專利名稱：超濾法提?、蛐驼婢杷鞍椎姆椒?br> 超搶i取II型真菌疏l7K蛋白的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生t/M料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種II型疏水蛋白的純化方法，即 用超搶法純化II型疏水蛋白。該疏水蛋白可以應(yīng)用到生物傳感器、細胞固定化、化妝品、醫(yī)藥衛(wèi) 生和乳化等的眾多領(lǐng)域。背景S^疏冰蛋白(hydrophobin)是高等絲狀真菌在特定發(fā)育P介段大量分泌的一類具 有特殊14M的小型結(jié)構(gòu)蛋白，它們會辦在不同界面處自組裝成為一種兩親性薄膜。這種特性在很 多方面漸導(dǎo)到了細，涉及到生物傳繊、細胞固定化、化妝品、醫(yī)藥衛(wèi)生和 L化等的眾多領(lǐng)域。 由于疏水蛋白的 性質(zhì)，疏水蛋白的純化與一般蛋白相比，3艘比 :。根據(jù)疏水性圖譜及裝配成的兩性蛋白膜的溶解性辦征，IfeK蛋白可以分為兩類I型和II型，并且因為兩者的 'M穀艦大，因而提取方、瞎別也很大。據(jù)已公開的文棘看，疏冰蛋白的主要純化方法如下(1) 三氟乙酸法如SC3、 SC4、 EAS、 HYPA等I型疏水蛋白就是利用此Sii，化。這種方 法禾,了 I型ifeK蛋白在界面形成的聚合物(包括菌絲和孢子的表面)不能在熱SDS溶液中解聚 和溶解，而只能在強鵬口過氧甲酸(PFA)和三氟乙酸(TFA)中解聚成單體(早期用PFA，后期都 用TFA)的特性。(2) 唯一的一種溫和劍牛下提取I型€*蛋白的方法1998年Lora JM等發(fā)鵬褶菌分泌 SC3的同時分泌高^T量的多糖裂褶菌素，裂mffi素feK溶液能穩(wěn)定SC3，以此發(fā)明了用疏iTK層析 法/Aa,液中分離I型疏iZK蛋白的方法。除fc外，對I型i^7K蛋白還沒有提出TFA (或PFA) 解聚以外的分離純化方法。(3) II型疏冰蛋白純《七法因為II型疏l7JC蛋白能被1% 2%SDS溶液和60%乙, 聚 和溶解，所以如CU、 CFTH1以及融合蛋白EGIcore-HFBI等一般flPF用PFA或TFA解聚，而用近幾 年3f5SDS抽提法、)Z7jC相系統(tǒng)ATPS分離法和各種層析離純化。但SDS抽提法和)5i7jC相 系統(tǒng)ATPS分離 孺要f頓大量的無m^有機試劑，分離后產(chǎn)生的廢 需額外處理,并且最后所得 II型蛋白溶液含有大量鹽類和色素，還需要下一步工藝來去除它們;各種層析方法雖然能有效的解 決最終II型疏冰蛋白溶液中含有麟和色素的問題但實際應(yīng)用中能處理蛋白粗樣品的規(guī)豐駄小， 并且各種層析所用填料價格昂貴,不適舒大規(guī)模4頓。超濾(UF)以壓力為推動九禾,中空纖維超濾膜不同孑L湖液體進行分離的物理篩分過程， 其切割W量(CWCO) 103至106，孔徑1100nm。 1965年，首先由美國康公司開功中空纖維 式超濾器，S放巿場。超濾應(yīng)用范圍很廣，除在水處理工程中，用于除菌、膠體和大肝有機 物等外，還可以用于許多特殊溶液的分離、精制，如血液凈化、蛋白質(zhì)ftj、大M有機物與鹽 的分離和I7K等。超濾作為一種較為快速簡便的方法，具有對產(chǎn)物破壞少的優(yōu)點。中空纖維超濾膜由于孔徑小，過濾時不易產(chǎn)生濃差極化，并具有可同時脫鹽和濃縮靴點,故被國內(nèi)外一些研究 者相^^用，用于蛋白質(zhì)的 和沉淀劑去除。但是到目前為止，市場上還沒有一種成型的疏水蛋白產(chǎn)品，主要是因為現(xiàn)有的疏水蛋白的純 化方法過程錢，成本過高，不適合在大規(guī)模，^擅用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的，決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種適合在大規(guī)模X^fe^， 用的超搶,取II型疏L7jC蛋白的方法。以便去除II型1^7jC蛋白ffiJl液中的大部^fe素，無機鹽 以及其它小^^質(zhì)，得到高純度的疏水蛋白。本發(fā)明,的超激iM取II型真菌疏水蛋白的方法，包括以下步驟第一、用SDS法從真難絲表面抽提II型真K7]C蛋白，經(jīng)離心或板敏激導(dǎo)至暖白粗提瓶第二用Kci對蛋白粗提^a行處理，經(jīng)離心，板框或微濾以除去n型真菌疏水蛋白粗提液中70%- 80X左右的SDS;第三、超濾，將KC1處理后的II型真菌疏冰蛋白粗提Wil^孔徑為3000—10000的中空纖維超濾膜，鄉(xiāng)SiS麟到II型真菌疏冰蛋白W液；超濾結(jié)束后對超濾鵬行反洗，待用。對，第三步得到II型真菌疏水蛋白濃縮液，可以進《fm規(guī)噴霧千燥，得到含量在20%—30 %的11型真菌^7乂蛋白干粉。其中，超濾過程中所用的中空纖鄉(xiāng)鍋濾膜材質(zhì)為聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚1W、聚丙烯腈或聚偏氟乙烯；中空纖纟,濾膜為巻^^或管 。超濾運行工藝^^牛為運行壓力0. 02—0. 09MPa;運^f溫度為20—45。C;運行PH為3—11; 每超濾2小時需要反洗。所述的反洗是在超濾過程中用去離子7jC反沖膜，以部分咴 通量；或在超濾結(jié)束時用水反TO以提高n型真菌疏冰蛋白收率，然后用堿性溶液 以完全咴 1量。本發(fā)明針對不同規(guī)模的II型疏l7K蛋白粗提液，選擇材質(zhì)、大小^S的超Mt， fflil超濾壓力、 時間、、鵬、PH等超濾剝牛的優(yōu)化，得到最佳的超濾割牛。頓濾過程中，用SDS-PAGE、高效液 相色譜、葡聚撒賺G-25層析、Western Blotting及吖啶橙》縛技術(shù)對蛋白粗提液中的疏冰蛋白、 無機鹽和SDS進行定性和定量。本發(fā)明的優(yōu)點和積極鄉(xiāng)本發(fā)明與傳統(tǒng)的II型疏水蛋白純化方法，如雙水相系統(tǒng)分離法和各種層析法相比，超'搶法純化n型疏冰蛋白更加方便，效率更高，所用財更少，M3S^^工^Ji大規(guī)模的純化。本方法 的實施為加快疏水蛋白，的產(chǎn)業(yè)化打下了堅實的基礎(chǔ)。
圖1是瑞氏^llll7K蛋白HFBI標準品電泳圖。 圖2是不同超濾時間下膜通量曲線圖。 圖3是不同超濾壓力下膜通量曲線圖。 圖4是不同超^lffi下膜通量曲線圖。圖5是不同超濾ph下ma量曲線圖。圖6 ，濾后瑞氏木ll^水蛋白HFBI電泳圖和Western Blotting圖。 圖7 ，濾后瑞氏木Slif冰蛋白HFBI與標準品的HPLC對比圖。 圖8 ，濾后瑞氏木HSr冰蛋白HFBI的S印hadex G25層析圖。 圖9 ^0濾后檢測SDS所用標準曲線。 圖10是超濾后瑞氏^ll^水蛋白HFBI的定量標準曲線。具體實《^以目前國際上研究最多的II型疏水蛋白HFBI為例，選擇以聚砜為材質(zhì)的中空纖維膜(不易 結(jié)合蛋白質(zhì))，完整的實現(xiàn)了超濾純化HFBI的S^程。 本發(fā)明方、M括以下步驟第一、用SDS法從真M絲表面抽提II型真菌疏冰蛋白，經(jīng)離心艦敏濾得到蛋白粗提液； 第二、用KC1對蛋白粗提皿行處理，經(jīng)離心，板框或微濾以除去II型真菌疏冰蛋白粗提液 中80%左右的SDS;第三、超濾，將KC1處理后的II型真菌疏水蛋白粗提M^孔徑為3000—10000的中空纖 l腿濾膜，纟S1S 銜尋到II型真菌疏冰蛋白、 液；超濾結(jié)束后對超濾膜進行反洗，待用。 對上歩得到的II型真菌疏水蛋白濃^"液，進4亍常規(guī)噴霧干燥，得到含量在20%—30%的II 型真菌i^7]C蛋白干粉。本實施例所用的中空纖鄉(xiāng)，濾膜材質(zhì)為聚砜(效果好于其它材質(zhì))，超濾膜孔徑為6000。 超濾運行工藝條^牛為運行壓力0.02—0. 09MPa;運斤溫度為20—45'C;運行PH為3—11;每超濾2小時需要反洗。最,作壓力為0.06Mpa;最佳運fr溫度為40。C;最佳運行PH為8;最佳反洗時間為2小時。下面結(jié)合附圖對本實施例的方齒,一步的闡明。圖1說明:il3l瑞氏^SIi^7iC蛋白HFBI標準品電泳圖可以看出，疏冰蛋白的好量在7. 5KDa。 如果膜的切割肝駄小，貝依單位時間內(nèi)單位面積3t^的通駄小，不能得到實際應(yīng)用，如果膜的切割好《1大，貝IJTO^留物質(zhì)的截流率太低?？紤]至喊冰蛋白的肝量在7. 5KDa,并 且要OT去除的色素、鹽類以及SDS都是小^^J質(zhì)，綜合以上考慮，選擇6000作為膜的切割分 子量(實驗中發(fā)現(xiàn)使用切割^ 量為3000—10000的超濾膜都有 媒，6000為最佳)。圖2說明從圖中可以看出，隨著時間的推移，膜通量開始衰減，但衰^Ut逐漸減慢。這 主要是由于蛋白質(zhì)濃差極化形成MK層SEffi密戶^t系^it行2小時之后膜通量為起^1量的 64%左右，這種狀態(tài)一直可機到第六小時，波動非常小，駐要是由于膜表面形成了穩(wěn)定的 鵬 層所致。fi^統(tǒng)不能長時間在較低通SS行，因為低通量不僅效率比較低，而且長時間的壓密對 以后的麟洗帶來困難。所以運行2小時后要離子進行反洗。圖3說明從圖中可以看出，機作JEMS小時，滲3gii量與ffiMM線性關(guān)系，HMM大， 滲iiiil翻大；但是當ffi^il0.05MPa后，滲翻量的增長幅度明顯減小，雖逐鵬于穩(wěn)定， 與自無關(guān)，此時的滲M量為"臨界滲透通量"，壓差為"臨界壓差"。這是因為料 壓力較小時，膜滲M量小，MM3i液帶到膜表面的溶質(zhì)量也較少，膜表面 孔內(nèi)只形成了少量的 層和污染,由于壓力將物料中壓向凝膠層內(nèi)的溶質(zhì)和由于物料切線流動和擴散帶走的溶質(zhì)基本保持平瓶增大壓力產(chǎn)生的壓餘使通量增大；而在壓力達到一定離后，超濾的初始通量很大，大量的溶質(zhì)Wii液帶至鵬表面并聚集形j^度極化層，濃差極化嚴重，這日彌大壓力產(chǎn)生的壓差會很快被加厚和壓實的凝膠層所抵消，所以通量不再隨著壓力變化，如果繼續(xù)增加壓力，反而可能 將一些與膜孔大小相近的分子壓進膜內(nèi),增加膜污染的危險，更嚴重的還會將膜壓實，造成膜不可逆的損壞。在本i微中，與"臨界壓差"微的0.06MPa為最髓濾壓力。圖4說明從圖中可以看出，隨著m的升高，膜通量也相應(yīng)的變大，m與m量成正相 關(guān)。這可能有兩方面的原因， 一方面是隨著鵬的升高，斷氐了蛋白粗提液的粘度，膜面上的大 ^t/質(zhì)向兩側(cè)溶液中擴ffcii^有所增加，從而離了濃差極化柳繊層的產(chǎn)生，通翻加；另一方面是隨著溫度的升高，加快了中空纖維超濾膜的聚，鏈節(jié)的微觀布朗運動使得單位時間單 位體積形成小孔的可能性增加，同時也增加了滲離分的、S^與擴散，結(jié)果4鵬的滲透性增強， 通量增加。值得注意的是，過高的^g會使蛋白質(zhì)變性，且易于形成^^層，還會導(dǎo)致中空纖維 超濾膜的過快老化，所以超濾時的鵬不育敏高。在本微中，4(TC為最佳的超濾鵬。圖5說明i^7K蛋白作為一種兩親性蛋白質(zhì)，很容易在疏冰的聚砜中空纖維掛濾mil自組裝成蛋白膜。為了盡量M^、成膜的可能性，就要使疏水蛋白遠離等電點，這樣可以使蛋白單體帶上相同的電荷，相互排斥，不易于鵬；另外由于遠離等電點，疏冰蛋白的溶解度增加，不易于聚 ,中空纖維超濾膜的表面，形成緊密的吸附層；再者由于蛋白帶電，就與水的親和力增加，相 應(yīng)的中空纖纟t^濾膜上的吸附量就減少，膜的通量就較高。HFBI疏^7K蛋白的等電點在6左右，在 圖中可以看出，當PH為6時，蛋白粗提液的通量是最低的，因為處于等電點的蛋白質(zhì)間的斥力是 最小的，很容易在膜表面沉積，在等電點附近的PH時，可以看出蛋白粗提液的通量提高的不是很明顯?？紤]到PH的調(diào)節(jié)對通量的影B向不是很大，且如果調(diào)節(jié)PH，還要增加一i!X^，所以本微 選取蛋白粗提液的初始PH=8為超濾PH值。圖6說明tt蛋白超濾7K溶^^^^真空冷凍干燥四十個小時之后，得到蛋白干粉。鵬 量蛋白干fH4行ricine-SDS-PAGE電泳及Western Blotting。結(jié)果如圖^，可以清楚的看至lj在 7.5KDa處有一條蛋白帶，進行Western Blotting檢測，確定其是HFBI。圖7說明實驗中4頓C18層析柱，tt^徑4.6咖，柱長25cm，柱^R4.15ml。 tt液A液 為20%乙腈,0.1%三氟乙酸；B液為80X， 0.1%三氟乙酸。進樣20ul， ？臓為lml/min。首先 將HFBI純品進fr液相色it^析，所做液相色譜為梯度洗脫。從圖中可以看到HFBI的出峰^g在 30%進禾1￡右。隨后將鄉(xiāng)Sl中空m隹自濾的樣品進行HPLC分析，梯度洗脫，A液和B液成分同 上?？梢钥吹?，HFBI的出峰艘也在30X進禾駐右，同純品出峰位置一致。圖8說明用S印hadex G25艦疏冰蛋白HFBI進行檢測，目的是為了^i正樣品中色素和鹽類是否己經(jīng)大部分被除去。結(jié)果如圖麻。橫坐標為時間(射中)，mM標為紫外和離子吸收。蛋白峰只有一個，離子吸收一直沒有什么變化?？梢?，用中空纖維自濾除去樣品中色素和鹽類的 效果非，。《腿合在工Jd:大規(guī)模^，可以大幅度附喊本。圖9說明將不同濃度的SDS標準溶液，通過吖啶橙法測定，499nm下的0D值。每種濃度 檢測5次，并求得平均值，將各i^處船鄉(xiāng)魏臉準曲線。對會敏中空纖維月驅(qū)濾的蛋白干, 行SDS賴檢測，代入公式求得SDS濃度值為0.02X。，說明經(jīng)過KC1沉淀和中空纖維^S濾，絕 大部分SDS已被除去，繊匕較理想。圖10說明艦行Tricine -SDS-PAGE電泳，第1—第5》媳為中空鄉(xiāng)書t^濾所得疏冰蛋 白HFBI， /A^向右各》媳的上樣量分別為7.5ng， 10ug， 12.5ixg， 15ng， 20yg ，第7^dt 為HFBI標準品，上樣量為2.5ug。然后用 M^像儀掃描，掃描結(jié)mffl軟件BandScan進行定量 分析。根據(jù)所 徵值，以樣品HFBI的質(zhì)量和光吸收H^坐標軸得到樣品的標準曲線。
權(quán)利要求
1、本發(fā)明涉及一種新的超濾方法提取II型真菌疏水蛋白，該方法包括以下步驟第一、用SDS法從真菌菌絲表面抽提II型真菌疏水蛋白，經(jīng)離心或板框過濾得到蛋白粗提液；第二、用KCl對蛋白粗提液進行處理，經(jīng)離心，板框或微濾以除去II型真菌疏水蛋白粗提液中70％-80％的SDS；第三、超濾，將KCl處理后的II型真菌疏水蛋白粗提液通過膜孔徑為3000-10000的中空纖維超濾膜，經(jīng)過超濾得到II型真菌疏水蛋白濃縮液；超濾結(jié)束后對超濾膜進行反洗，待用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求i戶;M的方法，，征在于，將第三步f導(dǎo)到n型真M7jc蛋白^L縮^^f亍常規(guī)噴霧千燥，得到含量在20%_30%的II型真菌疏水蛋白干粉。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1皿的方法，，征在于，超濾過程中所用的中空纖纟腿濾Mt質(zhì)為聚乙 烯、聚丙烯、H^乙烯、聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈或聚偏氟乙烯；中空纖會腿濾膜為巻 或管 規(guī)
4、 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項戶腿的方法，，征在于，超濾Jt行工藝^f牛為運行壓力 0. 02—0. 09MPa;運，亍溫度為20—45。C;運行PH為3—11;每超濾2小時需要反洗。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4中阮述的方法，其特征在于，所逸的反洗是^濾過程中用去離子水反沖 膜，以部分咴SMffi量；或頓濾結(jié)束時用水反 以提高11型真菌疏冰蛋白收率，然后用堿性 溶液W以完全咴繊通量。
全文摘要
一種適合在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的超濾法提取II型疏水蛋白的方法。本發(fā)明方法是超濾法，在超濾過程中使用的是膜孔徑為3000-10000的中空纖維超濾膜。超濾運行的工藝條件為運行壓力0.02-0.09MPa；運行溫度為20-45℃；運行pH為3-11；每超濾2小時需要反洗。本發(fā)明經(jīng)過超濾可得到II型疏水蛋白含量在20％-30％的蛋白濃縮液，疏水蛋白回收率在70％-90％之間。本方法可除去蛋白粗提液中大部分色素、無機鹽以及其它小分子物質(zhì)，操作簡單，分離效率高，運行成本低。
文檔編號C07K1/00GK101215321SQ200810052099
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日
發(fā)明者喬明強, 輝 馮, 馮樹人, 強 張, 徐海津, 王澤方, 黃渝健 申請人:喬明強