專利名稱：在低溫下用疏水蛋白涂覆物體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用疏水蛋白涂覆物體的方法。更具體地，本發(fā)明特別涉及用于穩(wěn)定疏水蛋白涂層的新方法等。
疏水蛋白通常是一類來自真菌或細菌的小的分泌性的富含半胱氨酸的蛋白，當其遇到親水-疏水界面時就能組裝成兩親性層。一些疏水蛋白形成不穩(wěn)定的兩親性層，而其他的疏水蛋白形成極為穩(wěn)定的兩親性層。通過在細胞壁-空氣界面上的組裝，一些疏水蛋白已經(jīng)顯示出能給氣生菌絲和孢子提供疏水性表面，其具有小棒狀的超結(jié)構(gòu)外觀。一些疏水蛋白已經(jīng)顯示出能在水和空氣、水和油、或水和疏水性固體之間的界面上組裝成兩親性層。疏水蛋白是真菌的最豐富的分泌性蛋白之一，個別菌種可以包含數(shù)個產(chǎn)不同疏水蛋白的基因，可能作用于特異的目的。疏水蛋白現(xiàn)在已經(jīng)涉及于各種發(fā)育過程，例如氣生菌絲、子實體和分生孢子的形成；并且其可能在真菌生態(tài)學(xué)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括孢子傳播、致病和共生；以及可能參與附著現(xiàn)象。
經(jīng)典已知的疏水蛋白(見例如WO 96/411882，其也提供了獲得遺傳學(xué)修飾的疏水蛋白樣物質(zhì)的指導(dǎo))通常是長度最長為125個氨基酸的蛋白，其具有保守序列Xn-C-X5-9-C-C-X11-39-C-X8-23-C-X5-9-C-C-X6-18-C-Xm，其中X代表任何一種氨基酸，n和m分別代表一個整數(shù)。最經(jīng)典的疏水蛋白含有上面所提及的8個保守的半胱氨酸殘基，它們形成了四個二硫鍵。但是，當用化學(xué)修飾還原疏水蛋白的二硫鍵并用例如碘乙酰胺阻斷巰基時，蛋白可以在缺乏親水-疏水界面的水中進行組裝。該結(jié)構(gòu)與在水-空氣界面上所組裝出的天然的疏水蛋白的結(jié)構(gòu)是不可區(qū)分的。疏水蛋白的二硫鍵顯然維持了疏水蛋白在水中的可溶性，例如在產(chǎn)疏水蛋白的細胞內(nèi)或在培養(yǎng)基中，其容許疏水蛋白在親水-疏水界面上的自組裝，但是這對于提供它們本身的兩親性的特性并不是必需的。
至今為止已經(jīng)物理分離到的所有疏水蛋白都能在親水-疏水界面上組裝成兩親性膜。疏水蛋白膜的一側(cè)是中度到高度親水的(例如其所具有的水接觸角的范圍是在22°和63°之間)，而另一側(cè)暴露出水接觸角范圍例如是在93°和140°之間的表面，這說明其具有與例如聚四氟乙烯(PTFE或Teflon)或石蠟油(水接觸角約為110°-120°)相同強的親水性。經(jīng)典的或I型疏水蛋白(裂褶菌的SC3和SC4疏水蛋白)所形成的膜是高度不可溶的(例如耐受2％十二烷基硫酸鈉(SDS)在100℃下的處理)，但是可以被例如甲酸(FA)或三氟乙酸(TFA)的試劑所解離。相反地，II型疏水蛋白(荷蘭榆病(Ophiostoma ulmi)的Cerato-ulmin(CU)和栗疫病(Cryphonectria parasitica)的Cryparin(CRP))在60％乙醇以及在2％SDS中就容易被解離，同時也已知通過施用壓力或通過冷卻可以解離所組裝的CU。
因為在界面上自組裝成兩親性蛋白層，因此疏水蛋白可以改變表面的可濕性。如所述的那樣，一種測定可濕性的方法是通過評價或測定水滴與表面之間形成的接觸角。大的接觸角代表更疏水的表面，小的接觸角代表更親水的表面。此外，在氣/液中，例如在強烈搖晃的水或液/液系統(tǒng)中，例如在水包油或油包水的分散相中，疏水蛋白溶液中的氣泡或油滴可以被穩(wěn)定它們的兩親性層所涂覆。固/液界面表現(xiàn)出相同的穩(wěn)定作用。例如，當一張浸泡在疏水蛋白溶液中的疏水性塑料例如PTFE被強附著性蛋白層所涂覆時，使得表面成為完全可濕性的表面(接觸角40°-55°)，甚至在熱SDS處理之后，并且附著在親水性表面上的疏水蛋白使得表面成為更少親水的，或者甚至成為更疏水的。
疏水蛋白的自組裝都伴有構(gòu)象變化(De Vocht等(1998)疏水蛋白SC3作為單體以及在疏水/親水界面上的自組裝后的結(jié)構(gòu)特征。生物物理雜志742059-2068)。單體的I型疏水蛋白富含β鏈。在水-空氣界面上，I型疏水蛋白更容易顯示出β折疊結(jié)構(gòu)(稱作為β折疊態(tài))的增加，而在水和疏水性固體之間的界面上，觀察到了具有α螺旋數(shù)目增多的形式(α螺旋態(tài)或α態(tài))。但是，這種II型疏水蛋白的α螺旋層可以被快速地洗脫掉。α螺旋態(tài)似乎是一種自組裝的中間物，而β折疊態(tài)可能是穩(wěn)定的終末形式。
在水-空氣界面上，根據(jù)條件，I型疏水蛋白的單體在數(shù)秒鐘內(nèi)就達到了α螺旋態(tài)，但是向β折疊態(tài)的轉(zhuǎn)換則更慢并要花費數(shù)分鐘。在水-固體界面上，形成了疏水蛋白層，其中蛋白也容易達到α螺旋態(tài)。隨后，α螺旋態(tài)能進行向穩(wěn)定的β折疊終末態(tài)的轉(zhuǎn)變，通常是在存在去垢劑時將疏水蛋白層暴露于升高的溫度(例如30℃或更高的溫度)(見WO 01/57528)之后。一般在pH值為7左右進行加熱處理。從已知疏水蛋白的時候開始，就已經(jīng)聯(lián)合加熱使用去垢劑。推測高溫導(dǎo)致了涂層中所存在的疏水蛋白分子的去穩(wěn)定性和靈活性。這種去穩(wěn)定性促成了實現(xiàn)導(dǎo)致強不可溶性涂層的構(gòu)象重排。溫度越高，轉(zhuǎn)化發(fā)生的越快。例如，將物體與含疏水蛋白的溶液相接觸，這樣在物體的表面上就形成了疏水蛋白層。然后，在加入去垢劑之后，將溫度升高到60℃或甚至更高的溫度例如升高到80℃。因此，可以用熱處理增強物體表面上的穩(wěn)定的疏水蛋白涂層的形成。但是，從經(jīng)濟和實用的觀點出發(fā)，熱處理是非常不吸引人的。例如，對于所涂層的物體是大物體(例如船殼)或是對熱敏感的物體時，通常不愿將所涂覆的物體加熱到升高的溫度例如80℃左右。因此，本發(fā)明者開始尋找不同于升高溫度的能用于獲得物體表面上的穩(wěn)定的疏水蛋白涂層的條件。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)在有去垢劑的低pH值和沒有去垢劑的低pH值、高濃度疏水蛋白、延長溫育和/或存在緩沖劑時，也可以在低溫(即低于30℃)下獲得不穩(wěn)定的疏水蛋白層向穩(wěn)定涂層的轉(zhuǎn)化。因此，本發(fā)明涉及一種方法，其用于優(yōu)化用于通過將所述表面的至少一部分與含疏水蛋白的溶液在低溫下接觸而為物體表面提供疏水蛋白涂層的條件，其包括確定出至少兩個參數(shù)對所述物體表面上的疏水蛋白層的形成的影響，其中所述參數(shù)選自pH值、溫育時間、在所述含疏水蛋白的溶液中的疏水蛋白濃度以及在所述溶液中的緩沖劑的存在情況。
用各種方法可以確定出參數(shù)對在物體表面上形成疏水蛋白層的影響。這些方法包括接觸角測定法和圓二色性光譜法(見下面的實施例)。
在第一個方面，本發(fā)明提供了低pH值增強疏水蛋白層的穩(wěn)定性的一個觀點。因此，本發(fā)明提供了一種為物體表面提供疏水蛋白涂層的方法，其包括在任選地存在去垢劑的條件下，將物體的至少一部分與含疏水蛋白的溶液相接觸使得在所述表面的表面上形成疏水蛋白層，并將所述層暴露于一pH值，該pH值小于7，優(yōu)選地小于4，更優(yōu)選地小于2。
用本發(fā)明的方法可以涂覆多種不同類型的物體，或至少它們的一部分。實例為玻璃表面例如窗戶、接觸鏡、生物傳感器、醫(yī)療器械、用于進行檢測或儲存的容器、船體或汽車框架或車體、固體顆粒、織物(例如衣物)、多孔物體或材料等等。
從經(jīng)濟學(xué)觀點看，在此所提供的方法是非常優(yōu)越的，因為降低pH值常常比加熱升高溫度更為容易。本領(lǐng)域已知的增強形成穩(wěn)定的疏水蛋白涂層的熱去垢劑處理已經(jīng)使得表面上丟失了10-30％疏水蛋白，這伴隨著涂層內(nèi)小孔的出現(xiàn)。Janssen等(2003)[“Promotion of fibroblast activityby coating with hydrophobins in the βsheet end state”，M.I.Janssen，M.B.M.van Leeuwen，T.G.van Kooten，J.de Vries，L.Dijkhuizen和H.A.B.Wsten，Biomaterials.2004Jun；25(14)2731]報告說α-螺旋狀SC3形成了一個均一層，而升高溫度所誘導(dǎo)的β折疊狀SC3涂層是不連續(xù)的。低pH值處理比熱去垢劑處理更為溫和是可想而知的。
術(shù)語“疏水蛋白”在此不僅指的是如上所定義的經(jīng)典的疏水蛋白，還包括能涂覆表面使得疏水表面基本上親水的或反過來使得親水表面基本上疏水的基本上兩親性蛋白，并且其不僅包括從自然界分離到的疏水蛋白，還包括通過遺傳學(xué)修飾基因獲得遺傳學(xué)修飾的蛋白而獲得的自然界中不存在的但仍具有或已經(jīng)具有所需的兩親性特性的物質(zhì)。
術(shù)語“疏水蛋白層”被理解為一種兩親性疏水蛋白層或膜，其基本上具有疏水蛋白處于α螺旋構(gòu)象的特征，即在室溫和中性pH值下，用去垢劑可以將其溶解。
術(shù)語“疏水蛋白涂層”指的是一種兩親性疏水蛋白膜，其具有疏水蛋白處于β折疊構(gòu)象的特征，即其對于室溫下的去垢劑處理是穩(wěn)定的或耐受的。不受理論的束縛，疏水蛋白周圍溶液的低pH值可以引起與升高溫度所引起的相似的疏水蛋白的去穩(wěn)定作用。對于淀粉樣肽，已經(jīng)描述了通過降低pH值或通過增加鹽濃度都可以獨自地誘導(dǎo)出纖絲(fibril)。這些條件對于可溶性的淀粉樣肽都具有去穩(wěn)定作用，使得可溶性的淀粉樣肽組裝成纖絲結(jié)構(gòu)。對于淀粉樣分子，形成纖絲并不需要去垢劑。此外，這個過程可以單獨地在水中進行。疏水蛋白的活性與界面相關(guān)，優(yōu)選地是親水/疏水的例如空氣/水、油/水和固體/水的界面。疏水蛋白共享有其他淀粉樣蛋白的多種特性(Butko等，2001，Spectroscopic evidence foramyloid-like interfacial self-assembly o hydrophobin SC3，Biochem.Biophys.Res.Commun.280212-215；Wsten and de Vocht 2000，Hydrophobins，thefungal coat unraveled.Biochim.Biophys.Acta 146979-86；McKay et al.2001，The hydrophobin EAS is largely unstructured in solutions and functionsby forming amyloid-like structures.Structure 983-91)，盡管氨基酸水平的相似性并不明顯。
根據(jù)本發(fā)明，通過將物體表面上的疏水蛋白層或其一部分暴露于低于7、優(yōu)選地低于4、更優(yōu)選地低于2的pH值，可以實現(xiàn)向β狀的轉(zhuǎn)換?？梢栽谑覝刈笥疫M行這個轉(zhuǎn)換。例如，在低于30℃的溫度(例如溫度僅為25℃、20℃或15℃或更低)下，在低pH值就可以形成穩(wěn)定的涂層。假定如果使用去垢劑并且去垢劑仍有效時，可以使用低至5℃或甚至更低的溫度。一般而言，對于多種應(yīng)用，室溫或環(huán)境溫度左右的溫度當然是最可行的，因為這不需要任何加熱或冷卻。
低pH值誘導(dǎo)組裝的另一個主要優(yōu)點是可以單一步驟實現(xiàn)組裝。相反地，如果聯(lián)合去垢劑使用提高溫度，只有在溫度更高時才加入去垢劑，否則疏水蛋白將會被沖洗掉。令人驚訝的是，無論是否存在去垢劑，降低pH值都足以形成穩(wěn)定的疏水蛋白涂層。
在沒有去垢劑時，可發(fā)生空氣-水界面上的疏水蛋白α螺旋態(tài)向β折疊態(tài)的轉(zhuǎn)換。對于物體表面上的相似的(即同樣快的)轉(zhuǎn)換，則需要去垢劑的存在，這可能是因為這使得在轉(zhuǎn)換發(fā)生之前疏水蛋白在該表面上是可流動的，而在轉(zhuǎn)換之后，疏水蛋白不能再被去垢劑溶解。如在此所例舉的，向β態(tài)的轉(zhuǎn)換速度依賴于溫度和pH值。在pH值為2、15℃時，30分鐘內(nèi)就能在PTFE上形成SC3的穩(wěn)定涂層，而在pH值為2、25℃或更高溫度時，即刻就能形成涂層(見表1)。
疏水蛋白是已知的最強的生物表面活性劑之一，它能修飾固體的表面性能以及穩(wěn)定水中的氣泡和油滴。它們形成兩親性層并有效地附著于天然的和人造的表面上。例如，PTFE可以被非常穩(wěn)定的疏水蛋白層所涂覆，并且每平方米只需數(shù)毫克。在組裝作用之后，形成了高度有序的結(jié)構(gòu)、纖絲和薄膜。因為表面活性和自組裝的雙重性能，疏水蛋白與多種不同的應(yīng)用高度相關(guān)。例如，已經(jīng)建議用疏水蛋白涂層例如生物傳感器的表面以修飾所述表面的疏水/親水性能。應(yīng)當仔細地處理含疏水蛋白的溶液，因為例如搖晃的動作會形成含疏水蛋白組裝物的混濁溶液，這影響了對表面的均一涂覆。此外，對于疏水蛋白的大規(guī)模應(yīng)用，需要工業(yè)規(guī)模的方法純化含疏水蛋白的溶液(例如發(fā)酵培養(yǎng)物的生長培養(yǎng)基)中所具有的疏水蛋白。本領(lǐng)域的現(xiàn)有方法都依賴于TFA的應(yīng)用，因為環(huán)境和安全性的原因，這并不令人滿意的。更為重要的是，在產(chǎn)所述疏水蛋白(例如S.commune)的生物體的生長或培養(yǎng)培養(yǎng)基中的疏水蛋白(例如SC3)的產(chǎn)量可以高達每升50mg或更高，已知的純化方案可以導(dǎo)致產(chǎn)物丟失最多達90％。通常用起泡法或離心從培養(yǎng)基中分離出組裝的疏水蛋白。純化方案中最為無效的步驟是用TFA從原始的疏水蛋白沉淀物中提取或溶解出疏水蛋白。
令人驚訝的是，作為本發(fā)明的另一個方面，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如果將疏水蛋白直接用作涂層物質(zhì)，就不再需要從培養(yǎng)基中純化出疏水蛋白，因為培養(yǎng)基中的疏水蛋白濃度通常足夠高到能直接使用培養(yǎng)基。對生產(chǎn)生物體的選擇顯然會影響到疏水蛋白在所分泌的蛋白中的優(yōu)勢性。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種為物體表面提供疏水蛋白涂層的方法，包括在任選地存在去垢劑的條件下，將物體的至少一部分與分泌疏水蛋白的生物體的培養(yǎng)基(培養(yǎng)物上清液)在pH值低于7，優(yōu)選地低于4，更優(yōu)選地低于2時接觸。
上清液也被稱作為培養(yǎng)物上清液或涂層溶液，在此所用的上清液來源于液體培養(yǎng)基或生長培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基已經(jīng)被用于培養(yǎng)或生長生物體一段特定的時間，所述生物體生產(chǎn)并分泌疏水蛋白到培養(yǎng)基中，使得培養(yǎng)基含有特定量的疏水蛋白。在特定的培養(yǎng)時間之后，通常通過從生物體中分離出培養(yǎng)基(含有疏水蛋白)(例如通過用布料過濾培養(yǎng)基)制備培養(yǎng)物上清液。此外，可以在將上清液與所涂層的物體的表面接觸之前，從培養(yǎng)物上清液中去除化合物或污染物，例如通過透析。
本發(fā)明的方法適合使用不同類型的分泌疏水蛋白的生物體的培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述生物體是真菌，更優(yōu)選地是擔子菌裂褶菌。其他合適的生物體包括雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)、側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)、黑王球(Coprinus cinereus)、香菇(Lentinula edodes)、楊樹菇(Agrocybeaegerita)、彩色豆包菌(Pisolithus tinctorius)、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、溝巢曲霉(Aspergillus nidulans)、煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、綠僵菌(Metarhizium anisopliae)、Xanthoria ectaneoides、石黃衣(Xanthoria parietina)、葉霉菌(Cladosporiumfulvum)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、和經(jīng)(遺傳學(xué))加工為產(chǎn)疏水蛋白的菌株。
為了保證在物體的表面上有足夠多的疏水蛋白組裝成疏水蛋白層，培養(yǎng)物上清液中的疏水蛋白含量應(yīng)當為每升至少2mg疏水蛋白，優(yōu)選地至少5mg/l，更優(yōu)選地至少10mg/l，或甚至更高的濃度。
在一個優(yōu)選的實施方式中，用包括去垢劑的含疏水蛋白的培養(yǎng)物上清液在低pH值下接觸物體，使得在所述物體的表面上形成疏水蛋白涂層。在完成培養(yǎng)期之后(例如在收集之前)，可以向培養(yǎng)基或上清液中加入去垢劑。但是，優(yōu)選地是在培養(yǎng)生物體期間，在培養(yǎng)基內(nèi)具有去垢劑，這樣就使得一旦疏水蛋白被分泌到培養(yǎng)基內(nèi)就可以阻止疏水蛋白的自組裝。至今為止，可以在培養(yǎng)生物體之前或在培養(yǎng)期間向培養(yǎng)基內(nèi)加入去垢劑?；蛘?，產(chǎn)疏水蛋白的生物體可以生產(chǎn)并分泌具有去垢劑樣功能的化合物，使得不需要加入外源性去垢劑。當用攪拌培養(yǎng)(與靜態(tài)培養(yǎng)相反)生產(chǎn)疏水蛋白時，在培養(yǎng)期間具有去垢劑是特別有用的，因為已知攪拌正常地引起疏水蛋白的組裝并因此使得蛋白或含蛋白的培養(yǎng)基不適用于涂層。在本發(fā)明的一個方法中，去垢劑的存在阻止了培養(yǎng)物上清液中的疏水蛋白的自組裝。
去垢劑分子的特征是具有一個親水的“頭”區(qū)和一個疏水的“尾”區(qū)。這種特征的結(jié)果是在水溶液中形成了具有疏水核心的熱力學(xué)穩(wěn)定的微粒。該疏水核心提供了容許分解疏水的分子或蛋白結(jié)構(gòu)域的環(huán)境。去垢劑也被叫做兩親性化合物或表面活性劑?！氨砻婊钚詣笔恰氨砻婊钚栽噭钡暮唽懀且环N降低表面張力的分子。這些分子都含有疏水和親水的組分，因此其在有機溶劑和水溶劑中都是半可溶的。
可以向培養(yǎng)物上清液中加入不同類型的去垢劑。去垢劑的實例是APO-10、APO-12、BRIJ-35(C12E23)、C8E6、C10E6、C10E8、C12E6、C12E8(Atlas G2127)、C12E9、C12E10(Brij 36T)、C16E12、C16E21、環(huán)己基-正乙基-β-D-麥芽苷、環(huán)己基-正己基-β-D-麥芽苷、環(huán)己基-正甲基-β-D-麥芽苷、正癸酰蔗糖、正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-β-D-吡喃麥芽糖苷、正癸基-β-D-硫代麥芽糖苷、洋地黃皂甙、正十二烷基蔗糖、正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基-β-D-麥芽糖苷、GenapolC-100、Genapol X-80、Genapol X-100、HECAMEG、庚烷基-1，2，3-三醇、正庚基-B-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-B-D-硫代吡喃葡萄糖苷、LUBROLPX、MEGA-8(辛酰-N-甲基葡胺)、MEGA-9(壬酰-N-甲基葡胺)、MEGA-10(十二烷基-N-甲基葡胺)、正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、NonidetP-10(NP-10)、Nonidet P-40(NP-40)、正辛酰基-β-D-葡萄糖胺(NOGA)、正辛酰蔗糖、正辛基-α-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-吡喃麥芽糖苷、PLURONICF-68、PLURONIC F-127、THESIT、TRITON X-100(tert-C8--E9.6；類似NP-40)、氫化的TRITON X-100、TRITONX-114(tert-C8--E7-8)、TWEEN 20(C12-山梨聚糖-E20；Polysorbate 20)、TWEEN 40(C16-山梨聚糖-E20)、TWEEN 60(C18-山梨聚糖-E20)、TWEEN80(C181-山梨聚糖-E20)和正十一烷基-β-D-麥芽糖苷。長鏈或高分子量(＞MW 1000)去垢劑的代表性實例包括明膠、酪蛋白、卵磷脂(磷脂)、阿拉伯膠、膽固醇、西黃蓍膠、聚氧乙烯烷醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯(例如商品化獲得的Tweens)、聚乙二醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、二氧化硅膠體、磷酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、羧氧基纖維素鈣、羧氧基纖維素鈉、甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、微晶纖維素、硅酸鎂鋁、聚乙烯醇(PVOH)和聚乙烯吡咯烷(PVP)。低分子量(MW＜1000)去垢劑包括硬脂酸、氯化苯甲烴銨、硬脂酸鈣、單硬脂酸甘油酯、十八醇十六醇混和物、聚西托醇乳化蠟、和山梨糖酯。
根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)去垢劑的類型、生物體和培養(yǎng)條件，所具有的去垢劑或表面活性劑的濃度是至少0.001％重量/體積、優(yōu)選地至少0.01％重量/體積、更優(yōu)選地至少0.1％體重/體積。
當然，根據(jù)本發(fā)明，如果在存在去垢劑(生物體僅僅很少程度地代謝或降解去垢劑，優(yōu)選地根本不降解去垢劑)時培養(yǎng)生物體是最合適的。如果去垢劑在培養(yǎng)過程中被代謝，就要求在培養(yǎng)期間重新補充去垢劑。另外，去垢劑優(yōu)選地對生物體的生長或疏水蛋白的生產(chǎn)及分泌不具有抑制作用。不容置疑的是，去垢劑也應(yīng)當能(如在下所討論的，聯(lián)合升高溫度或降低pH值)穩(wěn)定疏水蛋白層，使得形成涂層。合適的去垢劑是那些在用于提供物體表面上的疏水蛋白涂層的方法中通常所用的去垢劑，例如TritonX100、PVOH、Tween-20、Tween-80和SDS。
在存在去垢劑時，疏水蛋白將不會附著到PFTE表面。因此，接觸角的變化與附著到表面上的蛋白的量直接相關(guān)(見例如實施例2和4)。但是，在沒有去垢劑時，接觸角和所附著的疏水蛋白的量之間沒有直接的相關(guān)性。因此，如接觸角所說明的那樣，通過確定接觸角的變化以及對去垢劑(例如0.1％Tween20，pH值7，見實施例10-12)洗滌的耐受性就可以測定出在沒有去垢劑時的涂層的質(zhì)量，而不用定量附著到表面上的疏水蛋白的量。
在尋找在溫和溫度或低溫下增強疏水蛋白涂層形成的條件中，驚奇地發(fā)現(xiàn)涂覆溶液中的疏水蛋白濃度也是一種影響物體表面上的疏水蛋白涂層形成的因素，所用濃度越高，形成涂層就越快。例如，在沒有去垢劑時，用300μg/ml疏水蛋白的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)溶液在室溫下涂層PTFE片16個小時，形成了具有低水接觸角(約45度，見實施例10)的涂層。當使用僅僅5μg/ml濃度的疏水蛋白時，16個小時的溫育期形成了約55度的接觸角。但是，這個樣品是不穩(wěn)定的，因為在暴露于pH值7的Tween20之后，接觸角增加到了約90度。在300μg/ml中的3個小時的溫育形成了約55度的接觸角，這與在相同濃度中的16個小時的溫育所形成的接觸角相似。但是，與16個小時的溫育所不同的是，這種3個小時的溫育形成了不穩(wěn)定的樣品，因為在暴露于pH值7的Tween20之后，接觸角增加到了約80度。這些數(shù)據(jù)顯示當使用涂層溶液中的高濃度的疏水蛋白(例如300μg/ml)和延長溫育時間(例如16個小時)時，可以獲得涂層。另外，疏水蛋白的濃度也影響所獲得的接觸角。例如，用300μg/ml疏水蛋白的磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)溶液涂層PTFE片，在3個小時內(nèi)就形成了低的水接觸角(約45度，見實施例10)。當使用50μg/ml濃度時，3個小時的溫育形成了約70度的接觸角。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種給物體表面提供疏水蛋白涂層的方法，其包括將物體的至少一部分與含疏水蛋白的溶液相接觸使得在所述物體的表面上形成疏水蛋白涂層，其中利用濃度超過50μg/ml、優(yōu)選地超過100μg/ml、更優(yōu)選地超過300μg/ml的疏水蛋白在低于30℃的溫度下(例如室溫)、在16個小時或更長的時間內(nèi)進行所述的接觸。將物體在25℃下與含300μg/ml疏水蛋白(例如SC3)的疏水蛋白溶液相接觸，以便為物體表面提供疏水蛋白涂層。如圖6A所明確的那樣，更長的溫育時間形成了更小的接觸角，并增加了樣品的穩(wěn)定性(如用Tween20洗脫疏水蛋白的能力所證實的那樣)。
當在pH值為4的水或pH值為7的水中制備疏水蛋白溶液時，發(fā)現(xiàn)了相似的時間和濃度相關(guān)性(見實施例11和圖7)。此外，在高疏水蛋白濃度時，將涂層溶液的pH值從7降低到4造成了每種測試溶液的接觸角的降低，并增強了樣品的穩(wěn)定性。
接下來，確定緩沖劑對涂覆效率的影響。用在pH值為7的水或pH值為7的50mM磷酸鈉中所制備的疏水蛋白溶液(50、100或300μg/ml)在室溫下、在3或16個小時之內(nèi)涂層PTFE片(見實施例12)。結(jié)果(圖8)清楚地證實往涂層溶液中加入緩沖劑影響所獲得的接觸角，但不影響樣品的穩(wěn)定性。在3個小時的溫育期之后，所有測試濃度的緩沖劑的存在都降低了接觸角。在使用50或100μg/ml時，緩沖劑也影響所獲得的涂層。在加入緩沖劑之后，不能進一步降低用在pH值7中所制備的300μg/ml疏水蛋白溶液溫育16個小時后所獲得的接觸角。顯而易見的是，在這個點上，已經(jīng)達到了可最大獲得的結(jié)果，對附加參數(shù)的修飾將不能進一步地增強涂覆效率。
本發(fā)明在此提供了一種為物體表面提供疏水蛋白涂層的方法，其包括將物體的至少一部分與含疏水蛋白的溶液相接觸，以便在所述物體的表面上形成疏水蛋白層，其中所述含疏水蛋白的溶液包括一種緩沖劑。緩沖劑是一種離子化合物，它對抗其pH值的變化。緩沖溶液是一種弱酸HA和其共軛堿A-(通常加入的是鈉鹽或鉀鹽的形式，NaA或KA)的混和物?；蛘?，弱堿B和其共軛酸BH+的混和物也是一種緩沖溶液。在一個實施方式中，在磷酸緩沖液，優(yōu)選地是在磷酸鈉(NaPi)緩沖液(例如25或50mM NaPi緩沖液)中制備疏水蛋白溶液。緩沖溶液的pH值可以變化。優(yōu)選地，在低于30℃的溫度下進行所述的與緩沖的疏水蛋白溶液的接觸。在一個實施方式中，所述溶液中的疏水蛋白濃度至少是5μg/ml，優(yōu)選地至少是20μg/ml，更優(yōu)選地至少是50μg/ml，更優(yōu)選地至少是100μg/ml，甚至更優(yōu)選地是至少300μg/ml。
本發(fā)明證實各種參數(shù)都影響在溫和的溫度下的穩(wěn)定涂層的形成pH值、溫育時間、疏水蛋白濃度和緩沖劑和/或去垢劑的存在。如多個實施例在此所示的那樣，可以用任一參數(shù)或參數(shù)的組合優(yōu)化涂層條件。作為經(jīng)驗法則(thumb)的一般規(guī)律，低pH值(例如pH值4或2)、有或沒有去垢劑(例如0.1％Tween20)的存在、和高濃度疏水蛋白都提高了形成疏水蛋白涂層的速度。當然，可以聯(lián)合這些技術(shù)措施產(chǎn)生特殊狀態(tài)下的最優(yōu)化的涂層條件。例如，如果要在室溫下、最短時間內(nèi)涂覆物體，可以使用500μg/ml或更高的高濃度溶液，任選地聯(lián)合應(yīng)用低pH值和有或沒有去垢劑。當然，所涂層的表面越大，就需要更多的(純化的)疏水蛋白，要注意所用的濃度也依賴于所涂層的表面面積。因此，對于大表面的涂層，高度濃縮的涂層溶液在經(jīng)濟學(xué)上是較不吸引人的。在這些情況中，通常使用更低的疏水蛋白濃度，這就要求更長的溫育時間。例如，培養(yǎng)物上清液被便利地用作為涂層溶液。如在此所示的，在降低pH值(任選地連同添加去垢劑)之后，就可以縮短溫育時間。
在本發(fā)明的一個具體部分，通過所述表面與含疏水蛋白的溶液的接觸進行對物體的至少一部分的表面的涂覆，其中所述溶液還包括一種或多種添加物，使得在形成疏水蛋白涂層之后添加物被摻入到涂層內(nèi)。示例的添加物包括天然或合成來源的生物學(xué)活性化合物(肽激素、藥物或其他的治療分子)。摻入可以是可逆的，容許添加物從涂層中被緩慢地釋放到其周圍環(huán)境內(nèi)。在一個實施方式中，用包括添加物的疏水蛋白層所涂層的物體是一種醫(yī)療器械。例如，將導(dǎo)管與含疏水蛋白和藥物的溶液相接觸，以便提供緩慢釋放藥物的導(dǎo)管?？梢杂矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的以及在此所述的任何方法增強表面上的涂層的形成，包括降低pH值和添加去垢劑。
用于純化疏水蛋白的傳統(tǒng)方法依賴于TFA的應(yīng)用。過甲酸可以取代TFA被用于溶解組裝的疏水蛋白。Vries等(1993；Insoluble hydrophobincomplexes in the walls of Schizophyllum commune and other filamentousfungi.Arch.Microbiol 159330-335。)描述了這個方法，它用PFA溶解不可溶的SC3，以便在SDS-PAGE上分析SC3?，F(xiàn)在，發(fā)現(xiàn)經(jīng)PFA處理過的疏水蛋白被便利地用于保持含疏水蛋白的溶液中的疏水蛋白處于可溶狀態(tài)。當用圓二色性(CD)光譜法觀察時，發(fā)現(xiàn)PFA-SC3在膠狀PTFE上形成了精密的α螺旋結(jié)構(gòu)。當用碘乙酸化學(xué)修飾SC3時，De Vocht等(2000；Structural and functional role of the disulfide bridges in thehydrophobin SC3。J.Biol.Chem.27528428-28432)已經(jīng)進行了相似的觀察。
因此，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種用疏水蛋白涂層涂覆物體表面的方法，其包括將物體與一種含疏水蛋白的溶液相接觸，其中所述溶液包括已經(jīng)被PFA處理過的疏水蛋白。所述PFA處理過的疏水蛋白優(yōu)選地是冷凍干燥的(凍干的)疏水蛋白，優(yōu)選地是冷凍干燥的純化的疏水蛋白，其已經(jīng)溶解于PFA溶液中。PFA處理被認為是將疏水蛋白的半胱氨酸和二硫鍵氧化成磺酸酯。正確的二硫鍵的形成對于疏水蛋白的好的組裝是重要的。PFA對疏水蛋白的處理可以有助于溶解組裝的疏水蛋白和/或功能化無活性的疏水蛋白(例如重組生成的異源疏水蛋白，包括突變的疏水蛋白)。無活性的疏水蛋白包括沒有或具有隨機形成的二硫鍵的疏水蛋白。
根據(jù)上面所述的方法，觀察到將PFA處理過的疏水蛋白層暴露于低于7，優(yōu)選地低于4，更優(yōu)選地低于2的pH值可以用于穩(wěn)定疏水蛋白層，以便獲得堅固的涂層。
此外，發(fā)現(xiàn)PFA-SC3特異地與二價金屬離子相互作用，并且發(fā)現(xiàn)不僅低pH值能形成穩(wěn)定的疏水蛋白涂層，PFA-SC3對二價金屬離子的暴露也能形成穩(wěn)定的疏水蛋白涂層。在PFA-SC3與二價金屬離子(例如Ca2+)混和并進行相互作用之后，觀察到了溶液中的清晰的結(jié)構(gòu)變化。此外，當往該混和物中加入膠狀PTFE時，沒有觀察到α螺旋態(tài)，但疏水蛋白層顯示出處于非常類似于β折疊涂層態(tài)的狀態(tài)。在沒有去垢劑以及在室溫時觀察到了這一點。顯然通過添加鈣離子可以使得半胱氨酸的過甲酸衍生物發(fā)生配對，形成二硫樣的鍵。首先，這不需要高毒性的TFA溶解疏水蛋白。第二，PFA處理過的疏水蛋白在攪拌下不會組裝。重要的是，它們在正確的條件(即加入金屬離子或降低pH值)下仍能形成β折疊(如用CD所觀察到的那樣)。
圖1.培養(yǎng)基中的聚乙烯醇(PVOH)可以阻止SC3的組裝。通過對來自沒有PVOH(第1列)、含0.1％PVOH(第2列)或含0.3％PVOH(第3列)的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的TCA沉淀確定出所產(chǎn)生的SC3的總量。將沒有PVOH或含0.1％或0.3％PVOH的培養(yǎng)基渦旋(2分鐘，最大速度)和離心(13000rpm下15分鐘)。分別分析沉淀部分(分別是第4到6列)和經(jīng)10％TCA沉淀過的上清液部分(分別是第7到9列)。
圖2.SC3的圓二色性(CD)光譜顯示SC3在室溫下、存在1％PVOH時從可溶態(tài)(橙色)向β折疊態(tài)(藍線)的轉(zhuǎn)換。紅線說明在pH值為7時，在數(shù)小時的時程內(nèi)都沒有出現(xiàn)變化，而在pH值為4時就已經(jīng)形成了β折疊。
圖3.標繪了每種SC3濃度的硫磺素T熒光，并整合成了直線。
圖4.用PFA-SC3進行圓二色性(CD)試驗。用足夠多的PFA-SC3保持1mm杯內(nèi)的-10和-40之間的信號。水中的PFA-SC3表現(xiàn)出與無組織肽最為相當?shù)墓庾V(深灰)。在加入膠狀PTFE之后，光譜立刻變成為α螺旋態(tài)結(jié)構(gòu)，其與與PTFE結(jié)合的SC3的結(jié)構(gòu)完全一致(淺灰)。
圖5.如用CD光譜法所監(jiān)視的，可以用鈣穩(wěn)定PFA-SC3層。
圖6A.在16個小時、3個小時或15分鐘內(nèi)，在濃度為300、100、50或5μg/ml的50mM磷酸緩沖液(pH值7)的疏水蛋白溶液中所涂覆的PFTE片的接觸角。用milliQ水或用0.1％Tween20(pH7)(Tw7)洗滌樣品。
圖6B.在16個小時、3個小時或15分鐘內(nèi)，在濃度為300、100、50或5μg/ml的50mM磷酸緩沖液(pH值7)的疏水蛋白溶液中所涂覆的PFTE片的接觸角。將樣品在1％SDS中、100℃下溫育10分鐘。用milliQ水或用0.1％Tween20(pH7)(Tw7)洗滌樣品。
圖7.在溶解于水(pH值4)或水(pH值7)的濃度為300、100、或50μg/ml的疏水蛋白中所涂覆的PFTE片的接觸角。在16個小時或3個小時內(nèi)進行涂覆。用milliQ水或用0.1％Tween20(pH7)(Tw7)洗滌樣品。
圖8.在溶解于milliQ水(pH值7)或50mM磷酸緩沖液(pH值7)的濃度為300、100、或50μg/ml的疏水蛋白中所涂覆的PFTE片的接觸角。在16個小時或3個小時內(nèi)進行涂覆。用milliQ水或用0.1％Tween20(pH7)(Tw7)洗滌樣品。
實施例實施例1SC3在含去垢劑PVOH的S.commune的培養(yǎng)物上清液中的可溶態(tài)。
通過用韋林攪切器破碎40ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(PM)中的一個菌落的一半接種200ml S.commune(ASC15)培養(yǎng)物。往1L錐形瓶中的200ml PM中加入2ml破碎材料(浸泡物)。相似地，接種2種200ml含0.1％或0.3％PVOH的PM的培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物30℃和200rpm下生長。在葡萄糖濃度低于5g/L時收集培養(yǎng)物。通過經(jīng)過濾通過尼龍布料將培養(yǎng)基與菌絲分開獲得培養(yǎng)物上清液。SDS-PAGE對疏水蛋白SC3產(chǎn)量水平的分析以及對450μl經(jīng)10％TCA沉淀的培養(yǎng)基的考馬斯染色都顯示在含0.1％PVOH的培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的SC3的量與在無PVOH的培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的量相似(圖1，第1和2列)。在含0.3％PVOH的培養(yǎng)物中，SC3產(chǎn)量有輕微減少(圖1，第3列)。
將450μl不同的培養(yǎng)物上清液樣品在最大速度下渦旋2分鐘并在13000rpm下離心15分鐘。SDS-PAGE對沉淀物和經(jīng)10％TCA沉淀的上清液的分析都顯示在含0.1％PVOH的培養(yǎng)物上清液中，絕大部分的SC3仍在上清液部分(圖1，第5列)，而不是在沉淀部分(圖1，第8列)。這種作用在含0.3％PVOH的培養(yǎng)物上清液中甚至是更為明顯的(圖1，第6和9列)。當與上清液部分(圖1，第7列)比較時，對無PVOH的培養(yǎng)物上清液的分析顯示SC3主要存在于沉淀部分(圖1，第4列)。因此，培養(yǎng)基中的PVOH阻止了空氣-水界面上的疏水蛋白組裝(經(jīng)渦旋所產(chǎn)生的)。
實施例2用培養(yǎng)物上清液涂覆—在含PVOH的培養(yǎng)物上清液中所涂覆的PTFE片的接觸角。
用100％乙醇、純TFA充分地清洗2cm2PTFE(聚四氟乙烯；PTFE)片，并用水洗滌。將PTFE片放置在含2ml無PVOH的培養(yǎng)物上清液和在生長期間存在0.1％-0.2％PVOH的上清液的2ml容器中，這樣就在片的表面上形成了一層。如在實施例1中所述的那樣獲得上清液。通過在上清液(pH值5.5)中或在經(jīng)TFA或HCl被酸化到pH值為2的上清液中、25℃下溫育16個小時制備疏水蛋白層。用milliQ水洗滌所涂覆的片三次，將其干燥。通過測定1-2μl milliQ與表面的接觸角，用Drop ShapeAnalysis System DSA 10 Mk2裝置(Kruss)確定出涂層表面的親水性。
結(jié)果顯示被直接用于涂層的震蕩培養(yǎng)物(有或沒有添加PVOH)的培養(yǎng)物上清液生成了超過85°的高接觸角，與PTFE片常見的110°的接觸角比較，只有很少的降低。對于生長在有或沒有PVOH的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，在涂覆之前用HCl或TFA將培養(yǎng)基酸化到pH值為2形成了顯著更小的PTFE片的接觸角。對于正常的或含去垢劑的培養(yǎng)物的酸化培養(yǎng)基可以常規(guī)地獲得50-60°的接觸角。如用抗體檢測和SDS-PAGE所驗證的那樣，這些涂層都含有分泌到培養(yǎng)基中的SC3疏水蛋白。用在0.1％PVOH中生長的培養(yǎng)物的酸化培養(yǎng)基可以獲得小到30°的接觸角。更高濃度的PVOH不會干擾S.commune的生長，但是它形成了具有高接觸角的涂層。培養(yǎng)物上清液的涂覆能力隨著不同的生長條件以及隨著收獲培養(yǎng)基的時機的不同都會有所不同。
去垢劑在生長期間的存在保證了最可重復(fù)的結(jié)果。但是，沒有預(yù)先加入去垢劑的上清液也能用于涂覆的目的。這說明真菌所分泌的去垢劑樣物質(zhì)將有助于保持所分泌的SC3處于合適于涂覆的狀態(tài)。在各種情況中，都降低培養(yǎng)基上清液的pH值，以便獲得好的涂層。
也用經(jīng)在2％SDS溶液中煮沸20分鐘以及隨后用水充分洗脫的玻璃載玻片進行涂覆試驗。如所述的用于PTFE片的涂層進行涂覆。未涂覆的玻璃載玻片的接觸角是不能檢測到的，因此其小于15°。用有或沒有添加去垢劑的培養(yǎng)物上清液對玻璃載玻片的涂覆造成接觸角為20到40°，推測這反映了玻璃表面上的疏水蛋白層的形成。在涂覆之前對培養(yǎng)基的酸化造成接觸角為50-65°，所增加的50°使得玻璃是更為疏水的。實施例3通過在存在去垢劑時對低pH值的暴露用疏水蛋白涂覆物體。
CD試驗、變化條件、去垢劑和時程用圓二色性光譜法(CD)研究SC3的二級結(jié)構(gòu)。利用1mm石英杯，在Aviv 62A DS CD光譜儀(Aviv Associates，Lakewood，New Jersey，USA)上記錄下190-250nm的CD光譜。用沒有蛋白的參照溶液記錄光譜。通常使用濃度為100-200μl/ml的蛋白。對于與疏水支持物相結(jié)合的疏水蛋白的光譜，往溶液中加入在水中159nm不穩(wěn)定的、膠狀聚四氟乙烯(PTFE)。疏水蛋白在PTFE上的表面覆蓋率通常是10％。作為去垢劑，1％聚乙烯醇(重量/重量；PVOH，88％被水解)或0.1％Tween-20被用作為終濃度。
A)將100μl SC3(0.5mg/ml)的25mM磷酸緩沖液(pH 7.0)溶液、200μl 2％PVOH(w/w)、和100μl膠狀PTFE混和在石英杯中。在25℃下平衡溶液。直接地以及在3小時后記錄下CD光譜(圖2)。光譜仍沒有變化，并且是可溶性SC3的光譜(de Vocht等，1998)。再次制備相同的混和物，但是在記錄下光譜之后，加入4μl 10％三氟乙酸(TFA)使得pH值低于2，混和并記錄下光譜(圖2)。CD光譜從可溶性SC3光譜變成了完全β折疊態(tài)光譜。含疏水蛋白的溶液的低pH值已經(jīng)誘導(dǎo)了從可溶性SC3向PTFE上的不可溶性涂層的完全轉(zhuǎn)換。接下來，通過加入4μl 5M NaOH將杯內(nèi)的pH值升高到超過10。與低pH值下所記錄到的光譜比較，新記錄下的光譜沒有顯示出變化(圖2)。因此，推論pH值的臨時降低不可逆地誘導(dǎo)了β折疊態(tài)構(gòu)象。因此，在存在去垢劑和膠狀PTFE時，在pH值7下的數(shù)小時時間內(nèi)，SC3仍是可溶的，但是在低pH值下形成了不可溶的β折疊。
B)用0.1％Tween-20進行與A中所進行的相似的試驗。結(jié)果是一致的。因此，也可以使用不同于PVOH的另一種去垢劑。常被用于涂覆的SDS不能被用于CD測試，因為它強烈地干擾了信號。
C)用疏水蛋白SC4(也來自于S.commune)和ABH3(來自雙孢蘑菇(Agaricus bisporus))進行與在A中所進行的相似的試驗。對于兩種疏水蛋白，都得到了與SC3相似的結(jié)果，說明室溫下的低pH值處理可以被用于穩(wěn)定多種類型的疏水蛋白。
D)在不同的pH值下進行與在A中所進行的相似的試驗，所有的試驗都在磷酸緩沖液中進行。結(jié)果表明在低pH值(1到4)下的β折疊轉(zhuǎn)換的速度要比在更高pH值下的轉(zhuǎn)換更快。甚至在pH值為7時，在室溫下也可能實現(xiàn)轉(zhuǎn)換，但是這至少需要過夜溫育。因此，pH值越低，組裝就發(fā)生的越快。
E)在與A中所進行的相似的試驗中，按不同的順序混和組分。結(jié)果顯示混和的順序?qū)ψ罱K結(jié)果(即β折疊形成)沒有影響。
F)在與A中所進行的相似的試驗中，在一時程(time course)內(nèi)快速掃描CD光譜。結(jié)果顯示，在pH值為2時，只需要數(shù)分鐘就達到了β折疊終末態(tài)。從光譜中清楚地看到，α螺旋態(tài)是一種臨時的中間態(tài)，如在空氣-水界面上的自組裝所觀察到的一樣(de Vochet等，2002)。
G)在與在A中所進行的相似的試驗中，將樣品與3μM硫磺素T(一種淀粉樣蛋白的熒光探針，其僅僅與SC3的組裝態(tài)結(jié)合時才會發(fā)出熒光(Butko等，2001，Spectroscopic evidence for amyloid-like interfacialself-assembly of hydrophobin SC3，Biochem.Biophys.Res.Commun.280212-215；Wsten and de Vocht 2000，Hydrophobins，the fungal coatunraveled.Biochim.Biophys.Acta 146979-86；McKay等.2001，Thehydrophobin EAS is largely unstructured in solutions and functions byforming amyloid-like structures.Structure 983-91))混和。將樣品稀釋在3ml石英杯的水中，并放置于SPF-500C熒光分光光度計(SLMAminco)中。在那些如用CD所觀察到的處于β折疊態(tài)的樣品中觀察到了熒光的顯著減少。因此，低pH值在室溫下誘導(dǎo)出了真正的淀粉樣結(jié)構(gòu)。
H)pH值和溫度對SC3的β折疊形成之間的相關(guān)性。在如在A中所進行的相似的試驗中，研究了pH值和溫度對SC3的β折疊形成之間的相關(guān)性。在測定之前，將SC3溶解于HCl/KCl緩沖液(pH值2)或磷酸緩沖液(pH值7)，并在溫度為15、25、40和80℃下加入PTFE之后測定CD光譜(α螺旋)。在測定之后，加入4μl 10％Tween20(終濃度為0.1％)，觀察到了對β折疊形成的影響。
表1在各種pH值和溫度下加入Tween-20之后的β折疊形成。
這些數(shù)據(jù)表明pH值和溫度對PTFE上的疏水蛋白的β折疊形成具有很大的影響。在pH值為2時，在超過15℃以上的溫度下可即刻發(fā)生β折疊形成。在pH值為7時，更高的溫度可造成更快的β折疊形成。
實施例4涂層在實施例1中所進行的CD試驗通常具有10％的膠狀PTFE表面的覆蓋率，并用CD特征性描述。在這個實施例中，疏水蛋白對PTFE的涂覆是100％覆蓋率(即使用過量的疏水蛋白)，并用水接觸角特征性描述。
用100％乙醇充分地清洗1cm2的PTFE片，用水沖洗并干燥。通過將PTFE片溫育在2ml含有2ml具有任選的添加物的100μg/ml疏水蛋白溶液的容器中，獲得了疏水蛋白層。通常在25℃下進行溫育16個小時。用10ml milliQ水洗滌片3次，并干燥。在新的2ml含有2％SDS、0.1％Tween-20或1％PVOH的容器中，在特異的pH值和溫度下進行隨后的穩(wěn)定疏水蛋白層的去垢劑處理。再次用10ml milliQ水洗滌片3次，并干燥。用Drop Shape Analysis System DSA 10 Mk2裝置(Kruss)通過測定1-2μl水與表面之間的接觸角確定出表面的親水性(表2)。
表2PTFE片上的各種涂層的接觸角。
結(jié)果清楚地表明在25℃下實現(xiàn)了低接觸角。通過對所進行的涂層的傳統(tǒng)的熱SDS處理(施用于已有的涂層)和室溫下的低pH值處理都獲得了最好的結(jié)果。通過在疏水蛋白和去垢劑的溶液中室溫下直接涂覆PTFE片也可以實現(xiàn)低接觸角。
實施例5檢測法發(fā)展出了一種用于確定含疏水蛋白的溶液的濃度和功能性的微量滴定板檢測法?？梢杂迷摍z測法篩選出最好的產(chǎn)疏水蛋白微生物株或從中選擇出功能性的疏水蛋白及其突變體。在每一孔內(nèi)，制備總體積為200μl含有0-150μg/ml SC3、0.4％膠狀PTFE(w/v)、3M硫磺素T、0.1％PVOH和10mM HCl/KCl(pH值2)的混和物。將板在25℃下溫育，并取缺失其中一種組分的孔作為對照。用熒光劑在不同的時間間隔內(nèi)讀取熒光。描繪出熒光對SC3濃度的數(shù)據(jù)點，數(shù)據(jù)點可以被整合成一直線(圖3)。
實施例6利用PFA對含疏水蛋白的溶液的溶解作用和穩(wěn)定作用。
將1mg純化的冷凍干燥的SC3(組裝的或可溶的)溶解在1ml冰冷的過甲酸(PFA)溶液中，并在冰上保留16個小時。通過混和1份30％過氧化氫和9份濃縮甲酸制備過甲酸溶液，將其保留在工作臺上1個小時進行激活，并在冰上預(yù)冷1個小時。將含SC3的PFA溶液施用到經(jīng)milliQ水平衡的PD-10柱(Pharmacia)中。將最初3.5ml柱洗脫液中的PFA-SC3收集到純水中。去除了從柱中洗脫出的因甲酸而具有更低pH值的部分。具有PFA-SC3的溶液可以在8℃下保存數(shù)個月，而不改變它們的性質(zhì)。如上所述，用PFA-SC3進行CD試驗，圖4顯示了試驗的結(jié)果。
實施例7對PFA處理過的疏水蛋白的Maldi-TOF分析基質(zhì)輔助的激光離子化解離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是一種相當新的技術(shù)，其中用納秒激光脈沖照射吸收紫外線的基質(zhì)和生物分子的共沉淀物?；|(zhì)吸收了絕大多數(shù)激光能量，這阻止了生物分子的不必要的破碎。離子化的生物分子在電場中被加速，并進入飛行管。在該管內(nèi)的飛行期間，不同的分子根據(jù)其質(zhì)量對電荷比而被分開，并在不同的時間到達檢測器。據(jù)此每種分子都產(chǎn)生了不同的信號。該方法通常被用于檢測和特征化具有分子量為40和350,000Da之間的生物分子例如蛋白、肽、寡糖和寡核苷酸。用PFA-SC3以及芥子酸作為基質(zhì)進行Maldi-TOF分析。分析發(fā)現(xiàn)與SC3比較，PFA-SC3的分子量增加了600-700Da。當用PFA氧化SC3時，預(yù)計完全氧化的半胱氨酸殘基使分子量增加了384Da。額外增加的分子量可能是Na/K鹽加合物(adduct)所引起的，它造成了寬的質(zhì)峰。因此，用Maldi-TOF分析可以驗證PFA對疏水蛋白的預(yù)期的修飾。
實施例8加熱PFA-SC3將PFA-SC3和PTFE溶液加熱到85℃，并加入4μl 10％Tween-20，造成了蛋白的部分溶解以及部分PFA-SC3附著到PTFE上。
實施例9獲得經(jīng)鈣觸發(fā)的穩(wěn)定的PFA-SC3涂層為了中和過甲酸氧化所引入的負電荷并因此有利于涂層轉(zhuǎn)換為β折疊構(gòu)象，加入了鈣。通過加入足夠量的10％TFA溶液將pH值降低到了1以下。往PFA-SC3溶液中加入10mM CaCl2造成了無組織結(jié)構(gòu)(圖5，空心圓)向更多的α螺旋結(jié)構(gòu)(實心圓)的光譜變化。加入PTFE造成了光譜向更多的β折疊樣態(tài)(實心方塊)的轉(zhuǎn)換。隨后的熱去垢劑處理不會出現(xiàn)光譜的任何變化，說明終末態(tài)(被稱作為β折疊態(tài))已經(jīng)達到(實心三角)。
用硫磺素T確定β折疊態(tài)(實心三角)是否是未經(jīng)PFA處理過的SC3的真正的β折疊結(jié)構(gòu)。進行如在實施例3中進行的試驗。硫磺素T熒光隨著β折疊PFA-SC3而顯著增加，說明形成了真正的淀粉樣結(jié)構(gòu)。
實施例10濃度和時間對涂層的影響用100％乙醇充分地清洗1.6cm2的PTFE片，然后用水沖洗并干燥。通過在2ml含有1.5ml濃度為300、100、50或5μg/ml的50mM磷酸鈉緩沖液(pH值7)的疏水蛋白溶液的容器中溫育PTFE片獲得了疏水蛋白層。在25℃下進行溫育16個小時、3個小時或15分鐘。用milliQ水洗滌片，隨后進行不同的處理。半數(shù)樣品在1％SDS中、100℃下溫育10分鐘，然后用milliQ水洗滌。該熱去垢劑處理被當作為穩(wěn)定涂層的陽性對照。將半數(shù)未經(jīng)熱SDS處理過的樣品以及半數(shù)經(jīng)熱SDS處理過的樣品在1.5ml 0.1％Tween20(pH值7)中、旋轉(zhuǎn)臺(20rpm)上溫育15分鐘。用milliQ水洗滌樣品。用該Tween處理確定出在不同測試條件下獲得的涂層的穩(wěn)定性。干燥所有的樣品。用Drop Shape Analysis System DSA 10Mk2裝置(Kruss)通過測定1-2μl水與表面之間的接觸角確定出表面的親水性(圖6A和6B)。未處理的PTFE片上的水接觸角接近110°。
這些結(jié)果(見圖6A)說明疏水蛋白溶液的濃度和溫育時間都影響所獲得的接觸角以及涂層的穩(wěn)定性(對0.1％Tween20(pH值7)洗滌的耐受性)。例如，在300μg/ml濃度下涂覆16個小時形成了具有低接觸角的穩(wěn)定的涂層。相反地，在5μg/ml濃度下涂覆16個小時形成了具有高接觸角的不穩(wěn)定的涂層，以及在5μg/ml濃度下涂覆15分鐘形成了非常高的接觸角(圖6A)。和所預(yù)期的一樣，經(jīng)熱SDS處理的涂層在所有的測試濃度和溫育時間中都是穩(wěn)定的(圖6B)。
實施例11pH值對涂層的影響這個試驗舉例說明了低pH值和增加疏水蛋白濃度對穩(wěn)定涂層的形成的貢獻。
用100％乙醇充分地清洗1.6cm2的PTFE片，然后用水沖洗并干燥。通過在2ml含有1.5ml濃度為300、100或50μg/ml的疏水蛋白溶液的容器中溫育PTFE片獲得疏水蛋白層。在pH值為7的milliQ水或pH值為4的milliQ水(通過加入NaOH將pH值增加到7)中制備疏水蛋白溶液。在25℃下進行溫育16個小時或3個小時。用milliQ水洗滌片，隨后進行不同的處理。半數(shù)樣品在1％SDS中100℃下溫育10分鐘，然后用milliQ水洗滌。將半數(shù)未經(jīng)熱SDS處理過的樣品以及半數(shù)經(jīng)熱SDS處理過的樣品在1.5ml 0.1％Tween20(pH值7)中、旋轉(zhuǎn)臺(20rpm)上溫育15分鐘。用milliQ水洗滌樣品。干燥所有的樣品。用Drop Shape Analysis SystemDSA 10 Mk2裝置(Kruss)通過測定1-2μl水與表面之間的接觸角確定出表面的親水性。
結(jié)果表明當溫育涂層16個小時時，降低疏水蛋白溶液的pH值造成了濃度小于300μg/ml時的接觸角的降低。當進行更短的溫育(3個小時)時，降低疏水蛋白溶液的pH值造成了所有測試濃度時的接觸角的降低。另外，當在300μg/ml進行涂覆16個小時時，降低pH值形成了穩(wěn)定的涂層(圖7)。經(jīng)熱SDS處理過的樣品在所有的測試濃度和溫育時間中都是穩(wěn)定的(沒有顯示)。
實施例12緩沖劑對涂層的影響用100％乙醇充分地清洗1.6cm2的PTFE片，然后用水沖洗并干燥。通過在2ml含有1.5ml濃度為300、100或50μg/ml的疏水蛋白溶液的容器中溫育PTFE片獲得疏水蛋白層。在pH值為7的milliQ水或pH值為7的磷酸緩沖液中制備疏水蛋白溶液。在25℃下進行溫育16個小時或3個小時。用milliQ水洗滌片，隨后進行不同的處理。半數(shù)樣品在1％SDS中100℃下溫育10分鐘并用milliQ水洗滌。將半數(shù)未經(jīng)熱SDS處理過的樣品以及半數(shù)經(jīng)熱SDS處理過的樣品在1.5ml 0.1％Tween20(pH值7)中、旋轉(zhuǎn)臺(20rpm)上溫育15分鐘。用milliQ水洗滌樣品。干燥所有的樣品。用Drop Shape Analysis System DSA 10 Mk2裝置(Kruss)通過測定1-2μl水與表面之間的接觸角確定出表面的親水性。
結(jié)果(圖8)顯示當溫育涂層16個小時時，緩沖劑在疏水蛋白溶液中的存在造成了濃度小于300μg/ml的接觸角的降低。當進行更短的溫育(3個小時)時，緩沖劑在疏水蛋白溶液中的存在造成了所有測試濃度的接觸角的降低。緩沖劑的存在沒有影響涂層的穩(wěn)定性。經(jīng)熱SDS處理過的樣品在所有的測試濃度和溫育時間中都是穩(wěn)定的(沒有顯示)。
權(quán)利要求
1.用于給物體表面提供疏水蛋白涂層的方法，其包括在任選地存在去垢劑的條件下，將物體的至少一部分與含疏水蛋白的溶液相接觸以在所述物體的表面上形成疏水蛋白層，以及將所述層暴露于一pH值，所述pH值小于7、優(yōu)選地小于4、更優(yōu)選地小于2。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在低于30℃、優(yōu)選地低于25℃、更優(yōu)選地低于15℃的溫度下進行所述接觸。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述含疏水蛋白的溶液是分泌疏水蛋白的生物體的培養(yǎng)基上清液。
4.權(quán)利要求3的方法，其中在培養(yǎng)所述生物體之后向培養(yǎng)基中或向培養(yǎng)物上清液中加入所述去垢劑。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述去垢劑在培養(yǎng)所述生物體期間存在于培養(yǎng)基中。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述去垢劑或去垢劑樣化合物由所述生物體產(chǎn)生。
7.權(quán)利要求1到6中任一項的方法，其中所述去垢劑選自Tween-20、Tween-80、聚乙烯醇(PVOH)、Triton-X100和十二烷基硫酸鈉(SDS)。
8.權(quán)利要求1到7中任一項的方法，其中所述去垢劑的濃度為至少0.001％重量/體積、優(yōu)選地至少0.01％重量/體積、更優(yōu)選地至少0.1％重量/體積、以及最優(yōu)選地至少1％重量/體積。
9.權(quán)利要求1到8中任一項的方法，其中所述疏水蛋白溶液含有至少5mg/l的疏水蛋白，優(yōu)選地至少10mg/l的疏水蛋白，更優(yōu)選地至少20mg/l的疏水蛋白。
10.用于給物體表面提供疏水蛋白涂層的方法，其包括將物體與含疏水蛋白的溶液相接觸，其中所述溶液包括已經(jīng)以過甲酸(PFA)處理過的疏水蛋白。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述溶液的pH值小于7、優(yōu)選地小于4、更優(yōu)選地小于1。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述溶液還包括二價金屬離子，優(yōu)選地是Ca2+離子。
13.權(quán)利要求1到12中任一項的方法，其中所述物體選自窗戶、接觸鏡、生物傳感器、醫(yī)療器械、進行檢測或儲存的容器、船體或汽車框架或車體、固體顆粒、多孔材料和織物。
14.對用于通過將物體表面的至少一部分與含疏水蛋白的溶液在室溫下相接觸而給物體表面提供疏水蛋白涂層的條件進行優(yōu)化的方法，所述方法包括確定至少兩種參數(shù)對在所述物體表面上形成疏水蛋白層的影響，其中所述參數(shù)選自pH值、溫育時間、所述含疏水蛋白的溶液中的疏水蛋白濃度和所述溶液中存在的緩沖劑。
15.用于培養(yǎng)產(chǎn)疏水蛋白的生物體的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包括一種去垢劑。
16.PFA處理的疏水蛋白用于給物體提供疏水蛋白涂層的用途。
17.去垢劑用于阻止含疏水蛋白的溶液中的疏水蛋白的組裝的用涂。
全文摘要
本發(fā)明涉及用疏水蛋白涂覆物體的方法。本發(fā)明提供了一種用于給物體表面提供疏水蛋白涂層的方法，其包括在任選地存在去垢劑的條件下，將物體的至少一部分與含疏水蛋白的溶液相接觸以便在所述物體的表面上形成疏水蛋白層，以及將所述層暴露于一pH值，所述pH值小于7、優(yōu)選地小于4、更優(yōu)選地小于2?？梢栽谑覝刈笥疫M行所述接觸，以及所述含疏水蛋白的溶液可以是分泌疏水蛋白的生物體的培養(yǎng)基的上清液。
文檔編號C07K4/06GK1909979SQ200580002549
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月16日
發(fā)明者里克·林克, 卡林·朔爾特邁耶 申請人:應(yīng)用超微系統(tǒng)股份有限公司