專利名稱：他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3復(fù)合物在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg 3在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是江蘇省的高發(fā)腫瘤，進(jìn)展迅速，其發(fā)病率、死亡率均較高。除可切除的小型肝癌患者的5年存活率達(dá)到80 90%外，不能手術(shù)的肝癌患者自癥狀發(fā)作后的平均存活時(shí)間只有3 4個(gè)月。目前肝癌治療仍以手術(shù)切除為主，然而能夠施行完全肝癌切除手術(shù)患者比例不到肝癌總例數(shù)的10%，其余90%肝癌患者不能手術(shù)切除肝癌，或即便能手術(shù)切除肝癌，80%的病人在術(shù)后兩年內(nèi)復(fù)發(fā)。許多臨床病理因素影響其愈后，并可作為肝癌的愈后因子。其中Survivin已被報(bào)道是預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)的一種有用指標(biāo)；磷酸化Akt (p-Akt)過度表達(dá)常常與肝癌預(yù)后不良密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)survivin、p-Akt異常表達(dá)是肝癌手術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因子，且兩者可作為肝癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立的危險(xiǎn)因子。因此，有這些危險(xiǎn)因素的肝癌病人，術(shù)后要考慮給予輔助治療。肝癌藥物輔助治療及術(shù)后治療成了一個(gè)重要方法。目前常用的化療藥物有阿霉素、氟尿嘧啶、順鉬等進(jìn)行靜脈或肝動脈輸注或栓塞化療，然而由于肝癌時(shí)肝臟已經(jīng)受到嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致具體治療選擇受到很大制約，而且這些療法不僅毒性嚴(yán)重，且通常也無明顯疾病緩解或延長生命效果。靶向治療藥物sorafenib具有抗腫瘤血管形成和抗細(xì)胞增殖作用，因副作用輕，能延長病人的生存而受腫瘤關(guān)注，但因其價(jià)格昂貴，限制了其在臨床使用。因此，迫切需要有效、低毒及價(jià)廉的藥物，為肝癌的治療提供一個(gè)新措施。近年來國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中存在雌激素受體，雌激素通過雌激素受體介導(dǎo)的信號通路來誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生。原發(fā)性肝癌組織雌激素受體表達(dá)的陽性率與肝癌的分期有關(guān)，提示早期的肝癌可能更大程度上依賴雌激素，為肝癌的內(nèi)分泌治療提供了理論依據(jù)。他莫昔芬是一種非留體抗雌激素藥物，因其療效好，副作用輕，價(jià)格低廉已廣泛用于雌激素受體陽性的各期乳腺癌的治療。其抗腫瘤作用是通過雌激素受體依賴和非雌激素受體依賴的機(jī)制誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。目前，在肝癌研究中也發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬除了通過與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮作用外，還通過調(diào)節(jié)蛋白激酶C活性、氧化應(yīng)激、鈣內(nèi)流機(jī)制發(fā)揮作用。新近研究發(fā)現(xiàn)他莫昔芬通過下調(diào)端粒酶活性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。臨床隨機(jī)對照研究結(jié)果顯示，晚期、無法進(jìn)行手術(shù)切除的肝癌患者，口服他莫昔芬能夠延長病人生存且無明顯毒副反應(yīng)，初步顯示出他莫昔芬在肝癌治療中良好的應(yīng)用前景。因此，在晚期肝癌或肝癌術(shù)后患者中值得推廣使用。目前文獻(xiàn)報(bào)道在臨床應(yīng)用一般為他莫昔芬，或他莫昔芬和雷帕霉素聯(lián)用，但實(shí)際臨床經(jīng)驗(yàn)獲知患者在使用上述藥物時(shí)，仍然發(fā)現(xiàn)療效增效不大，且特別是患者為手術(shù)切除肝癌的患者，復(fù)發(fā)率較高，且術(shù)后愈合緩慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3復(fù)合物在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用治療肝癌的新方案。人參皂苷Rg3 ;本發(fā)明的技術(shù)方案為
他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。按重量分?jǐn)?shù)計(jì)所述的復(fù)合物由人參皂苷Rg3 1-2份，他莫昔芬1-2份，雷帕霉素0. 01-0. 02份構(gòu)成。有益效果
I、他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3治療肝癌時(shí)，能增加肝癌細(xì)胞對化療的敏感性。他莫昔芬通過抑制Akt的活性誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞凋亡，而當(dāng)Akt通路激活后則誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生對他莫昔芬的耐藥。三者聯(lián)用，能協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)人參皂苷Rg3能夠抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)，從而抑制腫瘤血管的形成；還能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，干擾內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，從而阻斷腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移，提高手術(shù)治療的徹底性，減少術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的幾率，能夠提高腫瘤病人的自身免疫力，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，并降低腫瘤病人放化療后的毒副作用。2、本發(fā)明通過復(fù)方組配的復(fù)合物治療肝癌，發(fā)揮各種藥物的協(xié)同作用，同時(shí)降低單個(gè)藥物副作用，其組方療效顯著。


附圖I為不同藥物對survivin、p-Akt陽性表達(dá)患者的生存時(shí)間,其中A組觀察組；B組單藥治療組；C組三藥聯(lián)合治療組。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素人參皂苷Rg3復(fù)合物以下簡稱復(fù)合物，且所述的復(fù)合物由人參皂苷Rg3 l_2g，他莫昔芬l-2g，雷帕霉素 0. 01-0. 02mg 構(gòu)成。實(shí)施例I
I.試劑RPMI-1640培養(yǎng)基為美國GIBCOL BRL公司產(chǎn)品；鼠抗survivin、p70s6kThr389單克隆抗體購自Cell signal公司；二抗HRP標(biāo)記抗鼠lgG、化學(xué)發(fā)光(ECL)底物購自Santa Cruz公司；他莫昔芬,雷帕霉素、人參阜苷Rg3皆購自Sigma公司，海腎突光素酶質(zhì)粒pRL-CMV購自Promega公司。質(zhì)粒pLUC編碼螢火蟲熒光素酶基因和survivin啟動子序列由美國北卡羅里大學(xué)Xun博士惠贈。2.細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌IfepG2細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中，內(nèi)加10%小牛血清、人青霉素(濃度100 U/ml)和鏈霉素(濃度100 u g/ml)，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育箱內(nèi)貼壁生長3 4代后，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.分組將對數(shù)生長期細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔I X IO4個(gè)細(xì)胞接種到6孔板，每孔加100 u I, 37°C、5%C02濕度培養(yǎng)箱中24h后，第二天分別加入含有20 u M他莫昔芬、IOnM雷帕霉素(在20 ii M他莫昔芬前I小時(shí))，IOnM復(fù)合物，同時(shí)設(shè)立陰性對照，即陽性對照組為20 y M他吳昔分、IOnM雷帕霉素(在20 y M他吳昔分如I小時(shí))。
4.四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法實(shí)驗(yàn)將對數(shù)生長期細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔2 X IO3個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔加100 μ I, 37°C、5%C02濕度培養(yǎng)箱中24h后，分別加入含有不同濃度他莫昔芬、雷帕霉素、復(fù)合物的培養(yǎng)液100 μ 1，每個(gè)樣本不同濃度設(shè)平行的3個(gè)孔，對照組加不含樣本的培養(yǎng)液100μ 1，再放入培養(yǎng)箱中孵育24 72 h。每孔加入用無血清1640按5mg/ml新鮮配制的MTT溶液20 μ I。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μ I 二甲亞砜，振蕩lOmin，測定490nm波長上各孔A值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
復(fù)合物以濃度依賴方式減少H印G2細(xì)胞增殖，與對照藥組比較，復(fù)合物濃度達(dá)到20 μ M時(shí)，細(xì)胞增殖活性下降至50%。復(fù)合物濃度在10 μ M時(shí)，細(xì)胞增殖活性下降與G0/G1期細(xì)胞比例增加有關(guān)。5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡將各組細(xì)胞用胰酶消化后收集，水平離心5min，PBS洗2遍，離心棄上清，加入Iml 70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4°C固定12h以上。PBS洗滌去乙醇，1500rpm, 5min,棄上清,共洗2遍。Iml PBS重懸細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度達(dá)104/ml個(gè)，加入PI染液11111，41冰箱，染色30-601^11。離心，洗去PI染液，加少許PBS，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。RT-PCR:采用Invitrogen公司的Trizol試劑，按照操作步驟提取細(xì)胞中的總RNA0以此RNA為模板，加入2. 5mol/L oligo (dT) 16和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，在37 °C水浴Ih,95°C維持滅活5 min,合成cDNA,合成的cDNA用于RT-PCR。survivin:上游引物5’ -GGCTCTTTCTCTGTCCAGTT-3’，下游引物 5’ -ACCACCGCATCTCTACATTC-3’。Western blot試驗(yàn)各組細(xì)胞經(jīng)冰PBS洗2次,加裂解液,冰上裂解IOmin,離心取上清。采用BCA蛋白質(zhì)定量法測定蛋白質(zhì)濃度，電泳前加2 X SDS緩沖液，10CTC水浴lOmin，60μ g蛋白進(jìn)行12% SDS-聚烯酰胺凝膠電泳；蛋白分離后，電泳轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，室溫封閉Ih, 一抗(鼠抗survivin ；p70s6k Thr389) 4°C過夜,二抗室溫lh,米用ECL顯影，暗室壓片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果RT-PCR和Western法檢測了 20 μ M復(fù)合物，處理H印G2細(xì)胞48小時(shí)后survivin mRNA和蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示survivin mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低。用帶有158bp的survivin核啟動子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,再用他莫昔芬處理,與對照相比，survivin啟動子的活性急劇下降，結(jié)果提示復(fù)合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且優(yōu)于單個(gè)藥物。8.轉(zhuǎn)染于轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種到24孔板培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天細(xì)胞生長面積達(dá)70%，每個(gè)孔加400ng pLUC-sur，2ng海腎熒光素酶質(zhì)粒pRL -CMV，以空質(zhì)粒pcDNA3 . I為對照，按照Lipofectamine轉(zhuǎn)染說明操作，轉(zhuǎn)染至!fepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌后，分別加入無血清培養(yǎng)液I. 0ml，分別加入他莫昔芬、雷帕霉素，對照組加入等體積的無菌超純水，繼續(xù)培養(yǎng)6h，收集細(xì)胞，清洗細(xì)胞，每孔加入100 μ I雙熒光素酶檢測試劑盒中的細(xì)胞裂解液，進(jìn)行細(xì)胞裂解收集。取20 μ I細(xì)胞裂解產(chǎn)物，進(jìn)行目的報(bào)告基因熒火蟲熒光素酶及內(nèi)對照海腎素?zé)晒馑孛笝z測，計(jì)算熒火蟲熒光素酶的表達(dá)值與內(nèi)對照腎素?zé)晒馑孛副磉_(dá)值的比值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果HepG2細(xì)胞用復(fù)合物處理后，與對照相比，雷帕霉素單獨(dú)使用減少細(xì)胞生長20%, survivin單獨(dú)使用減少細(xì)胞生長45%,聯(lián)合用藥使用減少細(xì)胞生長近65%,顯示出復(fù)合物在抑制細(xì)胞增殖中有協(xié)同作用。、
實(shí)施例2
他莫昔芬抑制腫瘤生長在乳腺癌及肝癌的實(shí)驗(yàn)中已取得了明顯的療效，他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3能增強(qiáng)其細(xì)胞毒性藥物的效果。因此他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3聯(lián)合治療，將為肝癌治療提供一種高效、低毒、價(jià)廉的手段。我們已在臨床開展檢 測肝癌術(shù)后組織標(biāo)本中survivin、p-Akt> ER表達(dá)100余例，對survivin、p-Akt陽性表達(dá)患者在門診隨訪過程中部分應(yīng)用莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素人參阜苷Rg3、他莫昔芬單藥治療和對照觀察隨訪，至少2個(gè)以上療程。結(jié)果顯示與單藥治療組和觀察組(對照組未給藥)相比，三藥聯(lián)合治療組(莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3復(fù)合物由人參皂苷Rg3 1-2份，他莫昔芬1-2份，雷帕霉素0. 01-0. 02份構(gòu)成)具有協(xié)同作用，能夠延長肝癌患者緩解及生存時(shí)間，價(jià)格低廉且無明顯不良反應(yīng)，值得在臨床進(jìn)一步推廣。具體為病案號為465289，465529，465309，466861,466546，466247，467585，468199，469578，470655，0476917，0478973。
權(quán)利要求
1.他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3復(fù)合物在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用，其中按重量分?jǐn)?shù)計(jì)所述的復(fù)合物由人參皂苷Rg3 1-2份，他莫昔芬1-2份，雷帕霉素0. 01-0. 02 份構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明涉及他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3治療肝癌時(shí)，能增加肝癌細(xì)胞對化療的敏感性。他莫昔芬通過抑制Akt的活性誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞凋亡，而當(dāng)Akt通路激活后則誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生對他莫昔芬的耐藥。三者聯(lián)用，能協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)人參皂苷Rg3能夠抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)，從而抑制腫瘤血管的形成；還能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，干擾內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，從而阻斷腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移，提高手術(shù)治療的徹底性，減少術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的幾率，能夠提高腫瘤病人的自身免疫力，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，并降低腫瘤病人放化療后的毒副作用。
文檔編號A61P35/00GK102626416SQ20121014395
公開日2012年8月8日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者朱蔚友, 束永前, 王同杉, 郭人花, 金時(shí)代, 陳小鋒 申請人:江蘇省人民醫(yī)院