專利名稱：一種高效純化金屬離子結(jié)合蛋白的疏水層析分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)的分離純化方法，特別是涉及一種使用新型疏水層析純化金屬 離子結(jié)合蛋白的分離純化方法。
背景技術(shù)：
許多蛋白質(zhì)中含有金屬離子輔基，這些金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)具有重要 的意義。金屬離子結(jié)合蛋白質(zhì)的純化過程存在一些困難，在純化過程中金屬離子的喪失會(huì) 導(dǎo)致蛋白質(zhì)喪失天然結(jié)構(gòu)，內(nèi)部疏水性基團(tuán)的過度暴露會(huì)影響該蛋白質(zhì)在疏水層析過程中 的分辨率。在我們此前申請(qǐng)的專利(蘇志國，張焱等，異源同種乳清蛋白的分離純化方法，申 請(qǐng)?zhí)?00810118961. 7)中，報(bào)道了可以使用疏水層析方法分離性質(zhì)非常接近的牛源和人源 α -乳清白蛋白，但是在疏水層析操作條件下，α -乳清白蛋白結(jié)合的鈣離子容易發(fā)生沉淀 喪失進(jìn)而影響疏水層析的分辨率，因此疏水層析方法有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種純化金屬離子結(jié)合蛋白的新型疏水層析純化方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案步驟如下1)選取至少含有一種金屬離子結(jié)合蛋白的待分離原料，沉淀離心去除脂類和雜蛋 白后收集上清液獲得蛋白混合物；2)在所得蛋白混合物中添加過量的螯合劑去除乳清蛋白中的輔基金屬離子I ；3)所得蛋白混合物進(jìn)行透析操作去除螯合劑；4)在所得蛋白混合物中添加適量的輔基金屬離子II ；5)在疏水層析緩沖液中添加適量的輔基金屬離子II ；6)將乳清經(jīng)過疏水作用層析和凝膠過濾層析聯(lián)用的組合層析，分離得到金屬離子
結(jié)合蛋白ο本發(fā)明所述的待分離原料為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳液、轉(zhuǎn)基因工程菌的發(fā)酵液、轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物細(xì)胞的發(fā)酵液等，優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物乳液，所述的金屬離子結(jié)合蛋白優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因 人源α -乳清白蛋白、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白等；以下僅以一種蛋白的分離來加以說明，但本發(fā)明的保 護(hù)不局限與此；牛乳中總蛋白濃度為30-38g/L，異源同種乳清蛋白總濃度1.0-4.0g/L，優(yōu) 選蛋白總濃度為1.5-3. 5g/L。本發(fā)明所述的沉淀方法可采用酸性沉淀、凝乳酶沉淀或硫酸銨沉淀的方法。在采 用酸性沉淀時(shí)，需在室溫下將待分離原料調(diào)節(jié)PH到3. 5-5. 5，優(yōu)選的pH值為4. 0-5. 0，靜置 15分鐘，離心收集上清液。在采用凝乳酶法時(shí)，向待分離原料中加入濃度為5%的凝乳酶溶 液，牛乳與凝乳酶溶液體積比例為20-500 1，優(yōu)選的比例為50-200 1，室溫下反應(yīng)10 分鐘，離心收集上清液。在采用硫酸銨沉淀方法時(shí)，調(diào)節(jié)待分離原料的PH到5. 0-10.0，優(yōu)選 的PH值為6. 0-8.0，并通過加入硫酸銨粉末使得乳清中硫酸銨飽和度為20%-60%，以摩爾數(shù)計(jì)為0. 86-2. 95M，優(yōu)選的硫酸銨飽和度為30% -60%，以摩爾數(shù)計(jì)為1. 33-2. 37M，振蕩2 小時(shí)，離心收集上清液或收集沉淀并使用20mM磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后備用。本發(fā)明所述的螯合劑可以采用EDTA，8_羥基喹啉等。當(dāng)處理轉(zhuǎn)基因人源α -乳清 白蛋白時(shí)，優(yōu)選的螯合劑為EDTA ；當(dāng)處理轉(zhuǎn)基因人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白時(shí)，優(yōu)選的螯合劑為8-羥
基喹啉。本發(fā)明所述的乳清蛋白的輔基金屬離子I為鈣離子、三價(jià)鐵離子等，輔基金屬離 子I容易在酸性沉淀步驟中因?yàn)榈蚉H條件而同蛋白分離開，進(jìn)而在后續(xù)疏水層析緩沖液中 的陰離子如硫酸根反應(yīng)沉淀。喪失輔基金屬離子之后，金屬離子結(jié)合蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變 化，蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)的大量暴露導(dǎo)致疏水性的升高，從而使其與其它高疏水性的雜蛋 白之間的疏水性差異減少，影響疏水層析的分辨率。本發(fā)明所述的透析操作中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)異源同種乳清蛋白的類型和 螯合劑的類型選擇合適的截留分子量的透析膜或透析袋進(jìn)行透析，透析液緩沖液優(yōu)選為 20-100mM, pH6. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明所述的輔基金屬離子II，可以采用鉀離子、鈉離子、鎂離子等，優(yōu)選鉀離子， 添加量優(yōu)選為l_50mM。輔基金屬離子II可以同金屬離子結(jié)合蛋白相結(jié)合，且不會(huì)同疏水層 析緩沖液中的陰離子發(fā)生沉淀反應(yīng)，有利于保持金屬離子結(jié)合蛋白的空間結(jié)構(gòu)，有效地提 高其在疏水層析分離純化中的分辨率。本發(fā)明所述的疏水作用層析中，疏水作用層析介質(zhì)采用瓊脂糖材料為基質(zhì)，所述 的配基可為丁基、苯基、辛基，優(yōu)選為丁基。本發(fā)明所述的疏水作用層析中，可采用的疏水鹽為硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等，優(yōu) 選采用硫酸銨。本發(fā)明所述的疏水作用層析中，緩沖液體系可采用磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基 甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液；低鹽緩沖液優(yōu)選為 20-100mM, pH6. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液，緩沖液無疏水鹽或疏水鹽濃度在0. 5M以下，添加 輔基金屬離子II濃度優(yōu)選為l_50mM ；高鹽緩沖液優(yōu)選為20-100mM，pH6. 0-8. 0的磷酸鹽 緩沖液，疏水鹽濃度為0. 5-2. 0M，優(yōu)選濃度為0. 6-1. 2M，添加輔基金屬離子II濃度優(yōu)選為 l-50mMo本發(fā)明所述的疏水作用層析中，將處理得到的蛋白混合物溶液調(diào)節(jié)pH到 5. 0-10. 0，優(yōu)選的pH值為6. 0-8. 0 ；并將乳清溶液調(diào)節(jié)疏水鹽濃度為0. 5-2. 0M，優(yōu)選濃度為 0. 6-1. 5M，疏水鹽濃度采用低鹽緩沖液調(diào)節(jié)。本發(fā)明所述的疏水層析中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)金屬離子結(jié)合蛋白的種類選擇 合適的疏水層析介質(zhì)、層析柱和進(jìn)樣速度將經(jīng)預(yù)處理后的蛋白混合物溶液進(jìn)樣到用高鹽緩 沖液平衡好的疏水層析柱中，層析過程使用280nm紫外吸收波長進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測，進(jìn)樣 的蛋白混合物溶液體積為0. 5-5. 0倍層析柱體積，優(yōu)選為1. 0-3. 0倍層析柱體積。本發(fā)明所述的疏水層析中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)金屬離子結(jié)合蛋白的性質(zhì)選擇 合適的分離模式進(jìn)行純化。在吸附解吸分離模式中，蛋白混合物中金屬離子結(jié)合蛋白在適 宜的高鹽濃度下同疏水介質(zhì)的配基相結(jié)合保留在柱中，而低疏水性的雜質(zhì)蛋白則無法保 留，全部樣品進(jìn)樣完畢后，用高鹽緩沖液沖洗去疏水作用層析柱中未保留的蛋白，直到紫外 吸收波長回到基線；再用低鹽緩沖液洗脫，洗脫方式可為一步洗脫、階段洗脫、線形洗脫，收
4集洗脫液以得到金屬離子結(jié)合蛋白。在穿透分離模式中，蛋白混合物中的高疏水性雜質(zhì)蛋 白在適宜的高鹽濃度下同疏水介質(zhì)的配基相結(jié)合保留在柱中，而目標(biāo)金屬離子結(jié)合蛋白則 無法保留，收集穿透組分可以得到金屬離子結(jié)合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可調(diào)節(jié)工藝參數(shù)以得到不同的金屬離子結(jié)合蛋白的初步純化產(chǎn) 品或純品；由于本發(fā)明的疏水層析過程中添加適量的輔基金屬離子II，從而有效的保持金 屬離子結(jié)合蛋白的天然結(jié)構(gòu)，通過本步驟可以有效地純化金屬離子結(jié)合蛋白。本發(fā)明所述的凝膠過濾層析中，將金屬離子結(jié)合蛋白的初步純化產(chǎn)品再經(jīng)凝膠過 濾層析除去剩余雜質(zhì)以得到純品，凝膠過濾層析介質(zhì)為瓊脂糖介質(zhì)，優(yōu)選為Superdex 75。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，由于采用了在疏水層析過程中添加輔基金屬離子II的 方法，可有效地提高金屬離子結(jié)合蛋白與雜蛋白之間的疏水性差異，可調(diào)節(jié)具體疏水層析 的工藝條件，實(shí)現(xiàn)金屬離子結(jié)合蛋白的高效純化，得到不同的金屬離子結(jié)合蛋白初步純化 產(chǎn)品或純品；采用了凝膠過濾層析對(duì)初步純化產(chǎn)品進(jìn)行了進(jìn)一步的精制純化，得到了高純 度的金屬離子結(jié)合蛋白的純品；采用以疏水層析為核心的復(fù)合工藝方法，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，適 于進(jìn)行金屬離子結(jié)合蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)，產(chǎn)品純度高，工藝回收率高。


圖1為分離純化工藝流程2為疏水層析分離純化人源α-乳清白蛋白和牛源α-乳清白蛋白。圖3為凝膠過濾I分離純化人源α -乳清白蛋白。圖4為凝膠過濾II分離純化牛源α -乳清白蛋白。實(shí)施例1取IOOmL轉(zhuǎn)基因人源α -乳清白蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源α-乳 清白蛋白濃度為1.4g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為1.0g/L。乳液調(diào)節(jié)pH4. 6，靜置15分 鐘后使用Sigma 3k30離心機(jī)4攝氏度下，調(diào)離心力為IOOOOg離心30分鐘去除脂類和酪蛋 白后收集上清液獲得乳清80mL，總蛋白濃度為9. 5g/L，人源α -乳清白蛋白濃度為1. 7g/L， 牛源α-乳清白蛋白濃度為1.2g/L。向乳清中添加EDTA使得EDTA濃度為200mM，靜置15 分鐘后使用截留分子量為3KD的透析膜透析24小時(shí)，透析緩沖液使用pH7. 0的20mM磷酸 鹽緩沖液，透析完成后在乳清中添加硫酸鉀粉末使得硫酸鉀濃度為50mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳清pH到8. 0，緩慢加入硫酸銨粉末到乳清硫 酸銨濃度達(dá)到0. 8M，使用IM鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳清預(yù)處理樣品pH到8. 0，進(jìn)樣到用 20mM，pH7. 0含0. 8M硫酸銨，50mM硫酸鉀的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Butyl Sepharose 4FF 疏水層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100，紫外 280nm波長吸收檢測，流速10ml/min，上樣完畢后用20mM，pH8. 0含0. 8M硫酸銨，50M硫酸 鉀的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號(hào)回到基線，收集上樣的穿透峰150mL，總 蛋白濃度為3. 8g/L，人源α -乳清白蛋白濃度為0. 2g/L，牛源α -乳清白蛋白濃度為0. 5g/ L ；再用20mM，pH8. 0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰112mL，總蛋白濃度為1. 5g/L， 人源α-乳清白蛋白濃度為0.9g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0.2g/L。取疏水層析洗脫峰30mL進(jìn)樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù) 平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用20mM， pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共80mL，總蛋白濃度為 0.35g/L，人源α-乳清白蛋白濃度為0.32g/L，工藝回收率68%，純度91%，牛源α -乳清 白蛋白濃度為0. 02g/L。取疏水層析穿透峰30mL進(jìn)樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù) 平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設(shè)備 GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用20mM， pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共70mL，總蛋白濃度為 0. 22g/L，牛源α -乳清白蛋白濃度為0. 2g/L，工藝回收率70%，純度91 %，人源α -乳清白 蛋白濃度為0.01g/L。實(shí)施例2取IOOmL轉(zhuǎn)基因人源α -乳清白蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源α-乳 清白蛋白濃度為1.4g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為1.0g/L。乳液調(diào)節(jié)pH4. 7，靜置15分 鐘后使用Sigma 3k30離心機(jī)4攝氏度下，調(diào)離心力為IOOOOg離心15分鐘去除脂類和酪蛋 白后收集上清液獲得乳清80mL，總蛋白濃度為9. 5g/L，人源α -乳清白蛋白濃度為1. 7g/L， 牛源α-乳清白蛋白濃度為1.2g/L。向乳清中添加EDTA使得EDTA濃度為lOOmM，靜置15 分鐘后使用截留分子量為5KD的透析膜透析16小時(shí)，透析緩沖液使用pH7. 0的20mM磷酸 鹽緩沖液，透析完成后在乳清中添加硝酸鉀粉末使得硝酸鉀濃度為30mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳清pH到7. 0，緩慢加入硫酸銨粉末到乳清硫 酸銨濃度達(dá)到0. 9M，使用IM鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳清預(yù)處理樣品pH到7. 0，進(jìn)樣到用 20mM，pH7. 0含0. 9M硫酸銨，30mM硝酸鉀的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Octyl Sepharose 4FF 疏水層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100，紫外 280nm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH7. 0含0. 9M硫酸銨，30M硝酸 鉀的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號(hào)回到基線，收集上樣的穿透峰145mL，總 蛋白濃度為3. 9g/L，人源α-乳清白蛋白濃度為0. lg/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 5g/ L ；再用20mM，pH7. 0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰120mL，總蛋白濃度為1. 4g/L， 人源α-乳清白蛋白濃度為1.0g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. lg/L。取疏水層析洗脫峰30mL進(jìn)樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù) 平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設(shè)備 GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用20mM， pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共85mL，總蛋白濃度為 0.37g/L，人源0-乳清白蛋白濃度為0.358/1，工藝回收率85%，純度95%，牛源α -乳清 白蛋白濃度為0.01g/L。取疏水層析穿透峰30mL進(jìn)樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù) 平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設(shè)備 GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用20mM， pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共75mL，總蛋白濃度為 0. 18g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 17g/L，工藝回收率62%，純度94%，人源α -乳清 白蛋白濃度為0.01g/L。
實(shí)施例3取IOOmL轉(zhuǎn)基因人源α -乳清白蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源α-乳 清白蛋白濃度為1.4g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為1.0g/L。乳液調(diào)節(jié)pH4. 6，靜置15分 鐘后使用Sigma 3k30離心機(jī)4攝氏度下，調(diào)離心力為IOOOOg離心30分鐘去除脂類和酪蛋 白后收集上清液獲得乳清80mL，總蛋白濃度為9. 5g/L，人源α -乳清白蛋白濃度為1. 7g/L， 牛源α-乳清白蛋白濃度為1.2g/L。向乳清中添加EDTA使得EDTA濃度為150mM，靜置15 分鐘后使用截留分子量為IKD的透析膜透析18小時(shí)，透析緩沖液使用pH7. 0的20mM磷酸 鹽緩沖液，透析完成后在乳清中添加氯化鉀粉末使得氯化鉀濃度為20mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳清pH到6. 0，緩慢加入硫酸銨粉末到乳清 硫酸銨濃度達(dá)到0. 7M，使用IM鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳清預(yù)處理樣品pH到6. 0，進(jìn)樣到 用20mM，pH6. 0含0. 7M硫酸銨，20mM氯化鉀的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Phenyl Sepharose 4FF疏水層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100，紫 外280nm波長吸收檢測，流速lOml/min，上樣完畢后用20mM，pH6. 0含0. 7M硫酸銨，20M氯化 鉀的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號(hào)回到基線，收集上樣的穿透峰140mL，總 蛋白濃度為3. 8g/L，人源α -乳清白蛋白濃度為0. 2g/L，牛源α -乳清白蛋白濃度為0. 4g/ L ；再用20mM，pH6. 0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰IlOmL,總蛋白濃度為1. 6g/L， 人源α-乳清白蛋白濃度為0.9g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 3g/L。取疏水層析洗脫峰30mL進(jìn)樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù) 平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設(shè)備 GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用20mM， pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共80mL，總蛋白濃度為 0.36g/L，人源0-乳清白蛋白濃度為0.328/1，工藝回收率67%，純度89%，牛源α -乳清 白蛋白濃度為0. 03g/L。取疏水層析穿透峰30mL進(jìn)樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù) 平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設(shè)備 GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用20mM， pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共69mL，總蛋白濃度為 0.21g/L，牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 17g/L，工藝回收率55%，純度81%，人源α -乳清 白蛋白濃度為0.01g/L。實(shí)施例4取IOOmL含有轉(zhuǎn)基因人源α -乳清白蛋白的CHO細(xì)胞分泌液，總蛋白濃度為IOg/ L，人源α-乳清白蛋白濃度為1.2g/L。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)分泌液pH到 9. 0，緩慢加入硫酸銨粉末到硫酸銨飽和度為50%，以摩爾記數(shù)為2. 37M，在室溫下振蕩2小 時(shí)后，將沉淀樣品使用Sigma 3k30離心機(jī)4攝氏度下，調(diào)離心力為IOOOOg離心30分鐘并 收集上清液81mL，上清液總蛋白濃度9.5g/L，人源α -乳清白蛋白濃度為1. 4g/L。向處理 所得蛋白混合物中添加EDTA使得EDTA濃度為IOOmM,靜置15分鐘后使用截留分子量為2KD 的透析膜透析24小時(shí)，透析緩沖液使用pH7. 0的20mM磷酸鹽緩沖液，透析完成后在蛋白溶 液中添加硫酸鉀粉末使得硫酸鉀濃度為40mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH到6. 0，緩慢加入硫酸銨粉末到蛋白溶液硫酸銨濃度達(dá)到1.0M，使用IM鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液處理樣品 PH到6. 0，進(jìn)樣到用20mM，pH6. 0含1. OM硫酸銨，40mM硫酸鉀的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好 的Butyl Sepharose 4FF疏水層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速10ml/min，上樣完畢后用20mM，pH6. 0 含1. OM硫酸銨，40M硫酸鉀的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號(hào)回到基線，再 用20mM，pH6. 0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰108mL，總蛋白濃度為1. 7g/L，人源 α-乳清白蛋白濃度為0. 8g/L。取疏水層析洗脫峰30mL進(jìn)樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù) 平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設(shè)備 GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用20mM， pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集230mL處的蛋白峰共82mL，總蛋白濃度為 0. 3g/L，人源α -乳清白蛋白濃度為0. 28g/L，工藝回收率69 %，純度93 %。實(shí)施例5取IOOmL轉(zhuǎn)基因人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白牛乳，牛乳總蛋白濃度為33g/L，人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白 濃度為1.7g/L，牛源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. lg/L。向牛乳中加入濃度為5%的凝乳酶溶液，牛 乳與凝乳酶溶液體積比例為50 1，室溫下反應(yīng)10分鐘，使用Sigma 3k30離心機(jī)4攝氏度 下，調(diào)離心力為IOOOOg離心10分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲得乳清80mL，總蛋白 濃度為9. 5g/L，人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為2. Og/L，牛源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 12g/L。向乳清中 添加8-羥基喹啉使得8-羥基喹啉濃度為200mM，靜置15分鐘后使用截留分子量為5KD的 透析膜透析20小時(shí)，透析緩沖液使用pH7. 0的20mM磷酸鹽緩沖液，透析完成后在乳清中添 加硫酸鉀粉末使得硫酸鉀濃度為50mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳清pH到8. 0，緩慢加入硫酸銨粉末到乳清 硫酸銨濃度達(dá)到1. 0M,使用IM鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳清預(yù)處理樣品pH到8. 0，進(jìn)樣到 用20mM，pH8. 0含1. OM硫酸銨，50mM硫酸鉀的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100，紫 外280nm波長吸收檢測，流速10ml/min，上樣完畢后用20mM，pH8. 0含1. OM硫酸銨，50M硫 酸鉀的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號(hào)回到基線，收集上樣的穿透峰145mL， 總蛋白濃度為3. 8g/L，人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 2g/L，牛源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 05g/L ；再 用20mM，pH8. 0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰120mL，總蛋白濃度為1. 5g/L，人源 乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 9g/L，牛源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 01g/L。取疏水層析洗脫峰30mL進(jìn)樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù) 平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設(shè)備 GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用20mM， PH7.0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集170mL處的蛋白峰共81mL，總蛋白濃度為 0. 35g/L，人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 3g/L，工藝回收率57%，純度86%，牛源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃 度為 0. 002g/L。取疏水層析穿透峰30mL進(jìn)樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù) 平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設(shè)備 GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用20mM，
8PH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集170mL處的蛋白峰共72mL，總蛋白濃度為 0. 28g/L，牛源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 02g/L,工藝回收率70 %，純度7 %，人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃 度為 0. 06g/L。實(shí)施例6取IOOmL含有轉(zhuǎn)基因人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的E. Coli發(fā)酵液，總蛋白濃度為20g/L，人源 乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0.6g/L。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH到7.0，緩慢 加入硫酸銨粉末到蛋白溶液硫酸銨飽和度為40%，以摩爾記數(shù)為1. 84M，在室溫下振蕩2小 時(shí)后，將沉淀樣品使用Sigma 3k30離心機(jī)4攝氏度下，調(diào)離心力為IOOOOg離心30分鐘收 集沉淀，并使用85mLpH7. 0的20mM磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，上清液總蛋白濃度10g/L，人源乳轉(zhuǎn) 鐵蛋白濃度為0. 5g/L。向蛋白溶液中添加EDTA使得EDTA濃度為200mM，靜置15分鐘后使用截留分子量 為2KD的透析膜透析12小時(shí)，透析緩沖液使用pH7. 0的20mM磷酸鹽緩沖液，透析完成后在 蛋白溶液中添加硫酸鉀粉末使得硫酸鉀濃度為30mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH到7. 0，緩慢加入硫酸銨粉末使 得蛋白溶液硫酸銨濃度達(dá)到0. 9M，使用IM鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液預(yù)處理樣品 PH到7. 0，進(jìn)樣到用20mM，pH7. 0含0. 9M硫酸銨，30mM硫酸鉀的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好 的Butyl Sepharose 4FF疏水層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度10厘米，層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速10ml/min，上樣完畢后用20mM，pH7. 0 含0. 9M硫酸銨，30M硫酸鉀的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號(hào)回到基線，再 用20mM，pH7. 0的磷酸鹽緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰118mL，總蛋白濃度為1. 2g/L，人源 乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 35g/L。取疏水層析洗脫峰30mL進(jìn)樣到用20mM，pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù) 平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米，柱床高度60厘米，層析設(shè)備 GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速2mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用20mM， pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集170mL處的蛋白峰共85mL，總蛋白濃度為 0. 14g/L，人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 12g/L，工藝回收率67%，純度86%。
9
權(quán)利要求
高效純化金屬離子結(jié)合蛋白的疏水層析分離純化方法，其步驟包括1)選取至少含有金屬離子結(jié)合蛋白的待分離原料，沉淀離心去除脂類等雜質(zhì)后收集上清液獲得蛋白混合物；2)在所得蛋白混合物中添加過量的金屬離子螯合劑去除目標(biāo)蛋白中的輔基金屬離子I；3)所得蛋白混合物進(jìn)行透析操作去除金屬離子螯合劑；4)在所得蛋白混合物中添加適量的輔基金屬離子II；5)在疏水層析緩沖液中添加適量的輔基金屬離子II；6)將蛋白混合物經(jīng)過疏水作用層析和凝膠過濾層析聯(lián)用的組合層析，分離得到金屬離子結(jié)合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的待分離原料為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳液、轉(zhuǎn)基因工程菌的 發(fā)酵液、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞的發(fā)酵液。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是有金屬離子結(jié)合能力的蛋白，如重 組人源α-乳清白蛋白，牛源α-乳清白蛋白，重組人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白等。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，螯合劑為EDTA，8_羥基喹啉等。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，輔基金屬離子I為鈣離子。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，在蛋白混合物及疏水層析緩沖液中添加的輔基金屬離子 II為鉀離子。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，疏水層析介質(zhì)為常用的蛋白質(zhì)層析介質(zhì)，如瓊脂糖基質(zhì) 的丁基疏水介質(zhì)等。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，疏水層析所用的鹽為硫酸銨，其濃度為0.5-2M硫酸銨，優(yōu) 選為0. 6-1. 5M硫酸銨。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，疏水層析所用的緩沖體系為磷酸鹽緩沖液。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，疏水層析單次處理量為2倍柱體積的蛋白混合物原料。
全文摘要
本發(fā)明一種高效純化金屬離子結(jié)合蛋白的疏水層析分離純化方法，其步驟為選取含有金屬離子結(jié)合蛋白的待分離物料，添加沉淀劑進(jìn)行沉淀粗分離獲得蛋白混合物。在蛋白混合物中添加過量的螯合劑去除目標(biāo)蛋白的輔基金屬離子I，透析去除螯合劑后添加適量不易沉淀的金屬離子II，以保持目標(biāo)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。將處理所得蛋白混合物進(jìn)行疏水層析分離操作，并在層析緩沖液中添加適量的金屬離子II，由于金屬離子輔基II可以有效地保持目標(biāo)蛋白的天然結(jié)構(gòu)，因此可以有效地提高目標(biāo)蛋白與雜蛋白在疏水層析中的分辨率。進(jìn)一步通過凝膠過濾層析可以得到高純度、高回收率的金屬離子結(jié)合蛋白的純品，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，適于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/79GK101948529SQ201010252608
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者張焱, 羅堅(jiān), 蘇志國, 馬光輝 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院過程工程研究所