專利名稱：一種肝癌干細(xì)胞及其分離方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細(xì)胞，尤其涉及一種肝癌干細(xì)胞。
背景技術(shù)：
隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，腫瘤診斷、治療的研究也取得了很大進(jìn)展，尤其是CT、NMR、PET等先進(jìn)的現(xiàn)代化診斷設(shè)備的引入臨床使得腫瘤的診斷向“準(zhǔn)確”、“早期”邁進(jìn)了一大步。同樣在治療方面由于近年來各種新型生物治療、化療藥物的引進(jìn)也使腫瘤的藥物治療效果有了明顯提高，但迄今多種腫瘤(包括肝癌)的發(fā)生機(jī)理尚未闡明。近年來由于“癌干細(xì)胞(cancer stem cell，簡(jiǎn)稱CSC)”概念的提出[Reya等，Nature(2001)414105-111]，人們對(duì)腫瘤治療效果評(píng)估的觀念有了明顯轉(zhuǎn)變，認(rèn)為即使療效再好的常規(guī)化療藥物也只能殺死腫瘤組織中的占數(shù)量比例較大的“普通腫瘤細(xì)胞”，治療期間可使腫瘤塊明顯縮小甚至“消失”，而對(duì)于其中為數(shù)不多(不足十萬分之一)的“非常腫瘤細(xì)胞”——即癌干細(xì)胞卻束手無策[Bissell等，Cancer Cell(2005)717-23；Patrawala等，Cancer Research(2005)656207-6219]，而且有跡象表明常規(guī)化療藥物治療腫瘤后由于癌干細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞的平衡被打破，會(huì)刺激癌干細(xì)胞非對(duì)稱分裂或分化為普通腫瘤細(xì)胞，最終導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移。
因此本領(lǐng)域迫切需要一種分離得到肝癌干細(xì)胞的方法，也需要將所得到的肝癌干細(xì)胞用于抗腫瘤藥物的篩選和制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種分離得到肝癌干細(xì)胞的方法，并且將所分離得到的肝癌干細(xì)胞用于重要的有效抗癌藥物或藥靶篩選，用于肝癌診斷/治療雙功能特異性單克隆抗體制備，以及獲得一種篩選特異性抑制肝癌干細(xì)胞生長的抑制劑、促進(jìn)肝癌干細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑、殺死肝癌干細(xì)胞的細(xì)胞毒性藥物的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種從肝癌細(xì)胞系中獲得肝癌干細(xì)胞的分離方法，它包括步驟
(a)將CD133/1單克隆抗體(也稱為AC133單克隆抗體)與含肝癌干細(xì)胞的肝癌細(xì)胞系混合，形成“CD133/1單克隆抗體-肝癌干細(xì)胞”二元復(fù)合物；(b)離心去除未結(jié)合的游離的CD133/1單克隆抗體，形成含“CD133/1單克隆抗體-肝癌干細(xì)胞”二元復(fù)合物的沉淀物；(c)使步驟(b)的沉淀物懸浮，并與磁珠標(biāo)記的抗小鼠IgG1第二抗體混合，形成“第二抗體-CD133/1單克隆抗體-肝癌干細(xì)胞”三元復(fù)合物；(d)用磁場(chǎng)分離步驟(c)中形成的三元復(fù)合物，從而獲得肝癌干細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中這種從肝癌細(xì)胞系中獲得肝癌干細(xì)胞的分離方法，包括步驟(a)將AC133/CD133/1單克隆抗體(IgG1，Miltenyi Biotec)與肝癌細(xì)胞系充分混合、冰浴上孵育一定時(shí)間，用含BSA的緩沖液反復(fù)洗滌、離心除去未結(jié)合的游離IgG1分子；(b)將步驟(a)的肝癌細(xì)胞系與適當(dāng)體積的磁珠標(biāo)記抗小鼠IgG1的第二抗體充分混合并在冰浴上孵育30分鐘從而形成肝癌干細(xì)胞-磁珠復(fù)合物；(c)讓步驟(b)獲得的肝癌干細(xì)胞-磁珠復(fù)合物及未被標(biāo)記的肝癌細(xì)胞系懸浮液一起加入安裝在恒定磁場(chǎng)的分離柱，用含BSA的緩沖液反復(fù)洗滌數(shù)次，使未被磁珠標(biāo)記的肝癌細(xì)胞流出分離柱，而被磁珠標(biāo)記的肝癌細(xì)胞(即肝癌干細(xì)胞)被吸附在分離柱上；(d)將吸附有肝癌干細(xì)胞的分離柱移出磁場(chǎng)，用分離柱芯打出分離柱，獲得分離的肝癌干細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，還提供了一種從肝癌細(xì)胞系中獲得肝癌干細(xì)胞的分離方法，它包括步驟(a)將磁珠與肝癌細(xì)胞系混合，所述的磁珠上固定有AC133/CD133/1單克隆抗體，從而形成肝癌干細(xì)胞-磁珠復(fù)合物；(b)分離步驟(a)中的肝癌干細(xì)胞-磁珠復(fù)合物；(c)將肝癌干細(xì)胞從復(fù)合物上解離下來，獲得分離的肝癌干細(xì)胞。
在所述的分離方法中，所述的肝癌細(xì)胞系和肝癌干細(xì)胞來自人。
更佳地，優(yōu)選的肝癌細(xì)胞系為(a)SMMC7721，(b)BEL7402，(c)Huh-7，(d)Hep3B，(e)MHCC-LM3，(f)MHCC-97L。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種由上述的分離方法得到的肝癌干細(xì)胞，它是人肝癌干細(xì)胞；在體內(nèi)或體外能分化為肝細(xì)胞；能形成腫瘤；它對(duì)腫瘤壞死因子誘發(fā)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯有抵抗作用。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了本發(fā)明提供的肝癌干細(xì)胞在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
它對(duì)常用腫瘤化療藥物有抗藥作用，其中優(yōu)選(a)環(huán)磷酰胺(b)順氯氨鉑(c)氨甲喋呤(d)硫酸長春新堿(e)5-氟尿嘧啶(f)順氯氨鉑(g)阿霉素。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了本發(fā)明提供的肝癌干細(xì)胞在制備診斷和治療肝癌干細(xì)胞特異性單克隆抗體中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種篩選抑制肝癌干細(xì)胞生長的抑制劑的方法，包括步驟(a)在測(cè)試組中，向肝癌干細(xì)胞培養(yǎng)物中添加待篩選的候選物，并檢測(cè)肝癌干細(xì)胞的增殖情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中肝癌干細(xì)胞的增殖情況與未添加候選物的對(duì)照組中肝癌干細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中的肝癌干細(xì)胞的增殖在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選明顯低于)對(duì)照組，就表明該候選物是抑制肝癌干細(xì)胞生長的化合物。
本發(fā)明提供的分離得到肝癌干細(xì)胞的方法可以富集肝癌于細(xì)胞；而且所分離得到的CD133+肝癌干細(xì)胞可以用于篩選抗腫瘤藥物、可以用于制備診斷和治療肝癌干細(xì)胞特異性單克隆抗體、可以提供了篩選抑制肝癌干細(xì)胞生長的抑制劑的方法等。


圖1肝癌細(xì)胞系中干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的表達(dá)圖2人肝癌相關(guān)組織中的癌干細(xì)胞擴(kuò)大倍數(shù)(d，g，j，m)×100，(a-c，e，h，k，n)×400，(f，i，l)×630圖3CD133+肝癌干細(xì)胞的體外克隆形成擴(kuò)大倍數(shù)×200圖4CD133+肝癌干細(xì)胞的體內(nèi)分化特性b擴(kuò)大倍數(shù)×400；c擴(kuò)大倍數(shù)×1000圖5CD133+肝癌干細(xì)胞的體內(nèi)成瘤性圖6CD133+肝癌干細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的抵抗作用圖7CD133+和CD133-SMMC-7721細(xì)胞對(duì)Vincristine的耐藥曲線圖8CD133+和CD133-SMMC-7721細(xì)胞對(duì)5’-Fluorouracil的耐藥曲線圖9CD133+和CD133-SMMC-7721細(xì)胞對(duì)Cisplatin的耐藥曲線圖10CD133+和CD133-SMMC-7721細(xì)胞對(duì)Adriamycin的耐藥曲線圖11CD133+肝癌干細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子(TNFα)誘發(fā)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的抵抗作用具體實(shí)施方式
CD133是胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞和部分組織的成體干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，我們通過對(duì)目前比較公認(rèn)的干細(xì)胞標(biāo)志物如CD117/c-kit，AC133/CD133/1，CD34，Dlk/Pref-1，CD45，CD90，CD28等通過一系列實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格篩選，最終選中CD133作為肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物，其它抗原的缺陷主要表現(xiàn)在(a)分選效率低(如CD117/c-kit，發(fā)明人曾用6個(gè)不同廠家的抗體未得到好的分選結(jié)果)提供了一種篩選抑制肝癌干細(xì)胞生長的抑制劑的方法(b)代表性差(如Dlk/Pref-1是胚胎干細(xì)胞標(biāo)志，在包括腫瘤干細(xì)胞在內(nèi)的成體干細(xì)胞與非干細(xì)胞表達(dá)均很低而且差異不明顯)，(c)分選的細(xì)胞分化能力低(如CD34，CD45，CD28抗體分選的肝癌細(xì)胞分化能力較低)。用特異性的AC133/CD133/1單克隆抗體和磁珠分選系統(tǒng)從肝癌細(xì)胞系中成功富集、分離肝癌干細(xì)胞。
本發(fā)明所稱的肝癌細(xì)胞系是人肝癌細(xì)胞系，其中優(yōu)選(a)SMMC7721，(b)BEL7402，(c)Huh-7，(d)Hep3B，(e)MHCC-LM3，(f)MHCC-97L。除正常肝組織外，肝癌、痛旁肝、肝硬化組織中具有為數(shù)不多的CD133陽性細(xì)胞。
本發(fā)明所稱的AC133/CD133/1單克隆抗體(monoclonal anti-CD133/1 IgG1，pure)，購自德國Miltenyi Biotec公司。本發(fā)明所稱的磁珠分選系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括步驟(a)將AC133/CD133/1單克隆抗體(mouse IgG1)與肝癌細(xì)胞系混合孵育，使其與表達(dá)CD133抗原的細(xì)胞(肝癌干細(xì)胞)結(jié)合；(b)將磁珠與步驟(a)的肝癌細(xì)胞系混合，所述的磁珠上固定有抗小鼠IgG1的特異性抗體，從而形成肝癌干細(xì)胞-磁珠復(fù)合物；(c)用磁式分選器分離步驟(b)中的肝癌干細(xì)胞-磁珠復(fù)合物；(d)將吸附步驟(c)肝癌干細(xì)胞-磁珠復(fù)合物的分離柱移開磁場(chǎng)，用磁式分離柱芯將步驟(c)的細(xì)胞打出，獲得分離的肝癌干細(xì)胞。
本發(fā)明分離得到的CD133+肝癌干細(xì)胞可以在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下(在軟瓊脂培養(yǎng)基中)體外形成克隆，其方法為用42℃下配制的含10％胎牛血清的0.6％低熔點(diǎn)瓊脂-干細(xì)胞培養(yǎng)基鋪6-well細(xì)胞培養(yǎng)板(底層)，待其在37℃下固化后，分別用含5×103個(gè)CD133+或CD133-SMMC7721-GFP單細(xì)胞-軟瓊脂懸液覆蓋底層膠，37℃下使其固化，最后在各孔中加入2ml干細(xì)胞培養(yǎng)基，每5天更換一次新鮮培養(yǎng)基，即得。
本發(fā)明分離得到的CD133+肝癌干細(xì)胞既有干細(xì)胞特性又具有肝癌細(xì)胞和肝臟來源特性；在體內(nèi)和體外均具有分化為成熟肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞及具有正常干細(xì)胞表型的細(xì)胞的特性。另一方面本發(fā)明分離得到的CD133+肝癌干細(xì)胞具有在體內(nèi)形成腫瘤的能力，500個(gè)細(xì)胞6周內(nèi)可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成明顯腫瘤。本發(fā)明分離得到的CD133+肝癌干細(xì)胞對(duì)幾十種常用腫瘤化療藥物有抗藥作用，其中對(duì)于對(duì)抗癌藥物(a)環(huán)磷酰胺(b)順氯氨鉑(c)氨甲喋呤(d)硫酸長春新堿(e)5-氟尿嘧啶(f)順氯氨鉑(g)阿霉素具有明顯的抵抗作用。另外，本發(fā)明分離得到的CD133+肝癌干細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子(TNFα)誘發(fā)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯有抵抗作用，CD133+肝癌干細(xì)胞的細(xì)胞周期幾乎不受TNFα的影響，而CD133-細(xì)胞主要阻滯于G1期。
根據(jù)以上所述顯示本發(fā)明分離得到的CD133+肝癌干細(xì)胞可以用于篩選抗腫瘤藥物；可以用于制備肝癌干細(xì)胞特異性單克隆抗體以診斷和治療腫瘤；可以用以獲得一種篩選抑制肝癌干細(xì)胞生長的抑制劑的方法，包括步驟(a)在測(cè)試組中，向肝癌干細(xì)胞培養(yǎng)物中添加待篩選的候選物，并檢測(cè)肝癌干細(xì)胞的增殖情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中肝癌干細(xì)胞的增殖情況與未添加候選物的對(duì)照組中肝癌干細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中的肝癌干細(xì)胞的增殖在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選明顯低于)對(duì)照組，就表明該候選物是抑制肝癌干細(xì)胞生長的化合物。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、可以富集肝癌干細(xì)胞；2、所分離得到的CD133+肝癌干細(xì)胞用途廣泛。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1肝癌細(xì)胞系中癌干細(xì)胞的分離、鑒定特異性的AC133/CD133/1單克隆抗體和磁珠分選系統(tǒng)從肝癌細(xì)胞系中富集、分離干細(xì)胞(1)肝癌細(xì)胞系中干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的表達(dá)圖1a-f均為人肝癌細(xì)胞系，其中(a)SMMC7721，(b)BEL7402，(c)Huh-7，(d)Hep3B，(e)MHCC-LM3，(f)MHCC-97L，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示上述細(xì)胞系中均有少量CD133+細(xì)胞(箭頭)；(2)磁珠分選所高效富集的CD133+細(xì)胞，其中(g)分選前細(xì)胞CD133+陽性細(xì)胞比例低，(h)分選后CD133+陽性比例大大提高<黃棕色>。
蛋白印跡(i)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，其中“+”表示分選后CD133+為陽性細(xì)胞，“-”表示分選后CD133-為陰性細(xì)胞，β-actin為內(nèi)參。
實(shí)施例2人肝癌相關(guān)組織中癌干細(xì)胞的識(shí)別、鑒定石蠟包埋肝癌、癌旁肝、肝硬化、正常肝組織切片中干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的表達(dá)(免疫組化檢測(cè))圖2a-c為肝癌組織，d-i為癌旁肝組織，j-l為肝硬化組織，m，n為正常肝組織。
從圖2可以看出，除正常肝組織外，肝癌、癌旁肝、肝硬化組織中具有為數(shù)不多的CD133陽性細(xì)胞(黃棕色)，白色箭頭標(biāo)示類Hering’s canal結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例3CD133+肝癌干細(xì)胞的體外克隆形成能力檢測(cè)用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)(Colony formation assay)檢測(cè)CD133+肝癌干細(xì)胞在軟瓊脂中的克隆形成能力，具體操作步驟為(1)用42℃下配制的含10％胎牛血清的0.6％低熔點(diǎn)瓊脂-干細(xì)胞培養(yǎng)基鋪6-well細(xì)胞培養(yǎng)板(底層)；(2)37℃下固化后，分別用含5×103個(gè)CD133+或CD133-SMMC7721-GFP單細(xì)胞-軟瓊脂懸液覆蓋底層膠；(3)37℃下固化，在各孔中加入2ml干細(xì)胞培養(yǎng)基，每5天更換一次新鮮培養(yǎng)基；(4)3周后對(duì)15個(gè)細(xì)胞以上的克隆在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)、拍照，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果見圖3棒狀圖(a)顯示克隆形成數(shù)，表示為平均數(shù)±s.d.(n＝12低倍視野)；棒狀圖(b)顯示克隆直徑，表示為平均數(shù)±s.d.(μm)；(c)為代表性圖片。
結(jié)果顯示CD133+肝癌細(xì)胞不論從形成克隆的數(shù)量，還是從形成克隆的大小均比CD133-細(xì)胞高，均具有顯著差異**，p＜0.001[其中克隆數(shù)p＝5.43416E-11；克隆直徑p＝5.1314E-07]實(shí)施例4CD133+肝癌干細(xì)胞的體內(nèi)分化特性檢測(cè)1、GFP和人白蛋白免疫共定位該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了CD133+肝癌干細(xì)胞在用免疫缺陷NOD/SCID小鼠復(fù)制的2-AAF/PHx和DMSO/PHx模型鼠體內(nèi)的分化能力，具體操作步驟為(1)6-7周齡的SPF雌性NOD/SCID復(fù)制的2-AAF/PHx和DMSO/PHx模型各組均為9只，每只鼠經(jīng)尾靜脈接種1×104CD133+-SMMC7721-GFP細(xì)胞；(2)接種1、2、3周后每組分別無痛苦處死3只小鼠，取其肝臟制作冰凍切片；(3)熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)陽性細(xì)胞(綠色)并進(jìn)行人白蛋白(Albumin)的熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)(紅色)和共定位，DAPI復(fù)染核(藍(lán)色)，分別采集同視野圖像，最后疊加(三色)。
結(jié)果圖4a顯示AAF/PHx組，有些細(xì)胞GFP綠色熒光和人Albumin紅色熒光重疊出現(xiàn)中間疊加色(黃色熒光)，說明分泌人白蛋白的“肝細(xì)胞”由GFP陽性的肝癌干細(xì)胞分化而來，而DMSO/PHx組為觀察到類似現(xiàn)象，說明AAF缺乏使得小鼠肝細(xì)胞本身的再生和分裂功能沒有被抑制，外源性肝癌干細(xì)胞的分裂分化功能未能被動(dòng)員。
2、Alu序列的原位PCR(in situ PCR)檢測(cè)為了驗(yàn)證上述肝癌干細(xì)胞的可靠性我們還進(jìn)行了上述肝組織連續(xù)切片的原位PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖4b所示的AAF/PHx組的CD133+-SMMC-7721-GFP接種鼠肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)Alu序列陽性的散在或簇狀分布肝細(xì)胞，而在接種同樣細(xì)胞的DMSO/PHx組小鼠中未檢測(cè)到Alu陽性細(xì)胞。
說明這些陽性細(xì)胞就是來源于人肝癌干細(xì)胞的分化細(xì)胞。
3、Y染色體熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)為了進(jìn)一步確認(rèn)人肝癌干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的分化，我們用雌性免疫缺陷小鼠復(fù)制的AAF/PHx和DMSO/PHx模型進(jìn)行了Y染色體FISH，具體操作步驟為(1)6-7周齡的SPF雌性NOD/SCID復(fù)制的2-AAF/PHx和DMSO/PHx模型各組均為9只，每只鼠經(jīng)尾靜脈接種1×104CD133+-SMMC-7721細(xì)胞；(2)接種1、2、3周后每組分別無痛苦處死3只小鼠，取其肝臟制作冰凍切片；(3)用Y-染色體直接熒光探針按其探針制備廠家推薦的操作程序稍加修改，進(jìn)行雜交(綠色)，DAPI復(fù)染核(藍(lán)色)，分別采集同視野圖像，最后疊加(雙色)。
結(jié)果在如圖4c所示的AAF/PHx組的CD133+-SMMC-7721接種鼠肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)Y染色體陽性的散在分布肝細(xì)胞，而在接種同樣細(xì)胞的DMSO/PHx組小鼠中未檢測(cè)到Y(jié)染色體陽性細(xì)胞。
說明這些陽性肝細(xì)胞就是由人肝癌干細(xì)胞分化而來。
4、Western blot(圖4d)驗(yàn)證了尾靜脈接種CD133+-SMMC7721-GFP細(xì)胞的AAF/PHx小鼠肝組織中有很強(qiáng)的特異性GFP，CK19，CK8/18條帶而在DMSO/PHx小鼠肝組織中其相應(yīng)蛋白幾乎檢測(cè)不到，Beta-actin為內(nèi)參。
實(shí)施例5CD133+肝癌干細(xì)胞的體內(nèi)成瘤體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)(in vivo tumor formation assay)檢測(cè)CD133+肝癌干細(xì)胞在免疫缺陷NBX小鼠皮下形成腫瘤能力，具體操作步驟為(1)每只試驗(yàn)BNX小鼠皮下分別接種500個(gè)CD133+-SMMC7721-GFP細(xì)胞和1×105CD133-SMMC-7721飼養(yǎng)細(xì)胞；(2)每只對(duì)照BNX小鼠皮下分別接種500個(gè)CD133--SMMC7721-GFP細(xì)胞和1×105CD133-SMMC-7721飼養(yǎng)細(xì)胞；
(3)4周后無痛苦處死所有動(dòng)物，拍照、取其腫瘤稱重。
結(jié)果如圖5。
a顯示試驗(yàn)鼠成瘤明顯大于對(duì)照鼠b棒狀圖顯示瘤重平均數(shù)±s.d.(n＝6)，p＝7.91912E-05c Western blot結(jié)果顯示接種CD133+細(xì)胞的成瘤組織CD133表達(dá)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CD133-細(xì)胞的成瘤組織。
實(shí)施例6CD133+肝癌干細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的抵抗作用(1)96-well細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔分別接種2×103CD133+和CD133-SMMC-7721細(xì)胞；(2)分別以抗癌藥物125μg/ml環(huán)磷酰胺，25μg/ml順氯氨鉑順氯氨鉑，5μg/ml氨甲喋呤，(d)0.25ng/ml硫酸長春新堿(e)5μg/ml 5-氟尿嘧啶，(f)5μg/ml順氯氨鉑，(g)2.5ng/ml阿霉素處理細(xì)胞；(3)常規(guī)MTT試驗(yàn)(490nm)在0h，12h，24h，36h和48h時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)其吸光度，設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，不加抗癌藥孔作為空白對(duì)照。
結(jié)果如圖6-10顯示CD133+細(xì)胞對(duì)抗癌藥物(a)環(huán)磷酰胺，(b)順氯氨鉑(DDP)，(c)氨甲喋呤，(d)硫酸長春新堿，(e)5-氟尿嘧啶，(f)順氯氨鉑，(g)阿霉素與CD133-細(xì)胞均具有明顯的抵抗作用(在48小時(shí)治療點(diǎn)a，p＝1.42E-07；b，p＝4.39E-05；c，p＝7.70E-07)(*，p＜0.01；**，p＜0.001).在CD133+細(xì)胞含藥和不含藥組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(在48小時(shí)治療點(diǎn)a，p＝0.788；b，p＝0.489；c，p＝0.745)。
實(shí)施例7CD133+肝癌干細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子(TNFα)誘發(fā)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的抵抗作用(1)10ng/ml TNFα分別處理分選的CD133+-SMMC7721-GFP和CD133--SMMC7721-GFP細(xì)胞；
(2)24小時(shí)后，按流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的常規(guī)方法分別收集細(xì)胞、保存、送檢。
結(jié)果如圖7顯示，分選的CD133-(a上)細(xì)胞與CD133+(a下)細(xì)胞相比對(duì)腫瘤壞死因子(TNFα)的細(xì)胞周期阻滯作用敏感，CD133+細(xì)胞的細(xì)胞周期幾乎不受TNFα影響，CD133-細(xì)胞主要阻滯于G1期。
同上處理的細(xì)胞用PI的核DNA染色，通過DNA含量分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示分選的CD133-(b上)細(xì)胞與CD133+(b下)細(xì)胞相比對(duì)腫瘤壞死因子(TNFα)引起的細(xì)胞凋亡作用較敏感，而CD133+細(xì)胞對(duì)TNFα誘導(dǎo)凋亡有約11％的抵抗作用。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種從肝癌細(xì)胞系中獲得肝癌干細(xì)胞的分離方法，其特征在于，包括步驟(a)將CD133/1單克隆抗體(也稱為AC133單克隆抗體)與含肝癌干細(xì)胞的肝癌細(xì)胞系混合，形成“CD133/1單克隆抗體-肝癌干細(xì)胞”二元復(fù)合物；(b)離心去除未結(jié)合的游離的CD133/1單克隆抗體，形成含“CD133/1單克隆抗體-肝癌干細(xì)胞”二元復(fù)合物的沉淀物；(c)使步驟(b)的沉淀物懸浮，并與磁珠標(biāo)記的抗小鼠IgG1第二抗體混合，形成“第二抗體-CD133/1單克隆抗體-肝癌干細(xì)胞”三元復(fù)合物；(d)用磁場(chǎng)分離步驟(c)中形成的三元復(fù)合物，從而獲得肝癌干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述的肝癌細(xì)胞系和肝癌干細(xì)胞來自人。
3.所述的含肝癌干細(xì)胞的肝癌細(xì)胞系選自下組(a)SMMC7721，(b)BEL7402，(c)Huh-7，(d)Hep3B，(e)MHCC-LM3，(f)MHCC-97L。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法得到的肝癌干細(xì)胞，其特征在于，是人肝癌干細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求3所述的肝癌干細(xì)胞，其特征在于，在體內(nèi)或體外能分化為肝細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求3所述的肝癌干細(xì)胞，其特征在于，能形成腫瘤。
7.如權(quán)利要求3所述的肝癌干細(xì)胞，其特征在于，對(duì)腫瘤壞死因子誘發(fā)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯有抵抗作用。
8.一種如權(quán)利要求3所述的肝癌干細(xì)胞在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.一種如權(quán)利要求3所述的肝癌干細(xì)胞在制備診斷和治療肝癌干細(xì)胞特異性單克隆抗體中的應(yīng)用。
10.一種篩選抑制肝癌干細(xì)胞生長的抑制劑的方法，其特征在于，包括步驟(a)在測(cè)試組中，向肝癌干細(xì)胞培養(yǎng)物中添加待篩選的候選物，并檢測(cè)肝癌干細(xì)胞的增殖情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中肝癌干細(xì)胞的增殖情況與未添加候選物的對(duì)照組中肝癌干細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中的肝癌干細(xì)胞的增殖在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選明顯低于)對(duì)照組，就表明該候選物是抑制肝癌干細(xì)胞生長的化合物。
全文摘要
本發(fā)明是一種肝癌干細(xì)胞及其分離方法和用途，涉及干細(xì)胞，尤其涉及一種人肝癌干細(xì)胞。本發(fā)明的目的就是提供一種分離得到肝癌干細(xì)胞的方法，并且將所分離得到的肝癌干細(xì)胞用于重要的有效抗癌藥物或藥靶篩選，用于肝癌診斷/治療雙功能特異性單克隆抗體制備。所述的從肝癌干細(xì)胞系中獲得肝癌干細(xì)胞的分離方法，是用特異性的AC133/CD133/1單克隆抗體和磁珠分選、富集肝癌干細(xì)胞，所分離得到的CD13文檔編號(hào)A61P35/00GK1940062SQ20051003008
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月28日
發(fā)明者李錦軍, 葛超, 顧健人 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所