專利名稱：一種干細(xì)胞復(fù)合藥物、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞復(fù)合藥物、其制備方法及其在制備治療各種肝病上的途，特別是采用存在于人類或哺乳類動(dòng)物的胚胎、血液或幼體肝臟中，用生化方法提取出來的一種干細(xì)胞誘導(dǎo)因子，復(fù)合從人或其他哺乳動(dòng)物的胚胎、臍帶血、脊髓、等組織中制備的干細(xì)胞的復(fù)合藥物，其制備方法及其在用于制備促進(jìn)干細(xì)胞向成熟肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)化及治療肝臟疾病藥物上的應(yīng)用。
干細(xì)胞是一種具有自我更新能力的多潛能原始細(xì)胞，在一定條件下可定向誘導(dǎo)成為各種類型的成體細(xì)胞，被用于各種用傳統(tǒng)方法難于治愈的細(xì)胞損傷型疾病。干細(xì)胞的治療正在成為一類全新的有效的治療方法。
干細(xì)胞作為一種新的治療方式，已成為臨床研究的熱點(diǎn)。干細(xì)胞的治療是相對(duì)安全的。但如何使干細(xì)胞定向誘導(dǎo)，使其分化成為所需的成體細(xì)胞并具有成體細(xì)胞的功能是尤為重要的。
干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。干細(xì)胞的發(fā)育受多種內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素的影響。目前人類胚胎干細(xì)胞已可成功地在體外培養(yǎng)。最新研究發(fā)現(xiàn)，成體干細(xì)胞可以橫向分化為其他類型的細(xì)胞和組織，為干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。研究干細(xì)胞增殖和分化機(jī)制的最終目的是通過干細(xì)胞治療疾病。理論上講，干細(xì)胞可以用于各種疾病的治療，但其最適合的疾病主要是組織壞死性疾病、退行性病變、自體免疫性疾病等。干細(xì)胞作為一種新的治療方式，已成為臨床研究的熱點(diǎn)。
肝臟是人體代謝的樞紐，根據(jù)有關(guān)醫(yī)學(xué)專家研究，在當(dāng)前及未來相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)，肝臟疾病將是威脅人類健康的最重要因素之一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國乙肝病毒攜帶者占10％，丙肝感染率平均為3.2％，全球每年死于肝炎后慢性肝病的病人中，就有42.5％在中國?？梢妼ふ矣行е委煾闻K疾病的藥物，是非常重要的。
本發(fā)明的目的在于公開一種干細(xì)胞復(fù)合藥物，特別是存在于人類或哺乳類動(dòng)物的胚胎、血液或幼體肝臟中，用生化方法提取出來的一種干細(xì)胞復(fù)合藥物，該復(fù)合藥物可提高干細(xì)胞及干細(xì)胞誘導(dǎo)因子的療效、促進(jìn)肝臟增殖并可用于治療各種原因引起的肝臟疾病。
本發(fā)明的另一目的在于公開一種從人類或其他哺乳類動(dòng)物的胚胎、血液、脊髓、臍帶血或幼體哺乳類動(dòng)物肝臟中制備的干細(xì)胞復(fù)合藥物的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于公開一種干細(xì)胞復(fù)合藥物在制備促進(jìn)干細(xì)胞向成熟肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)化及治療肝臟疾病藥物上的應(yīng)用。
上述目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種干細(xì)胞復(fù)合藥物，包括干細(xì)胞和肝細(xì)胞誘導(dǎo)因子；其中所述的干細(xì)胞是以人胚胎、臍帶血、脊髓等為原料，采用免疫磁珠陽性篩選制備的干細(xì)胞；所述的肝細(xì)胞誘導(dǎo)因子由哺乳類動(dòng)物胚胎或幼體肝臟中提取，經(jīng)層析方法分離、純化的具有生物學(xué)活性的小分子量多肽，分子量為0.8-6KD，優(yōu)選1.2-6KD。
使用時(shí)可以先使用干細(xì)胞誘導(dǎo)因子，然后用異源干細(xì)胞，也可以先用異源干細(xì)胞，再用細(xì)胞誘導(dǎo)因子，二者協(xié)同作用，促進(jìn)異源干細(xì)胞在肝臟存活，并促進(jìn)干細(xì)胞向肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明干細(xì)胞的制備方法包括如下步驟4)將原料稀釋得到稀釋液；5)單核細(xì)胞的獲得；6)免疫磁珠陽性篩選。
其中步驟1)中的原料稀釋是采用以20ml枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩沖溶液稀釋臍帶血或脊髓塊等，得到臍帶血或脊髓稀釋液；緩沖溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
或?qū)⑷嘶蚱渌溉閯?dòng)物的胚胎勻漿。
步驟2)中通過下述方法獲得單核細(xì)胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll分層，，4℃ 800g離心30分鐘，收集界面層后，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，得到脊髓單核細(xì)胞收集界面層。
上述制備方法中還包括采用流式細(xì)胞儀分選干細(xì)胞。
當(dāng)采用臍帶血為原料時(shí)，還包括將棄上清后的沉淀物用紅細(xì)胞裂解液4℃下裂解10分鐘。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，300g離心20分鐘，采用流式細(xì)胞儀分選干細(xì)胞，得到臍帶血的單核細(xì)胞(MNC)。
步驟3)中的免疫磁珠陽性篩選為采用MNC∶Dynabeads M-450CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。Dynabeads M-450 CD34洗滌，置于磁板(MPC)1分鐘，棄清液，PBS緩沖液洗滌2次。混合磁珠(MACS，Miltenyi公司產(chǎn)品)和臍帶血的單核細(xì)胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分鐘，陽性篩選CD34+細(xì)胞。
玫瑰花環(huán)狀細(xì)胞—磁珠重新懸起，置于磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重復(fù)3次，得玫瑰花環(huán)狀細(xì)胞—磁珠，懸于100μl PBS緩沖液。Detachabead CD34解離細(xì)胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩沖液，混勻，置于磁板(MPC)2分鐘，收集細(xì)胞清液，重復(fù)3次，匯集細(xì)胞清液，置于MPC 2分鐘，除去殘留磁珠，將細(xì)胞清液移入錐形試管。離心、洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀FACS檢測(cè)。
為避免胞內(nèi)冰晶損傷和溶液損傷，采用人胚胎細(xì)胞較多應(yīng)用的玻璃化凍存方法。首先冰浴預(yù)冷凍存液，細(xì)胞離心管置于冰水浴操作，沿離心管壁緩加凍存液(何種凍存液)，至細(xì)胞終濃度為1×1061.5×106，吹吸勻。分裝于凍存管中，火焰封口，將凍存管直接投入液氮罐保存，降溫速度約為600℃/min，進(jìn)行細(xì)胞凍存。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞濃度調(diào)至1×106培養(yǎng)。
本發(fā)明中采用MTT法測(cè)定干細(xì)胞增殖來鑒定所得干細(xì)胞的活性。具體為以無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)板中，加入MTT(中文名)溶液，孵育，離心，棄培養(yǎng)板孔內(nèi)上清，加入二甲基亞砜。酶聯(lián)免役檢測(cè)儀測(cè)定OD570檢測(cè)干細(xì)胞是否出現(xiàn)明顯增殖，如有增殖說明所制備的干細(xì)胞具有活性。
本發(fā)明中采用免疫組化法檢查干細(xì)胞是否向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具體為取細(xì)胞涂片，丙酮固定，加稀釋一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)，37℃ 40分鐘，PBS洗3次，每次3分鐘。加FITC標(biāo)記的二抗(1∶50稀釋)，37℃條件下保存40分鐘。PBS洗3次每次3分鐘。緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人干細(xì)胞增殖及向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
CD34+細(xì)胞用Hoechest33342、PKH26雙標(biāo)，尾靜脈注射干細(xì)胞藥物。取觀察臟器制成冰凍切片、石蠟切片。細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定采用紫外熒光顯微成像，激光共聚焦細(xì)胞儀觀察。細(xì)胞人源性檢測(cè)采用PCR技術(shù)，提取組織中的DNA，用PCR的方法特異性的擴(kuò)增人Alu序列，用于區(qū)分人和鼠的細(xì)胞。如果PCR擴(kuò)增有陽性結(jié)果，可進(jìn)一步通過用人Alu序列的核酸探針進(jìn)行原位雜交鑒定。細(xì)胞造血干細(xì)胞性質(zhì)檢測(cè)采用CD34+CD38+雙標(biāo)，Confolcal檢測(cè)。CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，尾靜脈注射入裸鼠，加干細(xì)胞誘導(dǎo)因子SIF，取肝制成冰凍切片，激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)。CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，尾靜脈注射入裸鼠，加SIF的PBS緩沖液，取肝制成冰凍切片，激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)。CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，尾靜脈注射入裸鼠，取肝制成冰凍切片，激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)。
肝性化檢測(cè)，采用免疫組化方法可用CK14、CK19、清蛋白、AFP分別鑒定。肝細(xì)胞標(biāo)記還可用HepParl，OC可采用OV-6和CD-117標(biāo)記。免疫組化設(shè)立人肝陽性對(duì)照、鼠肝陰性對(duì)照。
本發(fā)明所述的肝細(xì)胞誘導(dǎo)因子是來源于人類或哺乳類動(dòng)物胚胎肝臟的多肽類轉(zhuǎn)化因子。其制備方法是取健康未哺乳新生牛、乳豬或乳羊等哺乳類動(dòng)物的肝臟處理后，冰浴中在勻漿器勻漿，過濾組織碎片，超聲波細(xì)胞粉碎(冰浴)，高溫變性，醇沉，離心，取沉淀物溶于0.02M Tris-HCL(PH7.7)，DEAE離子交換樹脂層析分離(或研磨、離心后經(jīng)截留分子量小于20kD的濾膜過濾，濾液經(jīng)濃縮凍干，用Sephadex LH 20層析柱制備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離。)0-0.7M NaCl連續(xù)梯度洗脫，收集0.5M NaCl處洗脫液，凍干或制成無菌水溶液、顆粒劑、膠囊等，冷暗處保存，即得。
本發(fā)明采用紫外分光光度法測(cè)定鑒別所述的肝細(xì)胞誘導(dǎo)因子。濃度為1mg/ml時(shí)PH為6.8，蛋白質(zhì)、異常毒性、過敏試驗(yàn)、無菌等檢查均符合《中國藥典》2000年版(二部)各項(xiàng)下要求。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述的實(shí)施例是用于描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。


圖1.CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，干細(xì)胞誘導(dǎo)因子SIF作用于肝臟的激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖；圖2.CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，加SIF的PBS緩沖液，取肝制成冰凍切片，激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖；圖3.CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，取肝制成冰凍切片，激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖；干細(xì)胞誘導(dǎo)因子的活性鑒定，采用(1)運(yùn)用流式細(xì)胞儀分離人臍血中的造血干細(xì)胞。CD34抗體標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀分選CD34+細(xì)胞，并以無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml細(xì)胞，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。(2)以MTT法測(cè)定干細(xì)胞增殖，以無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為200μl，培養(yǎng)3天，接種細(xì)胞。每孔加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，孵育4小時(shí)。1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘。棄培養(yǎng)板孔內(nèi)上清。每孔加入150μl二甲基亞砜，震蕩15分鐘。酶聯(lián)免役檢測(cè)儀測(cè)定OD570。(3)免疫組化法檢查干細(xì)胞是否向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化，采用細(xì)胞涂片，丙酮固定10分鐘。加稀釋一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)37℃×40分鐘。PBS洗3×3分鐘。加FITC標(biāo)記的二抗(1∶50稀釋)37℃×40分鐘。PBS洗3×3分鐘。緩沖甘油封片。熒光顯微鏡下檢查。實(shí)驗(yàn)表明干細(xì)胞誘導(dǎo)因子能促進(jìn)人干細(xì)胞增殖及向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
干細(xì)胞誘導(dǎo)因子潛在藥物療效的評(píng)價(jià)，在整體動(dòng)物水平探索干細(xì)胞誘導(dǎo)因子對(duì)肝臟疾病的治療作用，在整體動(dòng)物水平和細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)在造血干細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中干細(xì)胞誘導(dǎo)因子的作用。免疫磁珠陽性篩選獲得實(shí)驗(yàn)所需臍帶血CD34+細(xì)胞，并建立細(xì)胞藥物篩選平臺(tái)。細(xì)胞凍存或細(xì)胞濃度調(diào)至1×106培養(yǎng)，為避免胞內(nèi)冰晶損傷和溶液損傷，采用人胚胎細(xì)胞較多應(yīng)用的玻璃化凍存方法。CD34+細(xì)胞用Hoechest33342、PKH26雙標(biāo)尾靜脈注射，加干細(xì)胞誘導(dǎo)因子組首次因子劑量加倍，以后每天皮下注射追加因子。定期處死動(dòng)物，取肝、脾，制成冰凍切片、石蠟切片。采用紫外熒光顯微成像、激光共聚焦細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定。提取組織中的DNA，用PCR的方法特異性的擴(kuò)增人Alu序列，用于區(qū)分人和鼠的細(xì)胞。進(jìn)行細(xì)胞人源性檢測(cè)。PCR擴(kuò)增有陽性結(jié)果后，進(jìn)一步通過用人Alu序列的核酸探針進(jìn)行原位雜交鑒定。以CD34+CD38+雙標(biāo)，Confolcal進(jìn)行造血干細(xì)胞性質(zhì)檢測(cè)。采用免疫組化方法進(jìn)行肝性化檢測(cè)。所用動(dòng)物均為裸鼠肝纖維化損傷模型。CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，尾靜脈注射入裸鼠，加干細(xì)胞誘導(dǎo)因子SIF，取肝制成冰凍切片，激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果見圖1。CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，尾靜脈注射入裸鼠，加SIF的PBS緩沖液，取肝制成冰凍切片，激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)。CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，尾靜脈注射入裸鼠，取肝制成冰凍切片，激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干細(xì)胞誘導(dǎo)因子對(duì)肝臟疾病的具有良好的治療作用，在造血干細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中干細(xì)胞誘導(dǎo)因子具有明顯的促進(jìn)作用，可阻止肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞DNA的合成明顯加快，促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用，加速肝臟組織的修復(fù)。
本發(fā)明所述的干細(xì)胞誘導(dǎo)因子也可以采用現(xiàn)有技術(shù)中公開的從動(dòng)物體內(nèi)提取的各種促肝細(xì)胞生長素及具有類似功能的藥物。
本發(fā)明中，采用干細(xì)胞誘導(dǎo)因子與異源干細(xì)胞(如人造血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞等)協(xié)同使用，使用時(shí)可以先用干細(xì)胞誘導(dǎo)因子，然后用異源干細(xì)胞，也可以先用干異源干細(xì)胞，再用細(xì)胞誘導(dǎo)因子，二者協(xié)同作用，促進(jìn)異源干細(xì)胞在肝臟存活，并促進(jìn)干細(xì)胞向肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可用于干細(xì)胞治療各種肝病。注射用量100ug/kg，一日一次，10-14天為一療程。亦可單獨(dú)應(yīng)用于各種急慢性肝病。促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和肝臟組織的損傷修復(fù)。
本發(fā)明經(jīng)MNC細(xì)胞獲取、CD34抗體標(biāo)記、流式細(xì)胞儀分選及細(xì)胞接種分離干細(xì)胞，方法簡便快捷；以MTT法測(cè)定干細(xì)胞增殖，免疫組化法檢查干細(xì)胞是否向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化，特異性強(qiáng)；所述的干細(xì)胞復(fù)合藥物經(jīng)誘導(dǎo)可定向轉(zhuǎn)化，用于干細(xì)胞治療各種疾病及進(jìn)行細(xì)胞藥物的篩選，對(duì)各種原因引起的急、慢性肝臟疾病適應(yīng)癥患者肌注或靜注、口服給藥，實(shí)用有效。本發(fā)明的干細(xì)胞復(fù)合藥物可有效地促進(jìn)自體或異體干細(xì)胞在肝臟的增殖及轉(zhuǎn)化，通過肝細(xì)胞再生及細(xì)胞誘導(dǎo)因子的協(xié)同作用，達(dá)到提高和恢復(fù)肝功能的目的，可用于各種急、慢性肝病的治療。本發(fā)明的干細(xì)胞復(fù)合藥物具有特異的生物活性，安全無毒、無致病性。另外本發(fā)明因無種屬特異性，所以可從多種哺乳類動(dòng)物的胚胎和幼體肝臟提取、分離，純化，生產(chǎn)工藝簡單。
實(shí)施例1取人14周胚胎脊髓約5g剪碎，以20ml枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩沖溶液稀釋，得到脊髓稀釋液；緩沖溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
脊髓稀釋液用Ficoll(Sigma公司產(chǎn)品)分層，F(xiàn)icoll∶CB＝3∶7，4℃ 800g離心30分鐘。收集界面層后，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，得到脊髓單核細(xì)胞(MNC)。
以磁珠(MACS，Miltenyi公司產(chǎn)品)陽性篩選CD34(抗體)和脊髓單核細(xì)胞(MNC)，所用抗體為Dynabeads M-450 CD34和Detachabead CD34，與MNC的比例及用量為MNC∶Dynabeads M-450 CD34抗體(Dynal公司產(chǎn)品)∶Detachabead CD34抗體(Dynal公司產(chǎn)品)＝4×108∶4×107∶4×107(濃度)＝1ml∶100μl∶100μl(用量)。
陽性篩選CD34+細(xì)胞(MNC)——混合磁珠和細(xì)胞，4℃下微旋孵育30分鐘。
首先用Dynabeads M-450 CD34洗滌脊髓單核細(xì)胞，置于磁板(MPC)1分鐘，棄清液后，用PBS緩沖液洗滌4次。
陽性篩選CD34+細(xì)胞(MNC)，——將玫瑰花環(huán)狀細(xì)胞——磁珠重新懸起，置于磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重復(fù)3次，得玫瑰花環(huán)狀細(xì)胞—磁珠，懸于100mlPBS緩沖液中。用Detachabead CD34解離細(xì)胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩沖液混勻，置于磁板(MPC)2分鐘，收集細(xì)胞清液，重復(fù)3次，匯集細(xì)胞清液，置于磁板(MPC)2分鐘，除去殘留磁珠，將細(xì)胞清液移入錐形試管。離心、洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，CD34、CD3雙標(biāo)，流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)MACS陽性篩選CD34+細(xì)胞。得到脊髓干細(xì)胞。
為避免胞內(nèi)冰晶損傷和溶液損傷，采用人胚胎細(xì)胞較多應(yīng)用的玻璃化凍存方法。首先冰浴預(yù)冷凍存液，細(xì)胞離心管置于冰水浴操作，沿離心管壁緩加凍存液，細(xì)胞終濃度為1×1061.5×106，吹吸勻。分裝于凍存管中，火焰封口，將凍存管直接投入液氮罐保存，降溫速度約為600℃/min，進(jìn)行細(xì)胞凍存。
實(shí)施例2參考實(shí)施例1的方法，具體操作如下取人臍帶血約100ml，以枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩沖溶液稀釋，得到臍帶血的稀釋液，緩沖溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
人臍帶血稀釋液用Ficoll(Sigma公司產(chǎn)品)分層，F(xiàn)icoll∶CB＝3∶7，4℃ 800g離心30分鐘。收集界面層后，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清。沉淀物用紅細(xì)胞裂解液4℃下裂解10分鐘。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，300g離心20分鐘，采用流式細(xì)胞儀分選干細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，F(xiàn)ASC檢測(cè)，調(diào)整細(xì)胞至4×107，得到臍帶血的單核細(xì)胞(MNC)。
采用MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。Dynabeads M-450 CD34洗滌，置于磁板(MPC)1分鐘，棄清液，PBS緩沖液洗滌2次?；旌洗胖?MACS，Miltenyi公司產(chǎn)品)和臍帶血的單核細(xì)胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分鐘，陽性篩選CD34+細(xì)胞。
玫瑰花環(huán)狀細(xì)胞—磁珠重新懸起，置于磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重復(fù)3次，得玫瑰花環(huán)狀細(xì)胞—磁珠，懸于100μl PBS緩沖液。Detachabead CD34解離細(xì)胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩沖液，混勻，置于磁板(MPC)2分鐘，收集細(xì)胞清液，重復(fù)3次，匯集細(xì)胞清液，置于MPC 2分鐘，除去殘留磁珠，將細(xì)胞清液移入錐形試管。離心、洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀FACS檢測(cè)。
實(shí)施例3同實(shí)施例1，不同之處在于采用10周豬胚胎脊髓為原料，得到豬脊髓干細(xì)胞。
實(shí)施例4同實(shí)施例2，不同之處在于采用牛臍帶血為原料，得到牛臍帶血干細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)例1干細(xì)胞活性的鑒定方法如下MTT法測(cè)定干細(xì)胞增殖將實(shí)施例1-4的干細(xì)胞細(xì)胞濃度分別調(diào)至1×106，以無血清培養(yǎng)基分別制備上述實(shí)施例的單細(xì)胞懸液，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)中，每孔體積為200μl，培養(yǎng)3天，接種細(xì)胞。每孔加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，孵育4小時(shí)。1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘。棄培養(yǎng)板孔內(nèi)上清。每孔加入150μl二甲基亞砜，震蕩15分鐘。酶聯(lián)免役檢測(cè)儀測(cè)定OD570，實(shí)施例1-4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明干細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖，說明所制備的干細(xì)胞具有活性。
實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)例涉及干細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的鑒定采用免疫組化法檢查干細(xì)胞是否向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化取細(xì)胞涂片，丙酮固定10分鐘。加稀釋一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)，37℃下放置40分鐘，PBS緩沖液洗3次，每次3分鐘。加FITC標(biāo)記的二抗(1∶50稀釋)，37℃條件下保存40分鐘。PBS洗3次每次3分鐘。緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人干細(xì)胞增殖及向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
實(shí)驗(yàn)例3本實(shí)驗(yàn)例涉及臍帶血來源的干細(xì)胞對(duì)于肝臟損傷的修復(fù)。
裸鼠肝損傷模型造膜以40％CCl4橄欖油，0.3ml/100g，2次/周，皮下注射，6周制成肝纖維化模型。免疫磁珠陽性篩選獲得實(shí)驗(yàn)所需臍帶血CD34+細(xì)胞，并建立細(xì)胞藥物篩選平臺(tái)。
依實(shí)驗(yàn)分組情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，CD34+細(xì)胞用Hoechest33342、PKH26雙標(biāo)，尾靜脈注射促肝細(xì)胞生長因子(市售產(chǎn)品)，首次因子劑量加倍，以后每天皮下注射追加促肝細(xì)胞生長因子。定期處死動(dòng)物，取肝、脾，制成冰凍切片、石蠟切片。以紫外熒光顯微成像、激光共聚焦細(xì)胞儀，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定。參見圖1-3。
以PCR技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞人源性檢測(cè)。提取組織中的DNA，用PCR的方法特異性的擴(kuò)增人Alu序列，用于區(qū)分人和鼠的細(xì)胞。設(shè)立人肝陽性對(duì)照、鼠肝陰性對(duì)照。PCR步驟1mm3大小的組織塊置于EP管中，加25μl 1×TE緩沖液，搗碎組織塊，取1μl組織漿置于PCR反應(yīng)管中，加基因釋放劑20μl，振蕩10-30秒，加一層石蠟油，置微波爐中加熱5-7分鐘，置預(yù)調(diào)至80-90度的擴(kuò)增儀上，分別按要求加入引物、Mg2+、dNTP、ddH2O、TaqDNA聚合酶，進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增條帶。如果PCR擴(kuò)增有陽性結(jié)果，可進(jìn)一步通過用人Alu序列的核酸探針進(jìn)行原位雜交鑒定。CD34+CD38+雙標(biāo)，Confolcal檢測(cè)進(jìn)行細(xì)胞造血干細(xì)胞性質(zhì)檢測(cè)。
采用免疫組化方法進(jìn)行肝性化檢測(cè)，設(shè)立人肝陽性對(duì)照、鼠肝陰性對(duì)照。免疫組化步驟載玻片酸洗、預(yù)處理、石蠟切片處理、冰凍切片處理。染色步驟3％H2O2室溫孵育5～10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘。飽和處理內(nèi)源性生物素，將切片浸入25μg/ml親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。蛋白酶消化或抗原修復(fù)，具體按要求進(jìn)行。5-10％正常二抗來源的動(dòng)物血清封閉(PBS稀釋)，室溫孵育10分鐘，傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗工作液，37度孵育1-2小時(shí)或4度過夜。(置濕盒中)PBS沖洗，5分鐘3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記的二抗(1％BSA-PBS稀釋)，37度孵育10-30分鐘。PBS沖洗，5分鐘3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的LRP標(biāo)記的鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37度孵育10-30分鐘，PBS沖洗，5分鐘3次。顯色劑顯色(DAB或AEC)，自來水充分沖洗，復(fù)染(蘇木素)，正常羊血清封片，觀察。
上述結(jié)果表明，所制備的干細(xì)胞可以用于治療、修復(fù)病變或失去功能的組織或器官。
實(shí)施例4干細(xì)胞誘導(dǎo)因子是來源于人類或哺乳類動(dòng)物胚胎肝臟的多肽類轉(zhuǎn)化因子。其生產(chǎn)方法是取健康未哺乳新生牛、乳豬或乳羊等哺乳類動(dòng)物的肝臟處理后，冰浴中在勻漿器勻漿，過濾組織碎片，超聲波細(xì)胞粉碎(冰浴)，高溫變性，醇沉，離心，取沉淀物溶于0.02M Tris-HCL(PH7.7)，DEAE離子交換樹脂層析分離(或研磨、離心后經(jīng)截留分子量小于20kD的濾膜過濾，濾液經(jīng)濃縮凍干，用Sephadex LH 20層析柱制備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離。)0-0.7M NaCl連續(xù)梯度洗脫，收集0.5M NaCl處洗脫液，凍干或制成無菌水溶液、顆粒劑、膠囊等，冷暗處保存，即得。
本品鑒別采用紫外分光光度法測(cè)定。濃度為1mg/ml時(shí)PH為6.8，蛋白質(zhì)、異常毒性、過敏試驗(yàn)、無菌等檢查均符合《中國藥典》2000年版(二部)各項(xiàng)下要求。
干細(xì)胞誘導(dǎo)因子的活性鑒定，采用(1)運(yùn)用流式細(xì)胞儀分離人臍血中的造血干細(xì)胞。CD34抗體標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀分選CD34+細(xì)胞，并以無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml細(xì)胞，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。(2)以MTT法測(cè)定干細(xì)胞增殖，以無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為200μl，培養(yǎng)3天，接種細(xì)胞。每孔加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，孵育4小時(shí)。1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘。棄培養(yǎng)板孔內(nèi)上清。每孔加入150μl二甲基亞砜，震蕩15分鐘。酶聯(lián)免役檢測(cè)儀測(cè)定OD570。(3)免疫組化法檢查干細(xì)胞是否向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化，采用細(xì)胞涂片，丙酮固定10分鐘。加稀釋一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)37℃×40分鐘。PBS洗3×3分鐘。加FITC標(biāo)記的二抗(1∶50稀釋)37℃×40分鐘。PBS洗3×3分鐘。緩沖甘油封片。熒光顯微鏡下檢查。實(shí)驗(yàn)表明干細(xì)胞誘導(dǎo)因子能促進(jìn)人干細(xì)胞增殖及向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
干細(xì)胞誘導(dǎo)因子潛在藥物療效的評(píng)價(jià)，在整體動(dòng)物水平探索干細(xì)胞誘導(dǎo)因子對(duì)肝臟疾病的治療作用，在整體動(dòng)物水平和細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)在造血干細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中干細(xì)胞誘導(dǎo)因子的作用。免疫磁珠陽性篩選獲得實(shí)驗(yàn)所需臍帶血CD34+細(xì)胞，并建立細(xì)胞藥物篩選平臺(tái)。細(xì)胞凍存或細(xì)胞濃度調(diào)至1×106培養(yǎng)，為避免胞內(nèi)冰晶損傷和溶液損傷，采用人胚胎細(xì)胞較多應(yīng)用的玻璃化凍存方法。CD34+細(xì)胞用Hoechest33342、PKH26雙標(biāo)尾靜脈注射，加干細(xì)胞誘導(dǎo)因子組首次因子劑量加倍，以后每天皮下注射追加因子。定期處死動(dòng)物，取肝、脾，制成冰凍切片、石蠟切片。采用紫外熒光顯微成像、激光共聚焦細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定。提取組織中的DNA，用PCR的方法特異性的擴(kuò)增人Alu序列，用于區(qū)分人和鼠的細(xì)胞。進(jìn)行細(xì)胞人源性檢測(cè)。PCR擴(kuò)增有陽性結(jié)果后，進(jìn)一步通過用人Alu序列的核酸探針進(jìn)行原位雜交鑒定。以CD34+CD38+雙標(biāo)，Confolcal進(jìn)行造血干細(xì)胞性質(zhì)檢測(cè)。采用免疫組化方法進(jìn)行肝性化檢測(cè)。所用動(dòng)物均為裸鼠肝纖維化損傷模型。CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，尾靜脈注射入裸鼠，加干細(xì)胞誘導(dǎo)因子SIF，取肝制成冰凍切片，激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果見圖1。CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，尾靜脈注射入裸鼠，加SIF的PBS緩沖液，取肝制成冰凍切片，激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果見圖2。CD34+細(xì)胞，Hoechest33342、PHK26雙標(biāo)，尾靜脈注射入裸鼠，取肝制成冰凍切片，激光共聚焦細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干細(xì)胞誘導(dǎo)因子對(duì)肝臟疾病的具有良好的治療作用，在造血干細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中干細(xì)胞誘導(dǎo)因子具有明顯的促進(jìn)作用，可阻止肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞DNA的合成明顯加快，促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用，加速肝臟組織的修復(fù)。
實(shí)施例5胚胎豬肝來源的干細(xì)胞誘導(dǎo)因子取新鮮胚胎豬肝，用無鈣鎂HBSS緩沖液肝臟灌流，剪切成小塊(1-3mm2)研磨，離心后經(jīng)截留分子量小于20kD的濾膜過濾，濾液經(jīng)濃縮凍干，用Sephadex LH20層析柱制備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離。冷凍干燥后，無菌分裝。
每批含量和活性由藥典標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。
無菌提取的胚胎干細(xì)胞或干細(xì)胞克隆來源的干細(xì)胞，靜注給予治療107個(gè)/60kg后治療組給予肌注或靜注干細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子100ug/kg一日一次，10-14天為一療程。
治療效果鑒定可見肝臟干細(xì)胞增殖并有分化趨勢(shì)，臨床檢測(cè)各肝功能逐漸恢復(fù)。
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及臨床應(yīng)用均同前。
實(shí)施例6新生牛來源的干細(xì)胞誘導(dǎo)因子取健康未哺乳新生牛的肝臟，用無鈣鎂HBSS緩沖液肝臟灌流，高速組織搗碎機(jī)搗碎，離心后經(jīng)截留分子量小于20kD的濾膜過濾，濾液，用Sephadex LH 20層析柱制備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以離子交換樹脂層析分離。濃縮后凍干，無菌分裝，即得。
實(shí)施例7新生豬肝來源的干細(xì)胞誘導(dǎo)因子取新生健康未哺乳豬的肝臟，經(jīng)處理后，在勻漿器中勻漿(冰浴)，經(jīng)截留分子量小于20kD的濾膜過濾，用Sephadex LH 20層析柱制備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離，5ml/min流速上樣，收集0.5M NaCl處洗脫液，制成無菌水溶液，4℃以下保存，即得。
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及臨床應(yīng)用基本同前。
權(quán)利要求
1.一種干細(xì)胞復(fù)合藥物，包括干細(xì)胞和肝細(xì)胞誘導(dǎo)因子；其中所述的干細(xì)胞是以人或其他哺乳動(dòng)物的胚胎、臍帶血、脊髓為原料，采用免疫磁珠陽性篩選制備的干細(xì)胞；所述的肝細(xì)胞誘導(dǎo)因子由哺乳類動(dòng)物胚胎或幼體肝臟中提取經(jīng)層析方法分離、純化的具有生物學(xué)活性的小分子量多肽，分子量為0.8-6KD，優(yōu)選1.2-6KD；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干細(xì)胞復(fù)合藥物，其制備方法包括如下步驟1)將原料稀釋得到稀釋液；2)單核細(xì)胞的獲得；3)免疫磁珠陽性篩選。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種干細(xì)胞復(fù)合藥物，其制備方法的步驟1)中的原料稀釋為以20ml枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩沖溶液稀釋臍帶血或脊髓塊等，得到臍帶血或脊髓稀釋液；緩沖溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4?；?qū)⑷嘶蚱渌溉閯?dòng)物的胚胎勻漿后稀釋。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種干細(xì)胞復(fù)合藥物，其中步驟2)中通過下述方法獲得單核細(xì)胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll將脊髓或胚胎稀釋液分層，4℃800g離心30分鐘，收集界面層后，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，得到脊髓單核細(xì)胞收集界面層。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種干細(xì)胞復(fù)合藥物，上還包括采用流式細(xì)胞儀分選干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種干細(xì)胞復(fù)合藥物，其中步驟2)中通過下述方法獲得單核細(xì)胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll將臍帶血稀釋液分層，4℃ 800g離心30分鐘，收集界面層后，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，將棄上清后的沉淀物用紅細(xì)胞裂解液4℃下裂解10分鐘，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，300g離心20分鐘，采用流式細(xì)胞儀分選干細(xì)胞，得到臍帶血的單核細(xì)胞(MNC)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種干細(xì)胞復(fù)合藥物，步驟3)中的免疫磁珠陽性篩選為Dynabeads M-450 CD34洗滌，置于磁板(MPC)1分鐘，棄清液，PBS緩沖液洗滌2次，混合磁珠(MACS，Miltenyi公司產(chǎn)品)和臍帶血的單核細(xì)胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分鐘，陽性篩選CD34+細(xì)胞；玫瑰花環(huán)狀細(xì)胞—磁珠重新懸起，置于磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重復(fù)3次，得玫瑰花環(huán)狀細(xì)胞—磁珠，懸于100μl PBS緩沖液；Detachabead CD34解離細(xì)胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩沖液，混勻，置于磁板(MPC)2分鐘，收集細(xì)胞清液，重復(fù)3次，匯集細(xì)胞清液，置于MPC 2分鐘，除去殘留磁珠，將細(xì)胞清液移入錐形試管；離心、洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀FACS檢測(cè)；其中MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干細(xì)胞復(fù)合藥物，其特征在于所述的肝細(xì)胞誘導(dǎo)因子的制備方法是取健康未哺乳新生牛、乳豬或乳羊等哺乳類動(dòng)物的肝臟處理后，冰浴中在勻漿器勻漿，過濾組織碎片，超聲波細(xì)胞粉碎，高溫變性，醇沉，離心，取沉淀物溶于0.02M Tris-HCL，PH7.7，DEAE離子交換樹脂層析分離，或研磨、離心后經(jīng)截留分子量小于20kD的濾膜過濾，濾液經(jīng)濃縮凍干，用Sephadex LH20層析柱制備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離；0-0.7M NaCl連續(xù)梯度洗脫，收集0.5M NaCl處洗脫液，凍干或制成無菌水溶液、顆粒劑、膠囊等，冷暗處保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞復(fù)合治療藥物，其特征在于可制成注射用凍干制劑、注射液、顆粒劑或膠囊劑型。
10.權(quán)利要求1所述干細(xì)胞復(fù)合藥物的制備方法，包括(1).干細(xì)胞的制備以20ml枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩沖溶液稀釋臍帶血或脊髓塊等，得到臍帶血或脊髓稀釋液；緩沖溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4；或?qū)⑷嘶蚱渌溉閯?dòng)物的胚胎勻漿后稀釋。按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll將脊髓或胚胎稀釋液分層，4℃ 800g離心30分鐘，收集界面層后，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，得到脊髓或或胚胎單核細(xì)胞收集界面層。用流式細(xì)胞儀分選干細(xì)胞。免疫磁珠陽性篩選Dynabeads M-450 CD34洗滌，置于磁板(MPC)1分鐘，棄清液，PBS緩沖液洗滌2次，混合磁珠和臍帶血的單核細(xì)胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分鐘，陽性篩選CD34+細(xì)胞；玫瑰花環(huán)狀細(xì)胞—磁珠重新懸起，置于磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重復(fù)3次，得玫瑰花環(huán)狀細(xì)胞—磁珠，懸于100μl PBS緩沖液；Detachabead CD34解離細(xì)胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩沖液，混勻，置于磁板2分鐘，收集細(xì)胞清液，重復(fù)3次，匯集細(xì)胞清液，置于MPC 2分鐘，除去殘留磁珠，將細(xì)胞清液移入錐形試管；離心、洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀FACS檢測(cè)。其中MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl；(2).肝細(xì)胞誘導(dǎo)因子取健康未哺乳新生牛、乳豬或乳羊等哺乳類動(dòng)物的肝臟處理后，冰浴中在勻漿器勻漿，過濾組織碎片，超聲波細(xì)胞粉碎，高溫變性，醇沉，離心，取沉淀物溶于0.02M Tris-HCL，DEAE離子交換樹脂層析分離，或研磨、離心后經(jīng)截留分子量小于20kD的濾膜過濾，濾液經(jīng)濃縮凍干，用Sephadex LH 20層析柱制備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離；0-0.7M NaCl連續(xù)梯度洗脫，收集0.5M NaCl處洗脫液，凍干或制成無菌水溶液、顆粒劑、膠囊等，冷暗處保存，即得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞復(fù)合藥物、其制備方法及其在用于治療各種肝病藥物上的應(yīng)用，所述干細(xì)胞復(fù)合藥物包括干細(xì)胞和肝細(xì)胞誘導(dǎo)因子；其中所述的干細(xì)胞是以人胚胎、臍帶血、脊髓等為原料，采用免疫磁珠陽性篩選制備的干細(xì)胞；所述的肝細(xì)胞誘導(dǎo)因子由哺乳類動(dòng)物胚胎或幼體肝臟中提取經(jīng)層析方法分離、純化的具有生物學(xué)活性的小分子量多肽；使用時(shí)二者協(xié)同作用，促進(jìn)異源干細(xì)胞在肝臟的存活及向肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
文檔編號(hào)A61K35/54GK1397344SQ0212363
公開日2003年2月19日 申請(qǐng)日期2002年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月2日
發(fā)明者韓梅, 王寧, 李凌松, 黃小華 申請(qǐng)人:北京北醫(yī)基因科技投資有限公司