專利名稱：包含細胞的藥物組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新穎的免疫隔離化細胞的藥物組合物，其制備方法及其在腫瘤疾病中的應用。
背景技術：
目前采用三大手段(手術切除、化療、放療)治療惡性腫瘤的治愈率很低。手術只能切除肉眼所辨別的腫瘤組織；放療或化療僅能殺滅部分的腫瘤細胞，殘存瘤細胞成為腫瘤復發(fā)和轉移的根源；同時，放療和化療存在毒副作用大、全身使用的藥物進入腫瘤區(qū)甚少及易產生耐藥等缺點。惡性腫瘤的治療仍是一世界性難題。一些蛋白質因子可抑制腫瘤組織的生長，但臨床難以應用。研究已顯示一些蛋白質等因子可殺死腫瘤細胞和/或抑制腫瘤組織生長，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血管抑素(Angiostatin，AST)、內皮抑素(Endostatin, EST)等。由于腫瘤組織的快速生長是與腫瘤血管的快速生長相關，阻斷新血管的生成就可有效地抑制腫瘤的生長和轉移。實驗證明在腫瘤局部注射大劑量的TNF，證明能直接殺死多種腫瘤細胞或抑制腫瘤增殖，無嚴重的毒副作用。將AST、EST等因子注射于腫瘤內部或連續(xù)靜脈注射，可選擇性地抑制腫瘤組織內毛細血管的生長，從而可減少腫瘤細胞的血液及營養(yǎng)物的供應，而對正常血管和細胞無抑制作用，具有明確的抑制動物實體瘤生長的作用，如肝癌、肺癌、腦膠質瘤等。該類因子的抗癌效果具有廣譜性、低毒性及不易產生耐藥性等優(yōu)點。這些腫瘤抑制因子(TIF)和裸DNA半衰期短、易在體內降解，必須反復多次地大量的注射入腫瘤局部，臨床使用困難，特別是對深部腫瘤。而全身使用TIF的毒副作用很大， 如低血壓等。同時，全身用藥后活性成分在腫瘤局部的藥物濃度很低，治療效果差；并且全身使用TIF的價格極昂貴。以上因素使得TIF難以在臨床中應用于治療腫瘤。將具有分泌抑瘤和/或殺瘤因子功能的細胞植入瘤體內，具有較好的治療腫瘤效果，但這種治療方式存在免疫反應和過度生長成瘤的難題。雖然有研究將TNF或EST基因直接導入腫瘤動物體內或瘤細胞中，產生了一定的抑瘤效應。然而，這種基因治療方法除了存在注射后易于引起炎癥和免疫反應的問題，還存在著目的基因表達不穩(wěn)定、轉染效率低、病毒載體具有潛在地危險性等目前難以解決的問題。國外有研究嘗試將單一種類的EST或者AST基因轉染入具有高增殖活性的載體細胞內，并將分泌EST或者AST的基因工程細胞植入模型動物的瘤體內，可觀察到腫瘤區(qū)血管生成減少，產生了一定的抑制腫瘤生長的效果。但這種抑制腫瘤生長的效果并不理想，尚達不到殺死腫瘤細胞及治療腫瘤的目的。分析其原因可能為(1)由于異基因的載體細胞植入不可避免地會引起宿主體產生免疫排斥反應，導致載體細胞死亡；( 高增殖活性的基因載體細胞會在宿主體內過度的生長，存在載體細胞產生新的腫瘤的危險；C3)植入的基因工程細胞僅能分泌單一種類的抑瘤或殺瘤因子，不足以殺死腫瘤細胞。已經知曉，免疫隔離膜包裹細胞可防止移植免疫排斥反應。近年發(fā)展起來的免疫隔離技術是用能截割大于16萬道爾頓分子的半透膜包裹細胞，植入宿主體內后，該膜在允許小分子的營養(yǎng)物和分泌物自由擴散的情況下，能截割大于16萬道爾頓的免疫活性物質(免疫球蛋白、免疫活性細胞等)，從而發(fā)揮防止免疫排斥反應和維持膜內細胞生存的效應。目前的免疫隔離膜可由多種材料構成，并有多種形式，如中空纖維管、大包囊、微囊、灌流小室等。國內、外均已有研究證明采用免疫隔離膜包裹異基因細胞，植入體內后可有效地防止免疫排斥反應的發(fā)生，同時可維持囊內細胞的生存和分泌。實驗顯示出海藻酸鈣-聚賴氨酸-海藻酸鈣構成的球型半透膜(ΑΡΑ微囊)具有較好的生物相容性，在小、大動物體內可較長時間(約4年)完好存在。在胰島、肝細胞、甲狀旁腺、腎上腺髓質嗜鉻細胞和基因重組人生長激素分泌細胞移植治療疾病模型動物的研究中，已證明具有保護異種移植物免受宿主免疫系統(tǒng)破壞的作用。CN1408437A公開了治療惡性腫瘤疼痛的微囊腎上腺髓質細胞由ACA微囊或APA微囊包埋人或動物的腎上腺髓質細胞形成，微囊截留分子量為68-97. 4KD。治療惡性腫瘤的微囊腎上腺髓質細胞的制備方法包括分離、培養(yǎng)、微囊化、凍存和復溫5個步驟，即首先從人或動物的腎上腺體中分離出腎上腺髓質細胞并在培養(yǎng)液中短期培養(yǎng)，然后利用ACA或APA 微囊腎上腺髓質細胞并利用液氮凍存，移植前在37°C溫度下復溫。本發(fā)明中治療惡性腫瘤疼痛的微囊腎上腺髓質細胞存活率高并保有兒茶酚胺分泌功能，移植到人的珠網膜下腔時有明顯的鎮(zhèn)痛作用并可產生免疫隔離效果，故特別適用于臨床治療惡性腫瘤疼痛。CN1954887A公開了一種體外抗癌藥物篩選模型的制備方法，其特征在于以海藻酸鈉、聚賴氨酸為材料，制備APA微囊化腫瘤細胞；經過培養(yǎng)，微囊內細胞聚集成球并逐漸增大，形成類似于體內的三維生長方式，即為體外抗癌藥物篩選模型。CN1962855A公開了一種構建干細胞體外增殖分化微環(huán)境的方法，以海藻酸鈉、 聚賴氨酸為材料，制備APA微囊化ES細胞；將微囊化ES細胞加入到ES生長培養(yǎng)基中，置 370C，空氣中含體積5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每2-3天定期更換培養(yǎng)基，即為干細胞體外增殖分化的微環(huán)境。本發(fā)明操作簡單，既能實現(xiàn)ES細胞體外的高密度培養(yǎng)和規(guī)?；瘮U增，同時又能抑制或者延緩ES細胞走向分化，即最大限度的維持ES細胞未分化潛能的技術方法。 本發(fā)明不但能實現(xiàn)干細胞在體外的規(guī)模化擴增，還可為干細胞與其它轉基因細胞的共培養(yǎng)研究提供理想的試驗模型，在基礎發(fā)育生物學和下游的臨床應用研究中發(fā)揮重要作用。CN1962856A公開了實現(xiàn)干細胞定向增殖分化的方法，以海藻酸鈉、聚賴氨酸為材料，制備APA微囊化小鼠胚胎干細胞；將微囊化小鼠胚胎干細胞定向植入生物體內不同解剖學部位，即可實現(xiàn)干細胞的定向增殖分化。本發(fā)明建立了一種操作簡單，并可廣泛應用于干細胞體內定位移植、回收及體內定向誘導分化研究的新技術。其通過體外制備APA微囊化小鼠ES細胞后再行腹腔內移植、回收，并進一步檢測回收細胞的分化狀態(tài)來實現(xiàn)的；該方法既結合了 APA微膠囊免疫隔離的生物學特性及易于定向植入、回收的優(yōu)勢，同時又能夠詳實考察體內微環(huán)境(或組織環(huán)境)對干細胞增殖及分化的影響。CN1730099A公開了免疫隔離化細胞藥物，其制備方法和其在殺傷和/或抑制腫瘤中的應用。用于治療腫瘤的免疫隔離化細胞產品，其組成和用法是1.可截割免疫活性物質的半透膜一免疫隔離膜包裹活細胞；2.該活細胞可分泌抑制腫瘤生長和/或殺死腫瘤細胞的因子；為兩種以上活細胞共包裹；3.將該藥物注入腫瘤組織或手術切除后的殘余腫瘤組織內，用于殺死腫瘤細胞和/或抑制腫瘤組織的生長。一次性注入后，該細胞藥物能在腫瘤組織內長時間地分泌抑瘤和/或殺瘤的因子，發(fā)揮治療腫瘤的作用。盡管如此，本領域仍然需要有能夠克服至少現(xiàn)有技術中存在的問題的免疫隔離化細胞藥物，例如具有至少如下一種期待的性能隔離免疫原性、防止植入細胞過度生長、較高的細胞包裹率、優(yōu)良的細胞存活性能等。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種免疫隔離化細胞的藥物組合物，其具有至少如下一種期待的性能隔離免疫原性、防止植入細胞過度生長、較高的細胞包裹率、優(yōu)良的細胞存活性能等。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明方法獲得的免疫隔離化細胞的藥物組合物，不但可以具有至少一種上述期待的性能，而且具有令人期待的治療效果。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。發(fā)明概沭本發(fā)明第一方面提供一種藥物組合物，其包括微囊和任選的藥學可接受的載體， 所述微囊包括(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活細胞和可供所述活細胞存活的液體介質；和( 包裹所述囊芯的生物相容性隔離膜，其中所述隔離膜是半透膜。本發(fā)明第二方面提供一種微囊，其包括(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活細胞和可供所述活細胞存活的液體介質；和(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔離膜，其中所述隔離膜是半透膜。本發(fā)明第三方面提供制備本發(fā)明第一方面所述藥物組合物的方法本發(fā)明第四方面提供本發(fā)明第一方面所述藥物組合物或者第二方面所述微囊在制備用于治療和/或預防腫瘤和/或癌癥的醫(yī)藥中的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明第一方面提供一種藥物組合物，其包括微囊和任選的藥學可接受的載體， 所述微囊包括(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活細胞和可供所述活細胞存活的液體介質；和
(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔離膜，其中所述隔離膜是半透膜。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述隔離膜是容許分子量小于15 萬道爾頓的物質通過但不容許分子量大于15萬道爾頓的物質通過的半透膜。在一個實施方案中，所述隔離膜是容許分子量小于12萬道爾頓的物質通過但不容許分子量大于16萬道爾頓的物質通過的半透膜。在一個實施方案中，所述隔離膜是容許分子量小于10萬道爾頓的物質通過但不容許分子量大于16萬道爾頓的物質通過的半透膜。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述囊芯分布有網狀孔隙。在一個實施方案中，其中所述囊芯分布有稀網狀孔隙。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述囊芯分布有網狀孔隙，所述網狀孔隙的骨架是由包括海藻酸鈣的成分組成。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述微囊核芯分布有網狀孔隙， 孔隙中充填可供所述活細胞存活的液體介質。在一個實施方案中，所述微囊核芯分布有網狀孔隙，孔隙中充填可供所述活細胞存活的液體介質，并且所述活細胞存在于所述液體介質中。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述囊芯由海綿狀結構構成，該海綿狀結構的骨架是由包括海藻酸鈣的成分組成，所述活細胞和可供所述活細胞存活的液體介質存在于該海綿狀結構的孔隙中。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述隔離膜包含海藻酸鈣和聚賴氨酸。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述隔離膜是由包括海藻酸鈣和聚賴氨酸的成分組成。在一個實施方案中，所述隔離膜是由聚賴氨酸裹覆在所述微囊核芯周圍，然后再在由此形成的微囊外周裹覆海藻酸鈣而形成的。在一個實施方案中，所述隔離膜是一層以海藻酸鈣為基礎成分的膜，其中鑲嵌有聚賴氨酸。在一個實施方案中，所述隔離膜是由可溶性海藻酸鈉與可溶性鈣鹽(例如氯化鈣、乳酸鈣)反應后，形成的微粒用聚賴氨酸處理，再用可溶性海藻酸鹽(例如海藻酸鈉)處理而形成的。由于囊芯呈骨架網格狀，其中充滿液體介質，活細胞存活于該液體介質中；而在該囊芯外周裹覆所述隔離膜后，由于該隔離膜中鑲嵌有聚賴氨酸，即為容許小分子通過而不能容許大分子通過的半透膜，使得微囊外的小分子營養(yǎng)物質可以進入微囊中而為活細胞提供存活的養(yǎng)料，細胞分泌的活性因子和其它排泄物亦可通過半透膜排出；但是細胞以及分泌的具有免疫性的物質不能排出，由此可避免發(fā)生免疫反應。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述活細胞是具有增殖活性的細胞。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述活細胞是來自基因工程的細胞，或者是來自哺乳動物如人、猴、牛、羊、豬或鼠的分泌細胞，優(yōu)選基因工程細胞。在一個實施方案中，所述活細胞是來自人胚胎細胞系的細胞。在一個實施方案中，所述活細胞是人胚胎腎 293細胞。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述活細胞是能夠分泌腫瘤抑制因子(TIF)的細胞(在本文中可簡稱為TIF細胞)。在一個實施方案中，所述TIF細胞是指在載體細胞中轉染了分泌抑制和/或殺傷腫瘤因子基因的工程細胞，它可分泌抑制和/或殺傷腫瘤的因子(包括腫瘤壞死因子、腫瘤血管生長抑制因子等)物質。TIF細胞的獲得可用本領域已知的基因轉染方法進行。例如，可以使用腺病毒等將目的基因轉染入載體細胞， 使其可持續(xù)地分泌TIF。將TIF細胞在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)增殖。所述的載體細胞可以是來自哺乳動物如人、猴、牛、羊、豬或鼠的細胞，優(yōu)選基因工程細胞。在一個實施方案中，所述載體細胞是來自人胚胎細胞系的細胞。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述活細胞是能夠分泌活性因子的細胞，所述活性因子選自腫瘤壞死因子(TNF)、血管抑素(AST)、內皮抑素(EST)、白介素、P53等腫瘤抑制因子，以及它們的亞型。在一個實施方案中，所述活細胞是能夠分泌腫瘤壞死因子(TNF)的細胞。在一個實施方案中，所述活細胞是能夠分泌TNF α的細胞。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述活性因子選自腫瘤壞死因子(TNF)、血管抑素(AST)、內皮抑素(EST)、白介素、P53等腫瘤抑制因子，以及它們的亞型。 在一個實施方案中，所述活性因子是腫瘤壞死因子(TNF)。在一個實施方案中，所述活性因子是TNF α。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述活性因子是能夠抑制腫瘤細胞生長、抑制腫瘤組織生長、和/或殺滅腫瘤細胞的任何腫瘤抑制因子(TIF)。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述微囊具有200-450μπι的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-400 μ m的平均粒徑。在一個實施方案中， 所述微囊具有200-375 μ m的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有275-375 μ m的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-350μπι的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-325 μ m的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-300 μ m 的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有225-300 μ m的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有225-325 μ m的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有225-350 μ m 的平均粒徑。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述微囊具有200-450μπι的中值粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-400μπι的中值粒徑。在一個實施方案中， 所述微囊具有200-375 μ m的中值粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有275-375 μ m的中值粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-350μπι的中值粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-325 μ m的中值粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-300 μ m 的中值粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有225-300μπι的中值粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有225-325 μ m的中值粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有225-350 μ m 的中值粒徑。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述海藻酸鈉具有1萬-25萬道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有1.5-20萬道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有2萬-15萬道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有2萬-10萬道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有2萬-7. 5道爾頓的分子量。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述海藻酸鈣具有1萬-25萬道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈣具有1.5-20道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈣具有2萬-15萬道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈣具有2萬-10萬道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈣具有2萬-7. 5道爾頓的分子量。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中在20°C下以水溶液測定，所述海藻酸鈉具有I-IOOOmpa-s的粘度。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有2-750mpa-s 的粘度。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有5-500mpa · s的粘度。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有5-250mpa 的粘度。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有5-200mpa 的粘度。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有5-lOOmpa · s的粘度。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述海藻酸鈣和聚賴氨酸的摩爾比為(0.001-1000) 1。在一個實施方案中，所述海藻酸鈣和聚賴氨酸的摩爾比為(0.01-1000) 1。在一個實施方案中，所述海藻酸鈣和聚賴氨酸的摩爾比為 (0. 1-1000) 1。在一個實施方案中，所述海藻酸鈣和聚賴氨酸的摩爾比為(0. 1-500) 1。 在一個實施方案中，所述海藻酸鈣和聚賴氨酸的摩爾比為(0.2-100) 1。在一個實施方案中，所述海藻酸鈣和聚賴氨酸的摩爾比為(1-100) 1。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中每個微囊粒子中包含100-100000個細胞。在一個實施方案中，所述每個微囊粒子中包含200-10000個細胞。在一個實施方案中，所述每個微囊粒子中包含250-10000個細胞。在一個實施方案中，所述每個微囊粒子中包含250-7500個細胞。在一個實施方案中，所述每個微囊粒子中包含250-5000個細胞。 在一個實施方案中，所述每個微囊粒子中包含250-1000個細胞。在一個實施方案中，所述每個微囊粒子中包含250-500個細胞。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中各微囊粒子中包含的平均細胞數(shù)為100-100000個。在一個實施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均細胞數(shù)為200-10000 個。在一個實施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均細胞數(shù)為250-10000個。在一個實施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均細胞數(shù)為250-7500個。在一個實施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均細胞數(shù)為250-5000個。在一個實施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均細胞數(shù)為250-1000個。在一個實施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均細胞數(shù)為 250-500 個。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述液體介質選自細胞培養(yǎng)液 (例如DMEM培養(yǎng)液)、動物(例如人)體液、組織(例如腫瘤，例如實體腫瘤)液、生理鹽水、 緩沖液。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述藥學可接受的載體選自細胞培養(yǎng)液(例如DMEM培養(yǎng)液)、動物(例如人)體液、組織(例如腫瘤，例如實體腫瘤)液、 生理鹽水、緩沖液。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述液體介質和所述藥學可接受的載體相同或者不同。在一個實施方案中，所述液體介質和藥學可接受的載體是相同的。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其中所述囊芯中還包含具有分泌第二活性因子功能的第二活細胞。應當理解，在存在第二活性因子和/或第二活細胞的情況下， 所述原有的活性因子和活細胞分別為第一活性因子和第一活細胞，以示區(qū)別上述另外添加的第二活性因子和第二活細胞。在一個實施方案中，所述第二活性因子與所述第一活性因子相同或不同。在一個實施方案中，所述第二活細胞與所述第一活細胞相同或不同。在一個實施方案中，所述第二活細胞與所述第一活細胞相同，所述第二活性因子與所述第一活性因子不同。根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物，其可用于治療和/或預防腫瘤和/或癌癥。在一個實施方案中，所述藥物組合物可用于抑制腫瘤細胞生長、抑制腫瘤組織生長、 和/或殺滅腫瘤細胞。在一個實施方案中，所述的腫瘤是實體瘤或非實體瘤、良性或惡性腫瘤。在一個實施方案中，所述的腫瘤和/或癌癥選自肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、腸癌、卵巢癌、腦膠質細胞瘤。基于本發(fā)明第一方面，本發(fā)明第二方面提供一種微囊，其包括(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活細胞和可供所述活細胞存活的液體介質；和(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔離膜，其中所述隔離膜是半透膜。本發(fā)明第二方面所述微囊與本發(fā)明第一方面所述藥物組合物中包含的微囊具有相同或相應的特征。
本發(fā)明第三方面提供了制備本發(fā)明第一方面任一項所述藥物組合物的方法，其包括以下步驟(1)使具有分泌活性因子功能的活細胞與海藻酸鈉溶液混合，制成細胞懸浮液；(2)利用噴霧裝置將步驟(1)所得懸浮液以微滴狀態(tài)分散于鈣溶液(例如氯化鈣或乳酸鈣溶液)中，待沉淀完全后除去上清液，獲得包含活細胞的海藻酸鈣微珠沉淀；(3)將步驟( 所得沉淀物加入到聚賴氨酸溶液中，混合均勻，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(4)將步驟( 所得沉淀物加入到海藻酸鈉溶液中，混合均勻，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(5)將步驟(4)所得沉淀物加入到檸檬酸鈉溶液中，混合均勻，待沉淀完全后除去上清液，獲得包裹所述活細胞的微囊沉淀物；和任選的(6)用氯化鈉溶液清洗步驟( 所得沉淀物，再轉移到細胞培養(yǎng)液中，即得。根據本發(fā)明第三方面任一項所述方法，其中所述微囊具有200-450 μ m的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-400 μ m的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-375 μ m的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-350 μ m的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-325 μ m的平均粒徑。在一個實施方案中，所述微囊具有200-300 μ m的平均粒徑。根據本發(fā)明第三方面任一項所述方法，其中所用的海藻酸鈉具有1萬-25萬道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有1.5萬-20萬道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有2萬-15萬道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有2萬-10萬道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述海藻酸鈉具有2萬-7. 5 萬道爾頓的分子量。根據本發(fā)明第三方面的方法，其類似地可以獲得本發(fā)明第二方面的微囊。例如通過步驟(1)至( 就可以獲得。由此，上述步驟(1)至( 亦是制備本發(fā)明第二方面的微囊的方法。本發(fā)明第四方面提供了本發(fā)明第一方面任一項所述藥物組合物或者第二方面任一項所述微囊在制備用于治療和/或預防腫瘤和/或癌癥的醫(yī)藥中的用途。在一個實施方案中，所述醫(yī)藥可用于抑制腫瘤細胞生長、抑制腫瘤組織生長、和/或殺滅腫瘤細胞。在一個實施方案中，所述的腫瘤是實體瘤或非實體瘤、良性或惡性腫瘤。在一個實施方案中，所述的腫瘤和/或癌癥選自肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、腸癌、卵巢癌、腦膠質細胞瘤。本發(fā)明第五方面提供了在有需要的受試者中治療和/或預防腫瘤和/或癌癥的方法，該方法包括給所述受試者施用有效量的本發(fā)明第一方面任一項所述藥物組合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物是以有效抑制腫瘤細胞生長、抑制腫瘤組織生長、和/或殺滅腫瘤細胞的量施用的。在一個實施方案中，所述的腫瘤是實體瘤或非實體瘤、良性或惡性腫瘤。在一個實施方案中，所述的腫瘤和/或癌癥選自肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、腸癌、卵巢癌、腦膠質細胞瘤。在一個實施方案中，所述藥物組合物施用于所述腫瘤和/或癌癥部位。本發(fā)明第六方面提供了用于治療和/或預防腫瘤和/或癌癥的本發(fā)明第一方面任一項所述藥物組合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物可用于抑制腫瘤細胞生長、抑制腫瘤組織生長、和/或殺滅腫瘤細胞。在一個實施方案中，所述的腫瘤是實體瘤。在一個實施方案中，所述的腫瘤和/或癌癥選自肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、腸癌、卵巢癌、腦膠質細胞瘤。在本發(fā)明的任一方面，其中任意兩個或更多個實施方案之間所具有的特征可以相互組合，只要它們不會相互矛盾；當然在相互之間組合時，必要的話可對相應特征作適當修飾。例如在提及“根據本發(fā)明第一方面任一項的藥物組合物”時，其后限定的特征可以適用于本發(fā)明第一方面任一實施方案的情形，只要它們不會相互矛盾。另外，對于在本發(fā)明任一方面使用的術語和特征，其含義同樣適用于其它方面。下面對本發(fā)明的各個方面和特點作進一步的描述。本發(fā)明所引述的所有文獻，它們的全部內容通過引用并入本文，并且如果這些文獻所表達的含義與本發(fā)明不一致時，以本發(fā)明的表述為準。此外，本發(fā)明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準。 如本文所述的，術語“藥物組合物”，其還可以是指組合物，可用于在受試者中實現(xiàn)治療、預防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥或不良健康狀況。如本文所述的，術語“受試者”，亦可指“患者”，其通常是指哺乳動物，例如人、狗、
猴、牛、馬等。如本文所述的，術語“有效量”是指可在受試者中有效實現(xiàn)治療、預防、緩解、減輕、 消除相關疾病及其并發(fā)癥的劑量。如本文所述的，術語“免疫隔離化細胞”是指本發(fā)明的活細胞，由于其與機體的細胞、組織或器官之間被本發(fā)明所述半透膜所隔離，從而其不會與機體發(fā)生免疫反應。如本文所述的，術語“生物相容性”是指不會與機體的細胞、組織或器官發(fā)生不利的生物學反應。如本文所述的，術語“具有分泌活性因子功能的活細胞”是指本發(fā)明的活細胞，其具有分泌本發(fā)明所述活性因子例如腫瘤壞死因子(TNF)、血管抑素(AST)、內皮抑素(EST) 等的能力。本發(fā)明所述活細胞可通過本領域已知的任何方法獲得分泌活性因子的能力，例如基因工程方法。如本文所述的，術語“截割”亦可指“截留”，表示可以將較大的物質例如分子量大于16萬道爾頓的物質例如本發(fā)明所述活細胞“截留”在本發(fā)明所述半透膜的一側而不能自由通過半透膜。如本文所述的，術語“微囊”，是指一種基本上呈球形的微小顆粒，其表面由聚賴氨酸-海藻酸鈣形成半透膜，而其內部是主要由海藻酸鈣構成的海綿狀骨架，骨架內分布的網格狀孔隙間含有本發(fā)明所述液體介質以及活細胞。因此，本領域技術人員理解，術語“微囊”的結構是由本發(fā)明詳細記載所描述的，并且本領域技術人員理解，這種微小顆粒亦可稱為“微?！?、“微球”、“顆?！钡取Ｈ绫疚乃龅?，短語“微囊細胞包裹量”、“微囊平均細胞包裹量”或者“每個微囊中包含的細胞數(shù)平均為”是指一定數(shù)目微囊中每個微囊所包裹的細胞數(shù)量的平均值。例如， 其可以以如下方式測得取一定數(shù)目(例如100個、200個、500個或1000個)的微囊，經測定這些微囊中的總細胞數(shù)，由該總細胞數(shù)除以微囊數(shù)目，即得到的群體中的“個細胞/個微囊”的數(shù)值。如本文所述的，短語“微囊粒徑”、“微囊平均粒徑”或類似用語是指一定數(shù)目(例如100個、200個、500個或1000個)微囊中各個微囊直徑的平均值。本發(fā)明提供了一類新的用于殺傷和/或抑制腫瘤的免疫隔離化細胞藥物，其包括 (1)可分泌抑制腫瘤生長因子和/或腫瘤殺傷因子的活細胞和( 包裹所述活細胞的免疫隔離膜。本發(fā)明特別地提供的是一種APA微囊化抑瘤和/或殺瘤細胞。縮寫“ΑΡΑ”表示 “海藻酸鈣-聚賴氨酸-海藻酸鈣”。術語“ΑΡΑ微囊化”表示用海藻酸鈣-聚賴氨酸-海藻酸鈣獲得的微囊。如

圖1所示，描述了本發(fā)明APA微囊的示意性結構。其中圖Ia是本發(fā)明上文第二方面所述方法的步驟(1)和( 所形成的海藻酸鈣微珠，即在活細胞與海藻酸鈉溶液混合成細胞懸浮液后，向其中以微滴方式加入鈣離子(例如氯化鈣或乳酸鈣溶液)，海藻酸鈉形成不溶性的海藻酸鈣，由此形成海綿狀海藻酸鈣微珠沉淀(即本發(fā)明所述微囊的囊芯)。圖中示意的海綿狀網狀結構的骨架是由包括海藻酸鈣(Alg-Ca)的成分構成，該海綿狀的孔隙中容納有活細胞(C)和介質(M)。接著，圖Ib示意了本發(fā)明上文第二方面所述方法的步驟(3)所形成的沉淀物，即將步驟( 所得沉淀物加入到聚賴氨酸溶液中，借助海藻酸鈣與聚賴氨酸相互之間所荷相反電荷的作用使聚賴氨酸附著于顆粒的表面，即在所述囊芯外圍附著大量的聚賴氨酸(PL)。接著，圖Ic示意了本發(fā)明上文第二方面所述方法的步驟(4)所形成的沉淀物，即使圖Ib的顆粒再次與海藻酸鈉溶液接觸，借助體系中存在的鈣離子(例如氯化鈣或乳酸鈣溶液，特別是囊芯中殘余的鈣離子)而使海藻酸鈉在顆粒表面固化，由此，顆粒表面的聚賴氨酸(PL)和海藻酸鈣層形成本發(fā)明所述隔離膜。由于該隔離膜中鑲嵌了聚賴氨酸，使得該隔離膜具有半滲透性，即為半透膜(semip-m)，小分子物質或供細胞存活的介質(M)可以通過而大分子物質或細胞(C)不能通過。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了殺傷和/或抑制腫瘤的方法，其包括將免疫隔離化抑瘤和/或殺瘤因子分泌細胞直接植入腫瘤組織內或手術切除后殘余的腫瘤組織內。在一個實施方案中，其中的細胞是包裹在本發(fā)明的微囊中。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了制備本發(fā)明藥物組合物或微囊的方法，所述藥物組合物或微囊可用作殺傷和/或抑制腫瘤，并且作為外源性的該活細胞與機體發(fā)生免疫反應的能力被隔離，該方法的步驟包括(1)將活細胞(在本文中亦可稱為抑瘤細胞和/或殺瘤細胞)與一種濃度為 10-20g/L的海藻酸鈉溶液混合，制成懸浮液，使每升懸浮液中含0. 001-1 X 101°個細胞；(2)利用噴霧裝置將步驟⑴獲得的懸浮液以100-1000 μ m直徑的微滴狀態(tài)分散于一種濃度為80-120mmol/L的氯化鈣或乳酸鈣溶液中，放置5_20分鐘，待沉淀完全后，除去上清液，獲得含抑瘤和/或殺瘤細胞的海藻酸鈣微珠沉淀；(3)將步驟( 獲得的沉淀物加入到一種濃度為0. 1-1. Og/L的聚賴氨酸溶液中， 混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(4)將步驟( 獲得的沉淀物加入到一種濃度為1. 0-2. Og/L的海藻酸鈉溶液中， 混合均勻，放置3-15分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(5)將步驟(4)獲得的沉淀物加入到一種濃度為lO-lOOmmol/L的檸檬酸鈉溶液中，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得APA微囊化抑和/或殺瘤細胞沉淀物；(6)將步驟( 獲得的沉淀物加入到一種濃度為9g/L的氯化鈉溶液清洗，最后將沉淀物轉移入細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)并作為治療腫瘤的APA微囊化抑瘤和/或殺瘤細胞 (APA-TIF細胞微囊)藥物保存。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供可分泌抑制腫瘤生長因子和/或腫瘤殺傷因子的活細胞和免疫隔離膜的包裹在制備用于殺傷和/或抑制腫瘤的免疫隔離化細胞藥物中用途。根據本發(fā)明，本發(fā)明所述抑制腫瘤生長因子和/或腫瘤殺傷因子分泌細胞至少使
用一種。根據本發(fā)明，本發(fā)明所述腫瘤包括實體瘤或非實體瘤、良性或惡性腫瘤。根據本發(fā)明，本發(fā)明中抑瘤細胞或殺瘤細胞可來自基因工程細胞或哺乳動物如人、猴、牛、羊、豬或鼠的分泌細胞，優(yōu)選基因工程細胞。根據本發(fā)明，本發(fā)明中抑瘤細胞或殺瘤細胞為可分泌抑瘤和/或殺瘤因子的基因工程細胞。根據本發(fā)明，本發(fā)明的抑瘤細胞和/或殺瘤細胞是以免疫隔離化形式使用的，優(yōu)選APA微囊化的抑瘤細胞和/或殺瘤細胞。根據本發(fā)明，本發(fā)明的APA微囊(免疫隔離膜)可截割大于15萬道爾頓分子、允許小于10萬道爾頓分子通過，并符合體內植入要求的強度和生物相容度等性質。根據本發(fā)明的APA-TIF細胞微囊藥物，在其步驟O)中優(yōu)選是將步驟(1)獲得的懸浮液以100-500 μ m直徑的微滴狀態(tài)分散。在本發(fā)明任一方面所述微囊的一個實施方案中，該微囊具有的平均粒徑為 200-450 μ m,優(yōu)選250-400 μ m,優(yōu)選275-375 μ m。在本發(fā)明任一方面所述微囊的一個實施方案中，該微囊具有的中值粒徑為200-450 μ m,優(yōu)選250-400 μ m,優(yōu)選275-375 μ m。在本發(fā)明任一方面所述微囊的一個實施方案中，每個微囊粒子中包含250-5000 個細胞，優(yōu)選250-1000個細胞，優(yōu)選250-500個細胞。在本發(fā)明任一方面所述微囊的一個實施方案中，每個微囊粒子中包含的細胞數(shù)平均為250-5000個，優(yōu)選250-1000個，優(yōu)選 250-500個。在本發(fā)明任一方面所述微囊的一個實施方案中，平均細胞含量為250-5000個細胞/微囊，優(yōu)選250-1000個細胞/微囊，優(yōu)選250-500個細胞/微囊。在本發(fā)明任一方面所述微囊的一個實施方案中，該微囊具有的平均粒徑為 200-450 μ m(優(yōu)選250-400 μ m,優(yōu)選275-375 μ m)，并且每個微囊中包含的細胞數(shù)平均為 250-5000個(優(yōu)選250-1000個，優(yōu)選250-500個)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)具有特定尺寸和細胞包裹量的微囊具有令人期待的優(yōu)點。在使用時，只要將本發(fā)明APA-TIF細胞微囊注入患者的腫瘤組織內或腫瘤切除后的腔內，即可在M小時內開始產生抑制或殺傷腫瘤細胞的作用，而且一次注射可以維持治療作用6個月以上。進一步講，在本發(fā)明中所述的TIF細胞是指在載體細胞中轉染了分泌抑制和/或殺傷腫瘤因子基因的工程細胞，它可分泌抑制和/或殺傷腫瘤的因子(包括腫瘤壞死因子、 腫瘤血管生長抑制因子等)物質。
TIF細胞的獲得可用本領域已知的基因轉染方法進行。例如，可以使用腺病毒等將目的基因轉染入載體細胞，使其可持續(xù)地分泌TIF。將TIF細胞在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)增殖。載體細胞可為各種具有增殖活性的細胞，優(yōu)選人胚胎細胞系。在本發(fā)明的APA-TIF細胞微囊藥物的制備中，步驟(1)所獲得的懸浮液中每升含有0. 01-1 X 101°個細胞，也可以根據載體細胞的生長特性來掌握。例如，高增殖活性的載體細胞可降低細胞密度，而低增殖活性的載體細胞可升高細胞密度。余此類推。在步驟O)中形成海藻酸鈣微珠呈密網格狀，其中含有許多TIF細胞。步驟(3) 的作用是為了在海藻酸鈣微珠表面形成能截割大分子的半透膜。步驟(4)的作用是為了步驟C3)產物表面形成生物相容的膜，獲得含TIF細胞的APA微球。在步驟(5)中，檸檬酸鈉的鈉離子將海藻酸鈣微珠中的鈣離子置換之后，便使APA微球中芯液化，形成了中芯為稀網格狀孔隙的APA微囊，其中含有許多TIF細胞。對海藻酸鈣微珠的形成方法沒有特殊限定，只要是能將含有TIF細胞的海藻酸鈉懸浮液以足夠微小的液滴分散于鈣溶液中即可。該海藻酸鈉懸浮液微滴的直徑通常應在 100-1000 μ m的范圍內，優(yōu)選在180-500 μ m的范圍內，在本發(fā)明中更優(yōu)選在200-400 μ m范圍內。如果微滴直徑在1000 μ m以上，則最后獲得的微囊過大，在注射入人或動物的機體時容易引起破裂，因此不好。通常使用的液滴分散方法有針頭注射法、噴霧法等，優(yōu)選是靜電微囊發(fā)生器之噴霧法。上面對本發(fā)明的技術方案進行了較詳細的解釋，本領域的技術人員在閱讀了上文及下文所附的實施例之后將能很容易地理解本發(fā)明。與本領域的現(xiàn)有同類技術相比，本發(fā)明具有如下的積極效果通過動物實驗證實，使用本發(fā)明的APA-TIF細胞微囊可以持續(xù)地分泌抑制和/或殺傷腫瘤的因子(TIF)，作用于患者的腫瘤組織細胞。植入的TIF細胞發(fā)揮“微型生物泵” 的持續(xù)、小量分泌效應，在一段較長的時間內，通過其分泌的TIF，達到抑制和/或殺傷腫瘤組織細胞的作用，從而達到治療腫瘤的目的。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有至少一項以下特點1、靜脈等方法全身使用TIF，腫瘤組織內藥物濃度低，治療效果差；同時，藥物對全身的毒副作用大。而本發(fā)明將TIF細胞植入腫瘤組織內，其分泌的腫瘤抑制和/或殺傷因子主要濃集并作用于腫瘤組織局部，治療效果好、對全身的毒副作用?。?、直接使用TIF蛋白因子，由于其半衰期短，必須反復多次地長時間地注射于腫瘤組織內，才能達到治療腫瘤的目的。本發(fā)明采用分泌腫瘤抑制和/或殺傷因子的基因工程細胞系(TIF細胞)植入腫瘤組織，通過其持續(xù)分泌TIF的微型生物泵作用，發(fā)揮抑制腫瘤組織生長的效應。它可解決臨床難以實施向腫瘤組織內反復注射TIF蛋白因子的問題；3、本發(fā)明采用同時植入一種或多種分泌腫瘤抑制和/或殺傷因子的基因工程細胞的方法，所分泌的一種或多種TIF，可通過殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤血管組織生長等一種或多種機制的協(xié)同效應，更好地發(fā)揮治療腫瘤的作用；4、本發(fā)明以APA微囊包裹TIF細胞，一方面可防止免疫反應發(fā)生，另一方面可限制高增殖活性載體細胞的過度生長。大量實驗已證實，本發(fā)明的APA微囊具有很好的免疫保護作用；
5、按本發(fā)明制作的APA微囊體積小(直徑100_500um，優(yōu)選的平均直徑為 200-400um)，因而至少具有4個優(yōu)點之一⑴利于營養(yǎng)物和代謝物的擴散，使囊內細胞易于較長期的存活；( 微囊的機械強度高；C3)僅需以簡單的注射方法即可將微囊注入腫瘤組織內，不需特殊的手術操作植入；(4)微囊對腫瘤周圍組織的損傷壓迫作用小；6、按本發(fā)明制作的APA微囊強度高、囊球形度高、表面光潔度高，因而其組織相容性好，更適合于體內植入的要求，不易在宿主體內破裂，不易被宿主的炎性細胞包裹而堵塞微囊膜孔；7、與其它材料的免疫隔離膜相比，APA微囊具有良好的生物相容性；8,APA-TIF細胞微囊在宿主腫瘤組織內可持續(xù)地(例如6個月以上)分泌腫瘤抑制和/或殺傷因子，產生持續(xù)的抑制和/或殺傷腫瘤組織細胞的治療作用。為解決腫瘤復發(fā)等難題提供新的方法；9、與采用人體自然殺傷細胞或因子相比，TIF基因工程細胞可大批量獲得；10、可采用低溫技術(例如低于8°C，例如0_8°C，例如0-4°C，或者例如液氮冷凍保存，例如約-80°C )保存APA-TIF細胞微囊，便于長距離運輸和批量供應。
具體實施例方式通過下面的實施例可以對本發(fā)明進行進一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例。本領域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細的描述。A、實施例部分具有分泌活性因子功能的活細胞實施例1 :rEST/293基因工程細胞系的建立1、將人血管內皮抑素(rEST)表達載體轉染入人胚胎腎293細胞，以獲得穩(wěn)定分泌人血管內皮抑素的工程細胞(rEST/^93)2、用臺盤蘭染色法檢測rEST/293細胞的存活率；3、用RT-PCR擴增法從mRNA水平檢測轉染細胞內皮抑素的表達；4、從蛋白水平檢測轉染細胞內皮抑素的表達用SDS-PAGD檢測rEST的特異性； 用Wfestern Blot法證實rEST/293細胞表達分泌型蛋白中含有組rEST，并具有抗原活性；5、用ELISA法檢測細胞分泌的rEST量。6、轉染細胞表達產物內皮抑素的體外生物學活性鑒定通過血管內皮細胞抑制實驗、雞胚絨毛膜尿囊膜實驗，證實rEST/293細胞可抑制血管內皮細胞再生。實施例2 =TNF α/293基因工程細胞系的建立1、將腫瘤壞死因子α (TNFa)表達載體轉染入人胚胎腎293細胞，以獲得穩(wěn)定分泌人血管內皮抑素的工程細胞(TNFa Λ93)；2、用臺盤蘭染色法檢測TNFa /293細胞的存活率；3、用RT-PCR擴增法從mRNA水平檢測轉染細胞TNF α的表達；4、用Wfestern Blot法從蛋白水平檢測轉染細胞TNFa的表達；
5、用ELISA法檢測細胞分泌的TNF α量。6、用MTT比色法測定TNF α對腫瘤細胞的殺傷活性。應予說明，實施例1、2的方法屬于常規(guī)技術，它對本發(fā)明不起任何限定作用。B、狐仿丨賺巢伺含麵白·■白·_勁勿制備例1 :TIF細胞-APA微囊藥物的制備1、使用按實施例1、2的方法獲得的TIF細胞(rESlV293細胞TNFa /293細胞的混合物，兩種細胞數(shù)的比約1 1)沉淀物(細胞數(shù)約為IO5-IO7個)，用生理鹽水洗滌。2、向其中加入Iml濃度為15g/L的海藻酸鈉(IOmpa · s粘度級)溶液，其制成懸浮液。3、用靜電微囊發(fā)生器(electrostatic droplet generator)將懸浮液以平均約325 μ m直徑的微滴噴入到IOOml濃度為lOOmmol/L的氯化鈣溶液中，獲得一種直徑在 100-500 μ m范圍內的含細胞的海藻酸鈣珠沉淀，待沉淀完全后除去上清液。4、將上面得到的海藻酸鈣珠加入到50ml濃度為0. 5g/L的聚賴氨酸溶液中，混合均勻，在室溫下放置5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。5、將步驟4獲得的沉淀物加入到60ml濃度為1. 5g/L的海藻酸鈉溶液中，混合均勻，在室溫下放置5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。6、將步驟5獲得的沉淀物加入到60ml濃度為55mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，在室溫下放置5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得APA-TIF細胞微囊沉淀物。7、用濃度為9g/L的氯化鈉溶液洗滌沉淀物，然后將此沉淀物轉移入DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，作為注射用APA-TIF細胞微囊藥物，待用，即為本發(fā)明的藥物組合物。制備例2 包含TNFa /293細胞的微囊藥物組合物的制備參考制備例1的方法進行制備，部分細節(jié)具體如下1、取實施例2獲得的TNF/293基因工程細胞系沉淀物(細胞數(shù)約為IO5-IO7個)， 用生理鹽水洗滌，向其中加入Iml濃度為10g/L的海藻酸鈉(50mpa 粘度級)溶液，其制成懸浮液。2、用靜電微囊發(fā)生器將懸浮液以平均約300 μ m直徑的微滴噴入到100ml濃度為 80mmol/L的氯化鈣溶液中，獲得直徑在100-500 μ m范圍內的含細胞的海藻酸鈣珠沉淀，待沉淀完全后除去上清液。3、將上面得到的海藻酸鈣珠加入到50ml濃度為0. lg/L的聚賴氨酸溶液中，混合均勻，在室溫下放置5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。4、將上步沉淀物加入到60ml濃度為1. 0g/L的海藻酸鈉溶液中，混合均勻，在室溫下放置5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。5、將上步沉淀物加入到60ml濃度為15mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，在室溫下放置 5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得APA-TIF細胞微囊沉淀物。6、用濃度為9g/L的氯化鈉溶液洗滌沉淀物，然后將此沉淀物轉移入DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，作為注射用APA-TIF細胞微囊藥物，待用，即為本發(fā)明的藥物組合物。制備例3 包含TNFa /293細胞的微囊藥物組合物的制備參考制備例1的方法進行制備，部分細節(jié)具體如下1、取實施例2獲得的TNFA93基因工程細胞系沉淀物(細胞數(shù)約為IO5-IO7個)，用生理鹽水洗滌，向其中加入Iml濃度為20g/L的海藻酸鈉(IOOmpa · s粘度級)溶液，其制成懸浮液。2、用靜電微囊發(fā)生器將懸浮液以平均約370 μ m直徑的微滴噴入到IOOml濃度為 120mmol/L的氯化鈣溶液中，獲得直徑在100-500 μ m范圍內的含細胞的海藻酸鈣珠沉淀， 待沉淀完全后除去上清液。3、將上面得到的海藻酸鈣珠加入到50ml濃度為1. Og/L的聚賴氨酸溶液中，混合均勻，在室溫下放置5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。4、將上步沉淀物加入到60ml濃度為2. Og/L的海藻酸鈉溶液中，混合均勻，在室溫下放置5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。5、將上步沉淀物加入到60ml濃度為lOOmmol/L的檸檬酸鈉溶液中，在室溫下放置 5-10分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得APA-TIF細胞微囊沉淀物。6、用濃度為9g/L的氯化鈉溶液洗滌沉淀物，然后將此沉淀物轉移DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，作為注射用APA-TIF細胞微囊藥物，待用，即為本發(fā)明的藥物組合物。ffeH^M 4 句,含rEST/293細胞,的微囊藥物_合物的制各參考制備例2的方法，以平均約270 μ m直徑的微滴用靜電微囊發(fā)生器將懸浮液噴入到鈣溶液中，使用實施例1獲得的rEST/293細胞和200mpa ·s粘度級的海藻酸鈉進行制備。獲得包含rEST/293細胞的微囊藥物組合物。制備例5 包含TNFa /293細胞的微囊藥物組合物的制備參考制備例3的方法，以平均約350 μ m直徑的微滴用靜電微囊發(fā)生器將懸浮液噴入到鈣溶液中，使用實施例1獲得的rEST/293細胞和300mpa ·s粘度級的海藻酸鈉進行制備。獲得包含rEST/293細胞的微囊藥物組合物。制備例6-10 本發(fā)明微囊藥物組合物的制備基本上分別參照制備例1-5的方法，但在用靜電微囊發(fā)生器將懸浮液以一定直徑的微滴噴入到氯化鈣溶液中時，控制的微滴直徑分別大約在275 μ m、300 μ m、325 μ m、 350μπι、375μπι。分別制備得到的制備例6_10的5批本發(fā)明微囊藥物組合物。經下文所示方法測定，本制備例得到的制備例6-10的5批本發(fā)明微囊藥物組合物的微囊平均粒徑分別為279 μ m、305 μ m、328 μ m、355 μ m、373 μ m,微囊平均粒徑均在275-375 μ m的范圍內。制備例6-10的微囊平均細胞包裹量分別為260個細胞/個微囊、410個細胞/個微囊、490個細胞/個微囊、370個細胞/個微囊、310個細胞/個微囊，均在250-500個細胞/個微囊的范圍內。比較例1-10 包含細胞的微囊藥物組合物的制備分別參照制備例1-10的方法，分另Ij以平均約50 μ m、100 μ m、150 μ m、200 μ m、 250 μ m、400 μ m、450 μ m、500 μ m、750 μ m、和1000 μ m直徑的微滴，用靜電微囊發(fā)生器將懸
浮液噴入到鈣溶液中，分別得到比較例1-10的微囊藥物組合物。經下文所示方法測定，比較例1-10分別得到的微囊藥物組合物，它們的微囊平均粒徑分另Ij 為 39μπι、105μπι、148μπι、215μπι、253μπι、390μπι、455μπι、508μπι、755μπι、 983 μ m ；它們的微囊平均細胞包裹量分別為30個細胞/個微囊、70個細胞/個微囊、135 個細胞/個微囊、183個細胞/個微囊、220個細胞/個微囊、535個細胞/個微囊、760個細胞/個微囊、1260個細胞/個微囊、2030個細胞/個微囊、2960個細胞/個微囊。
比較例11-12 包含細胞的微囊藥物組合物的制備參照制備例1的方法，所用細胞沉淀物的細胞數(shù)約為103-106個，以平均約320 μ m 直徑的微滴，用靜電微囊發(fā)生器將懸浮液噴入到鈣溶液中，得到比較例11的微囊藥物組合物。經測定，所得微囊平均粒徑為335 μ m，微囊平均細胞包裹量為180個細胞/個微囊。參照制備例1的方法，所用細胞沉淀物的細胞數(shù)約為IO7-IO11個，以平均約320 μ m 直徑的微滴，用靜電微囊發(fā)生器將懸浮液噴入到鈣溶液中，得到比較例11的微囊藥物組合物。經測定，所得微囊平均粒徑為325 μ m，微囊細胞包裹量為980個細胞/個微囊。比較例13-14 包含細胞的微囊藥物組合物的制備參照制備例1的方法，所用細胞沉淀物的細胞數(shù)約為IO5-IO9個，以平均約200 μ m 直徑的微滴，用靜電微囊發(fā)生器將懸浮液噴入到鈣溶液中，得到比較例13的微囊藥物組合物。經測定，所得微囊平均粒徑為205 μ m，微囊細胞包裹量為380個細胞/個微囊。參照制備例1的方法，所用細胞沉淀物的細胞數(shù)約為IO3-IO5個，以平均約500 μ m 直徑的微滴，用靜電微囊發(fā)生器將懸浮液噴入到鈣溶液中，得到比較例14的微囊藥物組合物。經測定，所得微囊平均粒徑為515 μ m，微囊細胞包裹量為410個細胞/個微囊。C、試驗例部分對本發(fā)明包含細胞的微囊的藥物組合物的件能者察試驗例1 :APA-TIF細胞微囊對C6腦膠質瘤大鼠的治療作用試驗材料與方法1、在裸鼠上建立C6腦膠質瘤鼠模型；2、將制備例1獲得的APA-rEST-TNF α /293細胞微囊(約IO5-IO7個細胞的量)植入C6腦膠質瘤模型鼠的瘤體內；3、21天后將小鼠處死，行組織病理學檢查。與對照組C6腦膠質瘤模型鼠比較， APA-rEST-TNF α /293細胞微囊植入組C6腦膠質瘤體內新生血管數(shù)量明顯減少、死亡細胞數(shù)量明顯增多。具體結果見表1。表1:
權利要求
1.一種藥物組合物，其包括微囊和任選的藥學可接受的載體，所述微囊包括(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活細胞和可供所述活細胞存活的液體介質；和(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔離膜， 其中所述隔離膜是半透膜。
2.根據權利要求1的藥物組合物，其中所述隔離膜是容許分子量小于15萬道爾頓的物質通過但不容許分子量大于15萬道爾頓的物質通過的半透膜。
3.根據權利要求1-2任一項的藥物組合物，其中所述囊芯分布有網狀孔隙，所述網狀孔隙的骨架是由包括海藻酸鈣的成分組成。
4.根據權利要求1-3任一項的藥物組合物，其中所述囊芯由海綿狀結構構成，該海綿狀結構的骨架是由包括海藻酸鈣的成分組成，所述活細胞和可供所述活細胞存活的液體介質存在于該海綿狀結構的孔隙中。
5.根據權利要求1-4任一項的藥物組合物，其中所述隔離膜包含海藻酸鈣和聚賴氨酸。
6.根據權利要求1-5任一項的藥物組合物，其中所述活細胞是具有增殖活性的細胞。
7.根據權利要求1-6任一項的藥物組合物，其中所述微囊具有200-450μ m的平均粒徑。
8.根據權利要求1-7任一項的藥物組合物，其中每個微囊粒子中包含100-100000個細胞，優(yōu)選包含 200-10000 個、250-10000 個、250-7500 個、250-5000 個、250-1000 個、或 250-500個細胞。
9.一種微囊，其包括(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活細胞和可供所述活細胞存活的液體介質；和(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔離膜， 其中所述隔離膜是半透膜。
10.權利要求1-8任一項所述藥物組合物或者權利要求9所述微囊在制備用于治療和 /或預防腫瘤和/或癌癥的醫(yī)藥中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含細胞的藥物組合物及其應用。本發(fā)明所述藥物組合物，包括微囊和任選的藥學可接受的載體，所述微囊包括(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活細胞和可供所述活細胞存活的液體介質；和(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔離膜，其中所述隔離膜是半透膜。本發(fā)明還提供了一種微囊，制備所述藥物組合物的方法，以及所述藥物組合物或微囊在制備用于治療和/或預防腫瘤和/或癌癥的醫(yī)藥中的用途。本發(fā)明的藥物組合物或微囊具有如本發(fā)明所述特征。
文檔編號A61P35/00GK102429890SQ20111036498
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權日2011年1月21日
發(fā)明者薛毅瓏 申請人:薛毅瓏