烷、(正)-丁烷、異戊烷、(正)-戊烷、新戊烷、己烷或其混合物?？砂l(fā)和膨脹型熱塑性聚合體顆粒可能還包含有效量的常用輔劑，例如染料、色素、填充劑、IR吸收劑(例如碳黑、鋁或石墨)、穩(wěn)定劑、阻燃劑例如六溴環(huán)十二烷(HBCD)、增效阻燃劑例如二異丙苯或過氧化二異丙苯、成核劑或助流劑。依賴于制造過程，根據(jù)本發(fā)明的可發(fā)型熱塑性聚合體顆?？赡苁乔蛐?、小珠形或圓柱形的，且通常其平均顆粒直徑在0.05-5mm范圍內(nèi)，尤其在0.3-2.5mm范圍內(nèi)，而且如果適當(dāng)可以通過篩選分為獨(dú)立的部分。膨脹型熱塑性聚合體顆粒的平均顆粒直徑在1-10mm范圍內(nèi)，尤其在2-6mm范圍內(nèi)，且相應(yīng)于膨脹程度其密度在10-200kg/m3范圍內(nèi)?？砂l(fā)型熱塑性聚合體顆粒可以例如通過將熱塑性聚合體顆粒用發(fā)泡劑在池中壓力浸漬而獲得，通過在發(fā)泡劑存在下進(jìn)行懸浮聚合或通過在擠壓機(jī)或靜電混合機(jī)中進(jìn)行融解浸漬并且隨后在水下進(jìn)行壓力成粒而獲得。膨脹型熱塑性聚合體顆?？梢酝ㄟ^將可發(fā)型熱塑性聚合體顆粒使用例如熱空氣或蒸汽在壓力預(yù)起泡機(jī)中發(fā)泡而獲得，通過將熱塑性聚合體顆粒用發(fā)泡劑在池中壓力浸漬并且隨后還原壓力而獲得，或通過包含發(fā)泡劑的融解擠壓發(fā)泡和隨后的成粒而獲得。術(shù)語"疏水蛋白"根據(jù)本發(fā)明指具有如下通用結(jié)構(gòu)式(l)的蛋白質(zhì)Xn-G、Xi隱5o-G2-Xo-5—G3-Xi.ioo畫G4-Xi-ioo一C!5"X"5o-G6"Xo-5—G7-Xi-5o-G8-!Xm(1)，其中X可能是任意的20個(gè)天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、絲氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、組氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、異亮氨酸Ile、甲硫氨酸Met、蘇氨酸Thr、天冬酰胺Asn、賴氨酸Lys、纈氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)。X也可能在各情況下是相同或不同的。X旁邊的指數(shù)表示在各情況下的氨基酸數(shù)，C是半胱氨酸，指數(shù)n和m是不依賴于彼此的0-500，優(yōu)選15-300之間的自然數(shù)。此外，根據(jù)公式(l)的多肽的特征在于，相對于相同大小的水滴與未包被的玻璃表面形成的接觸角，該多肽的特性可使(玻璃表面包被后)水滴接觸角增加至少20。，優(yōu)選至少25。，和尤其優(yōu)選30。，其中每一測量均在室溫進(jìn)行。表示為d到C8的半胱氨酸可以是還原狀態(tài)或者彼此形成二硫鍵。尤其優(yōu)選在分子內(nèi)形成C-C橋，尤其至少l個(gè)，優(yōu)選2個(gè)，尤其優(yōu)選3個(gè)和特別尤其優(yōu)選4個(gè)分子內(nèi)二石充鍵。本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用具有通式(ll)的疏水蛋白進(jìn)行，Xn-C1-X3-25-C2-Xo-2-C3-X5_50-C4-X2-35-C5-X2-i5-C6-Xo-2-C7-X3_35-C8-Xm(II)其中X、C及X和C旁邊的指數(shù)與上述定義一致，然而指數(shù)n和m在0-300之間，而且通過上述接觸角的變化來區(qū)分蛋白質(zhì)。尤其優(yōu)選應(yīng)用具有通式(lll)的疏水蛋白Xn-C、Xs-9一C2匪C3-Xii一39-C4-X2-23—C5-X5-9-C6-C7-X6陽i8—C8-Xm(III)其中X、C及X和C旁邊的指數(shù)與上述定義一致，指數(shù)n和m在0-200之間，而且通過上述接觸角的變化來區(qū)分蛋白質(zhì)。Xn和Xm殘基可能是天然連接于疏水蛋白的肽序列。然而，也可能其各自或兩者都不是天然連接于疏水蛋白的肽序列。也包括那些疏水蛋白中天然存在的肽序列由非天然存在于疏水蛋白中的肽序列所延長的Xn和/或X加殘基。如果Xn和/或Xm不是天然連接于疏水蛋白的肽序列，此類序列通常長度為至少20個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少35個(gè)，尤其優(yōu)選至少50個(gè)和特別尤其優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸。此類非天然連接于疏水蛋白的殘基也指下文中的融合配偶體。這是為了說明所述蛋白質(zhì)可能由至少一個(gè)疏水蛋白部分和一個(gè)融合配偶體組成，自然條件下它們并不以這種形式共同存在。融合配偶體可能選自多種蛋白質(zhì)。對于多數(shù)融合配偶體，其也可能連接一個(gè)疏水蛋白部分，例如連接于所述疏水蛋白部分的氨基端(Xn)和羧基端(XJ。然而，也可能例如兩個(gè)融合配偶體連接于本發(fā)明蛋白質(zhì)的一個(gè)位點(diǎn)(Xn或Xm)。尤其合適的融合配偶體部分是在微生物、特別是大腸桿菌(ECO/Z)或枯草芽孢桿菌(5fl"7/wssw/^7/s)中天然存在的蛋白質(zhì)。此類融合配偶體部分的實(shí)例是序列yaad(SEQIDNO:15和16)、yaae(SEQIDNO:17和18)、和硫氧還蛋白。同樣高度適用的是前述序列的片段或衍生物，其只含有所述序列的部分、優(yōu)選70-99%、尤其優(yōu)選80-98%，或相對于所述序列其中個(gè)別氨基酸或核苷晚t生了改變，在各情況中所述百分比指M酸數(shù)。還可另外修飾根據(jù)本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)的多肽序列，例如通基化、乙?；?，或者化學(xué)交聯(lián)(例如通過戊二醛交聯(lián))。根據(jù)本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)的一個(gè)特征是當(dāng)使用所述蛋白包被表面時(shí)，該表面性質(zhì)改變。通過測量用蛋白質(zhì)包#_表面前后的水滴接觸角并確定兩次測量之差，可以試驗(yàn)性確定表面特性的改變。接觸角的測量原則上是技術(shù)人員所公知的。測量基于室溫和5升水的小水滴。適合于實(shí)施例的用于測量接觸角的方法的精確實(shí)驗(yàn)條件在實(shí)驗(yàn)部分說明。在其中所述的條件下，根據(jù)本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)與未包被的玻璃表面與同樣大小水滴的接觸角相比具有增加接觸角至少20。，優(yōu)選至少25°,尤其優(yōu)選30。的特性。目前已知的疏水蛋白中，疏水蛋白部分的極性和非極性氨基酸的位置是保守的，導(dǎo)致特征性的疏水性圖譜。根據(jù)生物物理學(xué)性質(zhì)和疏水性的差異將目前已知的疏水蛋白分為兩類，I類和II類(Wessels等人1994，Ann.Rev.Phytopathol.，32，413-437)。I類疏水蛋白組裝的膜高度不可溶(即使是升高溫度在1%的十二烷基硫酸鈉(SDS)中也是如此)，并且只能通過濃縮的三氟乙酸(TFA)或曱酸而再次解離。與之相反，II類疏水蛋白的組裝形式較不穩(wěn)定。它們通過60%濃度的乙醇或1。/oSDS(在室溫)即可再次解離。氨基酸序列的比較揭示，在II類疏水蛋白中(:3和C"半胱氨酸之間區(qū)域的長度明顯小于I類疏水蛋白。此外，II類疏水蛋白比I類疏水蛋白具有更多帶電荷的氨基酸。實(shí)施本發(fā)明尤其優(yōu)選的疏水蛋白是dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2型的疏水蛋白，下文的序列表對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。它們也可能僅為所述類型的部分或衍生物。也可能將多個(gè)相同或不同結(jié)構(gòu)的多個(gè)疏水蛋白部分(優(yōu)選2個(gè)或3個(gè))一起連接于并非天然連接疏水蛋白的相應(yīng)適宜多肽序列上。實(shí)施本發(fā)明尤其適合的還有具有SEQIDNO:20、22、24中所示多肽序列的融合蛋白質(zhì)及其編碼核酸序列，尤其是根據(jù)SEQIDNO:19、21、23的序列。尤其優(yōu)選的實(shí)施方案還包括由SEQIDNO:20、22或24所示多肽序列起始，通過取代、插入或缺失至少l個(gè)至多10個(gè)、優(yōu)選5個(gè)、更優(yōu)選所有氨基酸的5%而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)仍然具有起始蛋白質(zhì)至少50%的生物特性。此處蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性指上述接觸角至少增加20。。根據(jù)本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)可以通過肽合成的成熟技術(shù)化學(xué)制備，例如通過Merrifidd固相合成?？梢酝ㄟ^合適的手段將天然存在的疏水蛋白從天然來源分離出來。例如可見W6sten等人，Eur.JCellBio.63，122-129(1994)或WO96/41882。融合蛋白質(zhì)優(yōu)選通過基因工程方法制備，其中一個(gè)編碼融合配偶體的核酸序列(特別是DNA序列)與一個(gè)編碼疏水蛋白部分的核酸序列(特別是DNA序列)組合，從而通過組合核^列的基因表達(dá)在宿主生物體中產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)。在我們的在先申請DE102005007480.4中公開了此類制備方法。此處用于所述構(gòu)建方法的合適的宿主生物體(生產(chǎn)生物體)是原核生物(包括古細(xì)菌04rc/^"efl))或真核生物，尤其是細(xì)菌包括嗜鹽菌(/ifl/o^cteWfl)和甲烷球菌(柳e溈fl朋cd)，真菌，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其優(yōu)選大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(5fl"7/船/M"flteWM柳)、米曲霉(/4s/7e/"gz7/MS、構(gòu)巢曲霉(y45/7^^7/附肌V/w/flW力、黑曲霉045/;erg///MSZger)、巴斯德畢赤酵母(尸Zc/iZfl/mstoWs)、假單胞菌屬物種(i^wfifo附o"as15/7ec.)、乳酸軒菌(/flcto6a"7//)、多形漢遜酵母(^Tam^"w/fl/7((K附or/^fl)、里氏木霉(rnV^otife/7Wffzr^"〕、SF9(或相關(guān)細(xì)胞)等等。本發(fā)明還涉及表達(dá)構(gòu)建體的用途，所述表達(dá)構(gòu)建體包含在調(diào)控核列的遺傳控制下編碼根據(jù)本發(fā)明使用的多肽的核酸序列，并且本發(fā)明也涉及包含至少一個(gè)此類表達(dá)構(gòu)建體的載體。所用構(gòu)建體優(yōu)選包含特定編碼序列的5，上游啟動(dòng)子和3，下游終止序列，適用的情況下還包含各自與編碼序列有效連接的其他常用調(diào)控元件。"有效連接，，指啟動(dòng)子、編碼序列、終止子和適用情況下的其他調(diào)控元件的有序排列，從而使每個(gè)調(diào)控元件能夠?qū)崿F(xiàn)其表達(dá)編碼序列所需的功能。有效連接序列的實(shí)例為尋耙序列以及增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號等等。其它調(diào)控元件包含可選標(biāo)記、擴(kuò)增信號、復(fù)制起點(diǎn)等等。合適的調(diào)控元件在例如Goeddel，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法185，學(xué)術(shù)出版社，SanDiego，CA(19卯)中描述。除這些調(diào)控序列以外，可能在實(shí)際結(jié)構(gòu)基因的上游仍存在對這些序列的天然調(diào)控，且適用的情況下可對之進(jìn)行遺傳修飾，從而通過關(guān)閉天然調(diào)控而增強(qiáng)基因表達(dá)。優(yōu)選的核酸構(gòu)建體最好還包含一個(gè)或多個(gè)與啟動(dòng)子功能性連接的上述增強(qiáng)子序列，以增強(qiáng)核酸序列的表達(dá)。其他有利的序列，例如其他的調(diào)控元件或終止子也可插入到DNA序列的3，末端。構(gòu)建體中可能具有一個(gè)或多個(gè)拷貝的核酸。如果為篩選所述構(gòu)建體所需，構(gòu)建體也可能包含其他標(biāo)記，例如抗生素抗性或營養(yǎng)缺陷型補(bǔ)償基因。例如，所述方法有利的調(diào)控序列存在于啟動(dòng)子如cos、tac、trp、tet、trp、tet、lpp、lac、lpp匪lac、lacIq醒T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、入-PR啟動(dòng)子或U啟動(dòng)子中，這些啟動(dòng)子最好在革蘭氏陰性菌中使用。其他有利的調(diào)控序列存在于例如革蘭氏陽性啟動(dòng)子amy和SP02,和酵母或真菌啟動(dòng)子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。也可以〗吏用人工啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控。為了在宿主生物體中表達(dá)的目的，有利地是將核酸構(gòu)建體插入例如能夠使基因在宿主細(xì)胞中最優(yōu)表達(dá)的載體(例如質(zhì)?；蚴删w)。除質(zhì)粒和噬菌體以外，載體也指技術(shù)人員所公知的任何其它載體，即例如病毒(如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒)，轉(zhuǎn)座子，IS元件，噬粒，粘粒，和線性或環(huán)狀DNA，以及農(nóng)桿菌系統(tǒng)。這些載體可以在宿主生物體中自主復(fù)制或隨染色體復(fù)制。這些載體構(gòu)成本發(fā)明的其他實(shí)施方案。合適質(zhì)粒的實(shí)例是大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR2卯、pIN國III，，3-Bl、tgtll或pBdCI,鏈霉菌(5^印to附j(luò);cey)的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，桿菌的pUB110、pC194或pBD214，棒狀桿菌(C。/j"Wfl"eWw附)的pSA77或pAJ667,真菌的pALSl、pIL2或pBB116，酵母中的2ot、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23，或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述質(zhì)粒是可能質(zhì)粒的一小部分選擇。其它質(zhì)粒是技術(shù)人員所公知的，并且能夠在例如《克隆載體》(Eds.PouwelsP.H.等人Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)中找到。為了表達(dá)其它存在的基因，核酸構(gòu)建體也有利地包含3，-末端和/或5，-末端調(diào)控序列來增強(qiáng)表達(dá)，所述序列根據(jù)宿主生物和基因的選擇而加以選擇，以達(dá)到最佳表達(dá)。這些調(diào)控序列旨在使基因和蛋白質(zhì)特異性表達(dá)。這意味著取決于宿主生物體，例如基因只在誘導(dǎo)后表達(dá)或過表達(dá)，或者立即表達(dá)和/或過表達(dá)。在這點(diǎn)上，優(yōu)選引入的調(diào)控序列或因子具有正面影響，并且增強(qiáng)其被引入的基因的表達(dá)。因此，使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)在轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)調(diào)控元件是有利的。然而，除此之外，也可能通過例如改良mRNA穩(wěn)定性來增強(qiáng)翻譯。在載體的另一實(shí)施方案中，包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體或本發(fā)明核酸的載體也可能以線性DNA的形式被有利地引入微生物中，并通過異源或同源重組的方式整合到宿主生物體的基因組中。此線性DNA可能由線性化載體(例如質(zhì)粒)組成，或僅由核酸構(gòu)建體或核酸組成。為實(shí)現(xiàn)生物中異源基因的最佳表達(dá)，最好根據(jù)生物中特定的密碼子使用來修飾核酸序列。通過計(jì)算機(jī)分析所研究生物的其他已知基因，可以確定密碼子的使用。將合適的啟動(dòng)子與合適的編碼核苷酸序列和終止信號或多聚腺苷酸信號融合來制備表達(dá)盒。常規(guī)重組和克隆技術(shù)見于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作手冊，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)和T.J.Silhavy，M丄.Berman和L.W.Enquist，基因融合實(shí)驗(yàn)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以及在Ausubel，F(xiàn).M.等人，現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，GreenePublishingAssoc.和WileyInterscience(1987)中的描述。為了實(shí)現(xiàn)在合適宿主生物體中的表達(dá)，最好將重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體插入宿主特異性載體中，這可使基因在宿主中最優(yōu)表達(dá)。載體是技術(shù)人員所熟知的，并且能夠在例如"克隆載體"(PouwelsP.H.等人，Eds.，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。可以利用載體制備例如由至少一個(gè)載體轉(zhuǎn)化的可用于生產(chǎn)本發(fā)明所用多肽的重組4敫生物。最好將上述重組構(gòu)建體引入合適的宿主系統(tǒng)并表達(dá)之。在此情況下，優(yōu)選使用技術(shù)人員熟知的常用克隆和轉(zhuǎn)染方法，例如共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔法、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等等，以引起所述核酸在特定表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。合適的系統(tǒng)在例如現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，F(xiàn).Ausubel等人編輯，WileyInterscience,NewYork1997,或Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作手冊，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中描述。也可以制備同源重組微生物。為此，可制備包括至少一部分本發(fā)明所用基因或編碼序列的載體，適用的情況下，所述編碼序列中引入至少一個(gè)氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸取代，從而修飾(例如功能性破壞)該序列(敲除載體)。引入的序列可為例如相關(guān)微生物的同源物或由哺乳動(dòng)物、酵母或昆蟲來源衍生而來?；蛘?，可設(shè)計(jì)用于同源重組的載體，從而使內(nèi)源性基因在同源重組時(shí)發(fā)生突變或其他改變，但仍然編碼功能性蛋白質(zhì)(例如改變上游調(diào)控區(qū)域由此改變內(nèi)源性蛋白質(zhì)的表達(dá))。本發(fā)明所用的基因的改變的部分位于同源重組載體中。適合同源重組的載體的構(gòu)建在例如Thomas,K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51:503中描述。適合本發(fā)明4吏用的核酸或核酸構(gòu)建體的重組宿主生物體原則上是任何原核或真核生物體。最好使用微生物例如細(xì)菌、真菌或酵母作為宿主生物體。革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌，優(yōu)選腸桿菌科(五"fe/Y/^ctef7'flceae)、假單胞菌科(i^ew/o附o/ia^iceae)、根瘤菌科(及/^oMfl"ae)、鏈霉菌科(5^印to附y(tǒng)cetoc^^)或諾卡氏菌科(iVoainftVice"e)的細(xì)菌，特別優(yōu)選使用的細(xì)菌為埃希氏菌屬(E^&Wc/t/fl)、假單胞菌屬、鏈酶菌屬、諾卡氏菌屬、伯克霍爾德菌屬(5"rA:Ao/rfeW")、沙門氏菌屬(5^/附0^//")、農(nóng)桿菌屬或紅球菌屬(及/^&C0CC做)的細(xì)菌。依據(jù)宿主生物體，按技術(shù)人員公知的方法生長或培養(yǎng)制備融合蛋白質(zhì)的過程中使用的生物體。微生物通常生長在液體培養(yǎng)基中，其中包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有機(jī)氬源的形式例如酵母提取物，或例如疏酸銨等鹽類)、微量元素(例如鐵鹽、錳鹽和鎂鹽)、以及適用情況下的維生素，生長溫度在0。C到100。C之間，優(yōu)選10。C到60。C,同時(shí)供以氧氣。此種情況培養(yǎng)液pH值可以維持或不維持在固定值，即在培養(yǎng)過程中可以調(diào)節(jié)或不調(diào)節(jié)。可以進(jìn)行分批發(fā)酵、半分批發(fā)酵或連續(xù)培養(yǎng)?？梢栽诎l(fā)酵最初開始時(shí)引入營養(yǎng)素，或以半連續(xù)或連續(xù)方式進(jìn)行隨后加料。可以通過實(shí)施例中所描述的方法從生物體中分離酶，或者在反應(yīng)中使用酶粗提物?？梢杂弥亟M方法制備本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)或其功能生物活性片段，通過培養(yǎng)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的微生物，適用的情況下誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)，而且從培養(yǎng)液中分離所述蛋白質(zhì)。如杲需要，也可以通過此種方法在工業(yè)上生產(chǎn)蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^已知方法培養(yǎng)和發(fā)酵重組孩1生物。例如細(xì)菌可以在20-40。C,pH6-9條件下，在TB培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基中繁殖。合適的培養(yǎng)條件例如在T.Maniatis,E.F.Fritseh和J.Sambrook，分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作手冊，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中詳細(xì)描述。如果本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)并非分泌至培養(yǎng)基中，那么就要破壞細(xì)胞，通過已知的蛋白質(zhì)分離方法從溶菌產(chǎn)物中獲得產(chǎn)品。正如所預(yù)期的，通過高頻超聲、高壓(例如在弗氏壓碎器中)、滲透、使用去污劑、水解酶或有機(jī)溶劑、勻漿等手段，或通過所列出的方法中兩個(gè)或更多的組合來破壞細(xì)胞。本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)可以用已知的層析方法純化，例如分子篩層析(凝膠過濾法)，例如Q瓊脂糖層析，離子交換層析和疏水層析，以及使用其它常用方法，例如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析和非變性凝膠電泳。合適的方法在例如Cooper,F.G"BiochemischeArbeitsmethoden，VerlagWalterdeGruyter,Berlin,NewYorkorinScopes,R.，蛋白質(zhì)純化，SpringerVerlag，NewYork,Heidelberg,Berlin中描述。通過載體系統(tǒng)或寡核苷酸分離重組蛋白質(zhì)可能有利，所述寡核苷酸以特定核苷酸序列延伸了cDNA,從而編碼改變的多肽或融合蛋白質(zhì)，可用于例如簡化純化。此類合適的修飾的實(shí)例是作為錨起作用的"標(biāo)簽"，例如六組氨酸錨的修飾、或能夠作為抗原被抗體識別的表位(例如在Harlow,E.和Lane,D.，1988，抗體:實(shí)驗(yàn)室操作手冊，ColdSpringHarbor(N.Y.)Press中描述)。其它合適的標(biāo)簽是例如HA、鉤調(diào)節(jié)蛋白-BD、GST、MBD;幾丁質(zhì)-BD、鏈霉親和素-BD-avi-標(biāo)簽、Flag-標(biāo)簽、T7等等。這些錨可以用于將蛋白質(zhì)附著在固體栽體上，例如聚合體基質(zhì)，例如其可填充到層析柱中，或用于微孔滴定板或其它載體。相應(yīng)的純化方法可以從商品化的親和標(biāo)簽供應(yīng)商那里獲得。如所述制備的蛋白質(zhì)可以作為融合蛋白直接使用或切割除去融合配偶體后以"純化的"疏水蛋白使用。當(dāng)需要移除融合配偶體時(shí)，推薦在融合蛋白中疏水蛋白部分和融合配偶體部分之間摻入潛在的切割位點(diǎn)(蛋白酶的特定識別位點(diǎn))。合適的切割位點(diǎn)具體包括通過生物信息學(xué)工具能夠確定的那些否則將既不存在于疏水蛋白部分也不存在于融合配偶體部分中的肽序列。尤其合適的是例如在甲硫氨酸的BrCN切割或蛋白酶介導(dǎo)的Xa因子切割、腸激酶切割、凝血酶、TEV切割(煙草蝕紋病毒蛋白酶)?？砂l(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒可以在發(fā)泡之前或之后涂布疏水蛋白，例如通過用L6dige攪拌混合器在圓筒中涂布疏水蛋白，或者通過例如浸漬或噴霧法用含有疏水蛋白的溶液接觸所述聚合體顆粒表面。通過擠壓含有發(fā)泡劑的熔化物的制備方式還包括向水下裝置的水回路中加入疏水蛋白?？砂l(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒優(yōu)選用濃度為1-100g/l和pH值在5-9范圍內(nèi)的疏水蛋白的水溶液包被。含有疏水蛋白的溶液通常在0-140。C溫度范圍，優(yōu)選在30-80'C范圍內(nèi)應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的可發(fā)和膨脹型熱塑性聚合體顆粒是抗靜電的，其在發(fā)泡過程中結(jié)塊的傾向較低，但是當(dāng)發(fā)泡后塑形時(shí)有很好的融合性。實(shí)施例實(shí)施例1克隆yaad-HisJyaaE-His^的準(zhǔn)備工作用寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。所使用的模板DNA是枯草芽孢桿菌基因組DNA。獲得的PCR片段包含枯草芽孢桿菌yaaD/yaaE基因的編碼序列，和分別在其末端的Ncol和BglII限制性切割位點(diǎn)。純化PCR片段，并用限制性內(nèi)切酶NcoI和BglII切割。此DNA片段用作插入片段克隆到來自Qiagen的載體pQE60中，該載體預(yù)先用限制性內(nèi)切酶Ncol和BglII線性化。這樣獲得的載體pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5分別用于表達(dá)含有YAAD::HIS6和YAAE::HIS6的蛋白質(zhì)。Hal570:gcgcgcccatggctcaaacaggtactgaHal571:gcagatctccagecgcgttcttgcatacHal572:ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc實(shí)施例2yaad疏水蛋白DewA-Hist的克隆用寡核苷酸KaM416和KaM417進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。所使用的模板DNA是構(gòu)巢曲霉基因組DNA。獲得的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的編碼序列，和N-末端因子Xa蛋白酶切割位點(diǎn)。純化PCR片段，并用限制性內(nèi)切酶BamHI切割。此DNA片段用作插入片段克隆到載體pQE60YAAD#2中，該載體預(yù)先用限制性內(nèi)切酶BglII線性化。這樣獲得的載體#508用于表達(dá)含有YAAD::Xa::dewA::HIS6的融合蛋白質(zhì)。KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC實(shí)施例3vaad疏水蛋白RodA-His^的克隆質(zhì)粒#513的克隆類似于質(zhì)粒#508,使用寡核苦酸KaM434和KaM435。KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG實(shí)施例4vaad疏水蛋白BASF1-His^的克隆質(zhì)粒#507的克隆類似于質(zhì)粒#508，4吏用寡核苷酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成DNA序列-疏水蛋白BASFl-(見附件)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實(shí)施例5vaad疏7jC蛋白BASF2-His^的克隆質(zhì)粒#506的克隆類似于質(zhì)粒#508,4吏用寡核苦酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成DNA序列-疏水蛋白BASF2(見附件)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實(shí)施例6vaad疏7jC蛋白SC3-His^的克隆質(zhì)粒#526的克隆類似于質(zhì)粒#508，使用寡核芬酸KaM464和KaM465。使用的模板DNA是SchyzophyllumcommunecDNA(見附錄)。KaM464:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT實(shí)施例7vaad疏水蛋白DewA-Hisi重組大腸桿菌菌林的發(fā)酵將含有表達(dá)yaad疏水蛋白DewA-His6的大腸桿菌菌林的3mlLB液體培養(yǎng)基接種于15mlGreiner管中。于37。C在振蕩器上以200rpm培養(yǎng)8小時(shí)。將1ml此預(yù)培養(yǎng)液各自接種于2個(gè)1升有塞子錐形瓶中的250mlLB培養(yǎng)基中(+100ng/ml氨節(jié)青霉素)，在37。C以180rpm振蕩培養(yǎng)9小時(shí)。將0.5升的預(yù)培養(yǎng)液(相對于水測量OD6。。^nl:10)接種于13.5升的LM培養(yǎng)基(+100網(wǎng)/ml氨芐青霉素)中，置于20升的發(fā)酵罐。在OD咖腿約3.5時(shí)添加140ml的100mMIPTG。3小時(shí)以后，將發(fā)酵罐冷卻到10°C，并通過離心除去發(fā)酵液。細(xì)胞沉淀用于進(jìn)一步的純化。實(shí)施例8重組疏水蛋白融合蛋白的純化f帶有C-末端His6標(biāo)簽的疏水蛋白融合蛋白的純化)100g的細(xì)胞沉淀(100-500mg的疏水蛋白)用50mMpH7.5的磷酸鈉緩沖液補(bǔ)足到總體積為200ml，并將沉淀重懸。懸浮液用T25型高速分散器UItraturrax(Janke和Kunkel;IKA-Labortechnik)處理10分鐘，隨后為了降解核酸，再與500單位benzonase核酸酶(Merck，Darmstadt;orderNo.1.01697.0001)在室溫培育1小時(shí)。在破壞細(xì)胞之前使用玻璃萃取柱(P1)進(jìn)行過濾。為了破壞細(xì)胞和剪斷剩余的基因組DNA,用勻漿器在1500巴進(jìn)4亍2次處理(MicrofluidizerM-110EH;MicrofluidicsCorp.)。將勻漿液離心(SorvallRC-5B，GSA轉(zhuǎn)子，250ml離心筒，60分鐘，4°C，12000rpm，23000g)，上清置于水上，用100mlpH7.5的磷酸鈉緩沖液重懸沉淀。重復(fù)3次離心和重懸，在第3次重復(fù)時(shí)磷酸鈉緩沖液中包含1%SDS。重懸以后，將溶液攪拌1小時(shí)，然后進(jìn)行最終離心(SorvallRC-5B，GSA轉(zhuǎn)子，250ml離心筒，60分鐘，4。C，12000rpm，23000g)。根據(jù)SDS-PAGE分析，疏水蛋白存在于最終離心的上清液部分(圖1)。實(shí)驗(yàn)顯示疏水蛋白可以以包涵體的形式存在于相應(yīng)大腸桿菌中。50ml含疏水蛋白的上清液應(yīng)用于以50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液平衡的50ml鎳-瓊脂糖高性能17-5268-02柱(Amersham)。用50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液洗柱，隨后用包含200mM咪唑的50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液洗脫疏水蛋白。為了去除咪唑，溶液用50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液透析。圖1描述所制備的疏水蛋白的純化1泳道應(yīng)用于鎳-瓊脂糖柱的溶液(l:10稀釋)2泳道流出液=清洗步驟的洗脫液3-5泳道洗脫級分的OD280峰圖1的疏水蛋白分子量約為53kD。一些較小條帶代表疏氷蛋白的降解產(chǎn)物。實(shí)施例9性能測試疏水蛋白改變水滴在玻璃上接觸角的特性基質(zhì)玻璃(窗玻璃，SttddeutscheGIas，Mannheim,Germany):-疏7jc蛋白濃度100pg/mL畫玻璃片在50mMpH4的醋酸鈉+0.1%聚氧乙烯(20)去水山梨醇單月桂酸S旨(Tween⑧20)中培育過夜(溫度80°C)-隨后包被，在蒸餾水中清洗-然后于80。C在1。/。十二烷基琉酸鈉(SDS)的蒸餾水溶液中培育10分鐘-在蒸餾水中清洗樣品在空氣中干燥，且在室溫下測定5水滴的接觸角(單位為度)。接觸角的測量用03131^8^接觸角系統(tǒng)(^^15+儀器，軟件為SCA20.2.0.(2002年11月)。根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行測量。未處理的玻璃接觸角為30±5。，以根據(jù)實(shí)施例8的功能性疏水蛋白(yaad-dewA-his6)包被的玻璃接觸角為75±5。。實(shí)施例10和11以疏水蛋白pQE60+YaaD+Xa+dewA+HIS6包被EPS小珠包4皮劑疏水蛋白pQE60+YaaD+Xa+dewA+HIS6(SEQIDNO:19)的水溶液，根據(jù)實(shí)施例8進(jìn)4亍預(yù)處理(50mMNaH2P04，pH7.5，疏水蛋白濃度6.08g/l)。未包被的可發(fā)型聚苯乙烯(EPS)小珠直徑在0.7-1.0mm范圍內(nèi)，其通過懸浮聚合(StyroporF315/N)的方法制備，按如下方法進(jìn)行干燥和包被稱量50gEPS小珠置于500ml有旋轉(zhuǎn)瓶蓋的玻璃瓶中，分別與10ml和20ml的疏水蛋白溶液混合，并且在滾筒混合器中室溫?cái)嚢?4小時(shí)。然后用濾紙濾出疏水蛋白包被的EPS小珠，在室溫干燥5小時(shí)。比較實(shí)驗(yàn)VI重復(fù)實(shí)施例IO，但是不同之處在于用10ml蒸餾水代替疏水蛋白溶液。實(shí)施例10和11以及比較實(shí)驗(yàn)中包被的EPS小珠，各自在預(yù)膨脹器(Rauscher)中于100。C預(yù)發(fā)泡2分鐘，以形成聚苯乙烯泡沫珠，并且在存儲(chǔ)3天后融合塑形。通過在存儲(chǔ)2天以后破壞塑形的一半來評估塑形的品質(zhì)。通過測量預(yù)發(fā)泡和干燥的聚苯乙烯泡沫珠的表面電阻來評估抗靜電特性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>序列表中DNA和多肽序列的序列名<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>權(quán)利要求1.具有含疏水蛋白的包被的可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒。2.根據(jù)權(quán)利要求l的可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其中基于熱塑性聚合體，該包被包含1-5000ppm的疏水蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求l的可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其中熱塑性聚合體由聚苯乙烯或聚烯烴組成。4.根據(jù)權(quán)利要求1到3的任一項(xiàng)的可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其平均顆粒直徑在0.05-5mm范圍內(nèi)。5.根據(jù)權(quán)利要求1到4的任一項(xiàng)的可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其中該包被包含通式(II)的疏水蛋白(11)，其中X是任意的20個(gè)天然存在的氨基酸，n和m是0-500之間的數(shù)值，C是半胱氨酸。6.根據(jù)權(quán)利要求4的可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其中該包被包含通式(III)的疏水蛋白Xn-C、X5-9-C2-C3-Xu-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm(III)。7.根據(jù)權(quán)利要求1到4的任一項(xiàng)的可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，其中該包,皮包含dewA、rodA、hjypA、hypB、sc3、basfl或basf2型疏水蛋白。8.包^f皮可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒的方法，其中將聚合體顆粒的表面與含疏水蛋白的溶液接觸。9.根據(jù)權(quán)利要求1到4的任一項(xiàng)的方法，其中所使用的含疏水蛋白的溶液是疏水蛋白濃度為1-100g/1且pH值在5-9范圍內(nèi)的水溶液。10.根據(jù)權(quán)利要求1到5的任一項(xiàng)的方法，其中將該表面在0-140。C溫度范圍內(nèi)與含疏7JC蛋白的溶液接觸。全文摘要本發(fā)明涉及具有包被的可發(fā)或膨脹型熱塑性聚合體顆粒，所述包被包含疏水蛋白，尤其是通用結(jié)構(gòu)式(I)的蛋白質(zhì)X_n-C¹-X_1-50-C²-X_0-5-C³-X_1-100-C⁴-X_1-100-C⁵-X_1-50-C⁶-X_0-5-C⁷-X_1-50-C⁸-X_m(I)，其中X代表任意的20個(gè)天然存在的氨基酸，n和m代表0-500之間的數(shù)值，且C代表半胱氨酸。本發(fā)明還涉及所述顆粒作為抗靜電劑的用途。文檔編號C08J9/00GK101189290SQ200680020055公開日2008年5月28日申請日期2006年6月9日優(yōu)先權(quán)日2005年6月10日發(fā)明者C·博爾施韋勒,C·?？怂辜{,H-G·勒邁爾,J·霍洛赫,M·考羅什,T·薩布科夫斯基,U·鮑斯申請人:巴斯福股份公司