專利名稱：使用cd2－結合劑調節(jié)記憶效應t－細胞的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用CD2/LFA-3相互作用的抑劑治療哺乳動物包括人類的疾病，該疾病以存在激活的T細胞為特征。這類疾病包括炎性腸病，牛皮癬性關節(jié)炎，類風濕性關節(jié)炎，以及多發(fā)性硬化。
本發(fā)明背景抗原呈遞細胞(APC)在細胞表面表達高密度的Ⅱ類組織相容性復合體(MHC)。MHC-Ⅱ類分子與胞吞的抗原衍生的肽結合，并主要由輔助性T淋巴細胞識別。T細胞上的T細胞受體識別抗原為結合在MHC編碼的細胞表面分子上的肽片段(Springer，“免疫系統(tǒng)的粘著受體”，自然(Nature),346,pp.425-27(1990))。
除了T細胞受體/MHC相互作用之外，表達在這種APC表面和T細胞表面的分子之間還有很多相互作用。這些表面分子，常稱為粘附分子，參與多種功能包括細胞粘附，抗原識別，T細胞激活中的共-刺激信號傳遞以及刺激T細胞細胞毒性效應器(“在炎性疾病的診斷和治療中的粘著分子”，The Lancet,336,pp.1351-52(1990))。這些細胞粘附看來在免疫反應的產生中參與激活T細胞的增殖(Hughes etal.，“作為T-細胞功能的調節(jié)劑的內皮細胞”，免疫學綜述(Immunol.Rev.),117,pp.85-102(1990))。
激活T細胞的一種方式是將其抗原特異性T細胞受體與諸如巨噬細胞的抗原呈遞細胞表面的肽-MHC復合體結合。T細胞的活化刺激兩類功能性T細胞增殖和分化輔助性細胞，它促進產生抗體的B淋巴細胞的增殖和成熟，以及殺傷細胞，它裂解靶細胞(Bierer等，“LFA-3的單克隆抗體，CD2配體，特異性固定主要組織相容性復合體蛋白”，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)19:pp.661-65(1989)；Springer“免疫系統(tǒng)的粘著受體”，Nature,346,pp.425-34(1990))。
有許多以不正常免疫反應為特征的疾病，并且其中有很多特別地具有增強的T細胞活化的特征。T細胞通過與靶和抗原呈遞細胞相互作用在免疫反應中起重要作用。例如，T細胞介導的殺死靶細胞是多步驟的過程，包括起始的細胞裂解性T細胞(效應器細胞)對靶細胞的粘附。而且，輔助性T細胞通過粘附抗原呈遞細胞起始免疫反應。
T細胞的這些與靶和抗原呈遞細胞的相互作用是高度專一的并且依賴于T細胞表面的多種特異性抗原受體對靶或APC表面的抗原的識別。
T細胞和其它細胞的受體-抗原相互作用也受到多種T細胞表面蛋白質的促進，例如抗原-受體復合體CD3和輔助性粘附分子諸如CD4,LFA-1,CD8,和CD2。它也受到表達于靶或抗原呈遞細胞表面的輔助性粘附分子諸如LFA3,ICAM-I和MHC的促進。例如，LFA-I和其對應受體ICAM-I或ICAM-2，以及CD2和其對應受體LFA-3與細胞粘附和T細胞活化有關。已經知道LFA-I/ICAM和CD2/LFA-3相互作用是獨立的。許多出現在其它T細胞上的其它分子亦與T細胞粘附有關，包括E2(MIC2),VLA-4(CD49d),CD44(Hermes,Pgp-1,ECMRⅢ),以及H19(N4)(參看Maggoba等，“CD2-LFA3和LFA-1-ICAM途徑有關T-細胞識別”，今日免疫學(Immunol,Today),10,pp.417-22(1989))。
在激活T細胞活性方面，對CD2和LFA-3之間的相互作用知之甚少。最近的研究提示CD2(一種T細胞粘附分子)和LFA-3(一種靶細胞和APC粘附分子)之間有特異性相互作用，介導了T細胞對靶或抗原呈遞細胞的粘附。這種細胞-細胞粘附與起始T細胞功能反應有關(Dustin等，“純化的淋巴細胞功能相關的抗原3結合CD2并介導T淋巴細胞粘著”實驗醫(yī)學雜志(J.Ex-p.Med.),165,pp.677-92(987)；Springer et al.，“淋巴細胞功能相關的LFA-1,CD2和LFA-3分子免疫系統(tǒng)的細胞粘著受體”，免疫學年鑒(Ann.Rev.Immunol.),5,pp.223-52(1987))。
發(fā)現于多種細胞包括人紅血細胞表面的LFA-3成為相當多項研究的對象，目的是進一步闡明它在多種T細胞相互作用中功能(參看例如，Krensky等，“LFA-1,LFA-2和LFA-3的功能重要性，分布和結構與CTL-靶相互作用相關的細胞表面抗原”，免疫學雜志(J.Immunol.),131(2),pp.611-16(1983):Shaw等，“人細胞毒性T-細胞克隆所用的兩種抗原獨立性粘著途徑”，Nature,323,pp.262-64(1986))。
已經確定了兩種天然形式的LFA-3。一種形式的LFA-3(“跨膜LFA-3”)通過一個跨膜疏水結構域固定在細胞膜。已經克隆了這種形式的LFA-3的cDNA并測定了序列《參看例如，Wallner等，“淋巴細胞功能相關的抗原-3(LFA-3)的一級結構”，J.Exp.Med.,166,pp.923-32(1987))。另一種形式的LFA-3通過共價鍵連接到含磷脂酰肌醇(“PⅠ”)的糖脂上固定在細胞膜。這后一種形式命名為“連接PⅠ的LFA-3，”亦克隆了這種形式的LFA-3的cDNA并測定了序列(Wallner等，PCT Pub.WO 90/02181)。
人類CD2分子是一個50kD的表面糖蛋白，表達在＞95％的胸腺細胞和實際上所有的外周淋巴細胞。使用特異性單克隆抗體進行的生化測定提示CD2是T譜系特異的并以數種不同的糖基化形式存在于細胞表面(Howard等，“由阻斷E-玫瑰花結形成的單抗定義的人T淋巴細胞區(qū)分標記”，J.Immunol.,126,pp.2117-22(1981)；Brown等，白細胞Ⅲ型，McMichael編，Oxford University Press,pp.110-12(1987)；Sayre等，“TII cDNA的分子克隆和表達提示人T淋巴細胞上的受體樣結構”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),84,pp.2941-45(1987))。
已經報道了人類CD2基因的序列(Seed and Aruffo，“通過快速免疫選擇過程的CD2抗原，T-細胞紅細胞受體的分子克隆”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,pp.3365-69(1987)；Sayre等，“T11cDNA的分子克隆和表達揭示人T淋巴細胞的受體樣結構”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,pp.2941-45(1987))。CD2的cDNA克隆預測有一段24個氨基酸殘基的信號肽，一段185個殘基的胞外片段，一段25個殘基的跨膜結構域和一段117個殘基的細胞質區(qū)域(Sayre等，(1987)；Sewell等，“人T-淋巴細胞表面CD2(T11)抗原的分子克隆”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,pp.8718-22(1986)；Seed and Aruffo，同上(1987)；Clayton等，Eur.J.Immun.,17,pp.1367-70(1987))。已經報道了含有LFA-3結合結構域的溶解性CD2多肽(PCT Publn.WO 90/08187)。亦報道了CD2的單克隆抗體，例如TS2/18,T111,T112,T113以及LFA3的單克隆抗體例如TS2/9(參看例如，Hughes等，“作為T-細胞功能的調節(jié)劑的內皮細胞”，Immunol,Reviews,117,pp.85-102(1990)；Meuer，“T-細胞活化的另一途徑50KD T11綿羊紅細胞受體蛋白的功能性作用”，細胞(Cell),36,pp.897-906(1984))。
抗原特異性T細胞受體與抗原呈遞細胞表面的肽-復合體的結合也涉及通常在需要接觸抗原的適應性免疫反應中形成的所謂“記憶”細胞的形成以及抗原-特異性記憶細胞的擴展。T-細胞記憶可能依賴于抗原的重復刺激。記憶性T-細胞通過增加CD2,LFA-3和其它輔助性粘附分子的表達增強它們對抗原呈遞細胞的結合親和力。實際上，白細胞抗原CD45R同工型的一個重要表型改變使得可以區(qū)分表達CD45R的天然T細胞和與低分子量形式的CD45RO反應的記憶性T細胞。
意識到多數，如果不是全部，記憶細胞受到抗原的重復轟擊，那么很可能多數與CD45RO亞群相關的特征實際上體現了效應T細胞。有不斷增加和引起興趣的文獻描述了CD45RO記憶效應T細胞與現存的多種炎性疾病的關系，諸如炎性腸病，包括局限性回腸炎和潰瘍性結腸炎，(Horiuchi等，J.Japan.Soc.Colo.Protol.,45:391-393(1992))；牛皮癬性關節(jié)炎(Veale等，風濕病年鑒(Ann.Rheum.Dis.)53:450-454(1994))，類風濕性關節(jié)炎(Muller等，自身免疫(Autoimmunity)14；37-43(1992))；眼色素層炎(Ohta等，(Curr.Eye Res.),15:299-306(1996))；腎炎(Rodruguez-Poerez等，美國腎病雜志(Am.J.Nephorl.).15:386-391(1995))；以及多發(fā)性硬化(Crucian等，臨床診斷實驗免疫學(Clin.Diag.Lab.Immunol.),2:249-252(1995),Lehmann等，臨床免疫學免疫病理學(Clin.Immuno1.Immunopathol.),85:202-209(1997),Muller等，Autoimmunity 14:37-43(1992),Qin等，臨床免疫學雜志(J.Clin.Immunol.),13:152-161(1993))。
由于這些記憶效應T淋巴細胞在發(fā)病機制中的可能作用，因而存在著調節(jié)這類疾病的病人中的此類細胞的改進的方法的需要。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種預防和治療疾病的方法，該類疾病的特征是記憶效應T淋巴細胞浸潤到哺乳動物的器官中。在該方法中，將CD2結合劑給藥，其能夠調節(jié)記憶效應T淋巴細胞的數量和/或分布。有很多原因使本發(fā)明方法在治療這類疾病時比先前存在的方法優(yōu)越，包括本方法更具選擇性，從而比先前存在的治療方法更少免疫抑制性，具有更小的一般毒性。
依據本發(fā)明的方法，可以使用的物質包括任何CD2結合劑的分子。這包括調節(jié)CD2/LFA-3相互作用的分子或其它化學實體。優(yōu)選地，該劑選自抗-LFA-3抗體同系物，抗-CD2-抗體同系物，可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，CD2或LFA-3模擬劑(諸如小有機分子)及其衍生物。
本發(fā)明一方面是一種選擇性調節(jié)病人體內記憶效應T淋巴細胞的方法，該方法包括向病人給予有效量的CD2結合劑。在個體中記憶T淋巴細胞可能浸潤靶器官。優(yōu)選地，記憶效應T淋巴細胞是CD45RO T淋巴細胞。CD2結合劑選自抗-LFA-3抗體同系物，抗-CD2-抗體同系物，可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，CD2模擬劑，以及LFA-3模擬劑。本發(fā)明的另一種方法涉及治療特征為記憶效應T淋巴細胞與發(fā)病機制有關的病人疾病，該方法包括向病人給予有效量的CD2結合劑。該類疾病選自牛皮癬性關節(jié)炎，類風濕性關節(jié)炎，多發(fā)性硬化，特應性皮炎，眼色素層炎，炎性腸病，局限性回腸炎，潰瘍性結腸炎，以及皮膚T細胞淋巴瘤。
本發(fā)明的又一方法是調節(jié)哺乳動物中記憶效應T淋巴細胞的一種方法，其中的哺乳動物特征是記憶效應T淋巴細胞浸潤到哺乳動物的器官。該方法包括向哺乳動物給予在上述器官中足以選擇性調節(jié)該器官中記憶效應T淋巴細胞的CD2結合劑。哺乳動物患有選自牛皮癬性關節(jié)炎，類風濕性關節(jié)炎，多發(fā)性硬化，特應性皮炎，眼色素層炎，炎性腸病，局限性回腸炎，潰瘍性結腸炎，以及皮膚T細胞淋巴瘤的疾病。
本發(fā)明的組合物含有一種群的獲自患病哺乳動物的記憶效應T淋巴細胞，該哺乳動物疾病特征是有記憶效應T淋巴細胞浸潤到哺乳動物的器官中，其中的該種群與CD2結合劑聯(lián)合。
附圖的簡要描述

圖1圖示在牛皮癬病人接受CD2結合劑LFA3-TIP治療后記憶效應T細胞相對于自然(T細胞的選擇性降低。X軸上方的水平框代表治療持續(xù)時間，在大約80天時停止。曲線代表在各治療組中57位病人的平均淋巴細胞計數。對于記憶T細胞(CD45 RO+)是統(tǒng)計上顯著的治療和時間效應，對原初T細胞(CD45 RO+)則不是。在80天的給藥時期，不同CD2結合劑治療中T細胞計數均顯示降低，達到某種相對恒定的值。在治療終止后，記憶效應T細胞計數開始回復。
本發(fā)明的詳細描述定義此處使用的“效應T淋巴細胞”，“效應T細胞”，“記憶效應T淋巴細胞/細胞”以及類似術語交互使用，意思是已經暴露于抗原的T淋巴細胞(即那些非“原初(naive)”的)。更特異地，該術語是指與“自然”的CD45RA T淋巴細胞相對的CD45RO T淋巴細胞。
此處使用的“CD2”意思是與天然存在的LFA-3多肽結合的CD2多肽，它由(a)天然存在的哺乳動物CD2的DNA序列(如序列5)；(b)與天然存在的CD2的DNA序列簡并的DNA；或(c)在相當于Tm值以下大約20℃至27℃的和1M氯化鈉的條件下與上述任何一段DNA序列雜交的DNA序列編碼。
此處使用的“LFA-3”意思是與天然存在的CD2多肽結合的LFA-3多肽，它由(a)天然存在的哺乳動物LFA-3的DNA序列(即序列1或序列3)；(b)與天然存在的LFA-3的DNA序列簡并的DNA；或(c)在如下的標準雜交條件下與上述任何一段DNA序列雜交的DNA序列編碼。
此處使用的“CD2結合劑”是一種分子，或化合物，或其它化學實體，它能調節(jié)CD2/LFA-3相互作用和/或調節(jié)CD2信號傳遞(signaling)。該術語包括抗-LFA-3抗體同系物，抗-CD2-抗體同系物，可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，CD2或LFA-3模擬劑及其衍生物。雖然定義中未排除這種強度和/或結合能力的增加，術語“調節(jié)”的意思是CD2結合劑改變(優(yōu)選地是降低)CD2信號傳遞的強度和/或干涉CD2與LFA3的結合。CD2結合劑亦“調節(jié)”記憶效應T淋巴細胞(即CD45RO)且在上下文中術語“調節(jié)”意思是結合劑將改變接受了CD2結合劑的個體中記憶效應T淋巴細胞的數量和/或分布。在優(yōu)選的方法中，結合劑將“選擇性”調節(jié)這種記憶效應T淋巴細胞，意思是與原初T淋巴細胞(例如CD45RA T淋巴細胞)相比調節(jié)了記憶效應T淋巴細胞。
此處使用的“可溶性LFA-3多肽”或“可溶性CD2多肽”是不能將其自身錨定在膜上的LFA-3或CD2多肽。這類可溶性多肽包括例如缺乏足夠的跨膜結構域部分來錨定該多肽或修飾使其跨膜結構域失去功能的CD2和LFA-3多肽。此處使用的LFA-3多肽包括全長或截短的(例如有內部缺失)PⅠ-連接的LFA-3。
此處使用的“抗體同系物”是一種蛋白質，含有選自免疫球蛋白輕鏈，免疫球蛋白重鏈及其抗原-結合片段中的一種或幾種多肽，其能夠結合一種或多種抗原。由超過一個多肽構成的抗體同系物的多肽組分可任選地由二硫鍵或其它共價交聯(lián)。相應地，抗體同系物包括完整的IgA,IgG,IgE,IgD,IgM型(及其亞型)免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是κ型或λ型?？贵w同系物還包括保持抗原結合特異性的完整免疫球蛋白的部分，例如Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，F(v)片段，重鏈單體或雙體，輕鏈單體或雙體，由一個重鏈和一個輕鏈組成的雙體，及其類似物。
此處使用的“人源化重組抗體同系物”是一種抗體同系物，通過重組DNA技術產生，其中抗原結合不需要的人免疫球蛋白輕或重鏈的部分或所有氨基酸取代非人哺乳動物免疫球蛋白輕或重鏈的相應氨基酸。
此處使用的“嵌合重組抗體同系物”是一種抗體同系物，通過重組DNA技術產生，其中免疫球蛋白輕鏈，重鏈或兩者的鉸鏈和恒定區(qū)所有或部分取代另一免疫球蛋白輕鏈或重鏈的相應區(qū)域。
本發(fā)明的方法可用于任何哺乳動物，優(yōu)選地用于人。
“氨基酸”-肽，多肽，或蛋白質單體。在天然存在的肽，多肽，或蛋白質中發(fā)現了20種氨基酸，均為L-異構體。該術語還包括氨基酸的類似物和蛋白質氨基酸的D-異構體及其類似物。
“蛋白質”-基本上含有來自20種氨基酸的任何氨基酸的聚合物。雖然“多肽”常用于指相對較大的多肽，而“肽”常用于指相對較小的多肽，本領域使用這些術語是有交叉的和可變的。除非特別說明，此處使用的術語“蛋白質”是指肽，蛋白質和多肽。
“融合”-是指使用編碼蛋白的多核苷酸的遺傳表達或蛋白質合成方法將兩個或多個蛋白質或其片段通過各自的肽骨架共線性連接。優(yōu)選地，蛋白質或其片段是不同來源的。這樣，優(yōu)選的融合蛋白包括一種CD2結合劑，它是共價連接到是不同的CD2結合劑或根本不是CD2結合劑的第二個組分的蛋白或片段。特別地，“CD2結合劑蛋白質/Ig融合體”是一種連接到免疫球蛋白鏈N-末端的含有本發(fā)明CD2結合劑的蛋白質，或其片段，其中免疫球蛋白的N-末端的一部分被CD2結合劑取代。
“突變體”-生物的遺傳物質的任何變化，特別是野生型多核苷酸序列的任何變化(即缺失，取代，插入或變更)或野生型蛋白質的任何變化。
“標準雜交條件”-雜交和洗滌的鹽和溫度條件，基本上均對應于0.5×SSC至大約5×SSC和65℃。此處使用的術語“標準雜交條件”因而是一種操作定義并包括一定范圍的雜交條件。高嚴緊的條件可以是例如包括，在噬斑篩選緩沖液雜交(0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％Ficoll 400；0.2％牛血清白蛋白，50mM Tris-鹽酸(pH7.5))；1M氯化鈉；0.1％焦磷酸鈉；1％SDS)；10％葡聚糖硫酸酯和100微克/毫升變性的超聲波處理的鮭精DNA，在65℃保持12-20小時，并在65℃下75mM氯化鈉/7.5mM檸檬酸鈉(0.5×SSC)/1％SDS洗滌。低嚴緊的條件可以是例如包括，在噬斑篩選緩沖液雜交，10％葡聚糖硫酸酯和110微克/毫升變性的超聲波處理的鮭精DNA，在55℃保持12-20小時，并在55℃下300mM氯化鈉/30mM檸檬酸鈉(2.0×SSC)/1％SDS洗滌。亦可參看分子生物學現代方法(Current Protocols inMolecular Biology),John Wiley&Sons,Inc.New York,Section6.3.1-6.3.6,(1989)。
“表達控制序列”-當可操作的連接到基因后能夠控制和調節(jié)基因表達的多核苷酸序列。
“可操作連接”-當表達控制序列控制和調節(jié)多核苷酸序列的轉錄和翻譯時，該多核苷酸序列(DNA,RNA)即為可操作連接到表達控制序列。術語“可操作連接”包括在要表達的多核苷酸序列前面有合適的起始信號(例如ATG)和保持正確的閱讀框架，從而使多核苷酸序列的表達在表達控制序列的控制下并產生多核苷酸序列編碼的目的多肽。
“表達載體”-諸如DNA質?；蚴删w(選自通用例子之中)的多核苷酸，在表達載體引入宿主細胞后，能夠至少表達一個基因。載體能在或不能在細胞中復制。
“分離的”(與“基本純化的”交互使用)-當指核酸，即編碼多肽的多核苷酸序列時，意思是RNA或DNA多核苷酸，基因組多核苷酸的一部分，cDNA或合成的多核苷酸，根據其來源或操作，它們(ⅰ)不與其天然相連接的所有多核苷酸相連(例如在宿主細胞中作為表達載體或部分存在)；或(ⅱ)同非其天然相連的核苷酸或其它化學組分連接；或(ⅲ)非天然存在的。“分離的”進一步意味著多核苷酸序列是(ⅰ)通過例如聚合酶鏈式反應(PCR)體外擴增的；(ⅱ)化學合成的；(ⅲ)通過克隆重組產生的；或(ⅳ)諸如通過切割和凝膠分離純化的。
因此，“基本上純的核酸”是非與其衍生的生物體的天然基因組中正常鄰連的一個或兩個編碼序列緊密鄰接的核酸。
“分離的”(與“基本純化的”交互使用)-當指多肽時，意思是多肽或其部分，其根據其來源或操作，是(ⅰ)宿主細胞中一部分表達載體的產物；或(ⅱ)同非其天然相連的蛋白質或其它化學實體相連；(ⅲ)非天然存在的?！胺蛛x的”進一步指一種蛋白質，其是(ⅰ)化學合成的；或(ⅱ)在宿主細胞中表達并從相關蛋白質中純化出來。該術語通常意思是從其它天然的蛋白質和核酸中分離出的多肽。優(yōu)選地，該多肽亦從用于純化它的諸如抗體或凝膠基質(聚丙烯酰胺)等物質中分離出來。
“異源啟動子”-此處用作與一個基因或純化的核酸非天然結合的啟動子。
“同源的”-此處用作術語“同一性”的同義詞并且是指兩個多肽，分子或兩個核酸之間的序列類似性。當由相同的堿基或氨基酸單體占有兩個比較的序列的同一個位置時(例如，兩個DNA分子的同一個位置是腺嘌呤，或兩個多肽的同一位置是賴氨酸)，則相應分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源百分數是兩個序列匹配或同源位置的數目除以比較的位置的數目的函數×100。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個是匹配或同源的，則兩個序列是60％同源的。舉例說明，DNA序列CTGACT和CAGGTT有50％同源性(總共6個位置中的3個是匹配的)。通常，將兩個序列比對以給出最大的同源性進行比較。這種比對可以使用例如Needleman et al.,J.Mol Biol.48:443-453(1970)的方法，可方便的通過諸如Align程序(DNAstar,Inc.)來完成。同源序列有共同或類似的氨基酸殘基，其中類似的殘基保守取代或是“允許的點突變”對比的參考序列中的相應氨基酸殘基。在這一方面，參考序列中殘基的“保守取代”是那些物理上或功能上類似于相應參考殘基的取代，例如具有類似的大小，形狀，電荷，化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵，等等。特別優(yōu)選的是符合Dayhoff et al,5:Atlasof Protein Sequence and Structure,5:Suppl.3,chapter 22:354-352,Nat.Biomed.Res.Foundation,Washington,D.C.(1978)中定義的“可接受點突變”標準的保守取代?！巴葱浴焙汀巴恍浴备髯灾竷蓚€多肽序列的序列相似性，同一性是更嚴格的比較。同源性和等同可分別通過為了比較的目的比較各序列中可能對齊的位置來確定。當比較的序列中的一個位置被相同的氨基酸殘基占有時，則多肽在該位置是等同的；當相應位點被同一氨基酸(例如相同的)或類似氨基酸(例如立體和/或電性性質類似)，則分子在該位置是同源的。序列間同源或等同的百分數是序列間匹配或同源的位置的數目的函數。一個“不相關的”或“不同源的”序列與本發(fā)明AR序列有少于40％的相同性，盡管優(yōu)選少于25％相同性。
可以使用不同的對比算法和/或程序，包括FASTA,BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST是GCG序列分析軟件包(Universiyt ofWisconsin,Madison,Wis.)的一部分，可使用缺省值運行。ENTREZ可通過Bethesda,Md的國家健康研究所，國家醫(yī)學圖書館，生物技術信息國家中心(National Center of Biotechnology Information,National Library of Medicine,National Institute of Health,Bethesda,Md)獲得。在一個實施方案中，通過GCG程序確定兩個序列的等同的百分數，缺口(gap)的權重為1，即每個缺口的權重相當于兩個序列間一個氨基酸或核苷酸不匹配。
此處的術語“肽”，“蛋白質”和“多肽”交互使用。此處的術語“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”亦交互使用。
如果本發(fā)明的分子的量對治療的特定疾病產生結果或有影響，則是“有效量”。
“多聚物”是由許多叫做“單體”的小結構單元構建的大分子，通過任何可能的模式連接。只使用一種單體構建大分子時，產物叫做“同聚物”，與“多聚物”交互使用。如果一個鏈由超過一個的不同單體組成，該物質通常稱為“雜聚物”。連接CD2結合劑或片段或變體的多聚物組分優(yōu)選地是聚二醇多聚物，但可使用任何多聚物骨架，最優(yōu)選的是那些水溶性的，無毒的和非免疫原性的。
如非另有說明，本發(fā)明的實踐將運用細胞生物學，細胞培養(yǎng)，分子生物學，微生物學，重組DNA，蛋白質化學和免疫學常規(guī)方法，均在本領域技術范圍內。這些技術在文獻中有描述。參看例如，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版(Sambrook,Fritsch and Maniatis,eds),Cold Spring HarborLaboratory Press,1989；DNA克隆(DNA Cloning)，卷Ⅰ和卷Ⅱ(D.N.Glover,ed),1985；多核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait,ed.),1984；U.S.Patent No.4,683,195(Mullis etal.,)；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames andS.J.Higgins,eds.),1984；轉錄和翻譯(Transcription andTranslation)(B.D.Hames and S.J.Higgins,eds.),1984；動物細胞培養(yǎng)(Culture of Animal Cells)(R.I.Freshney,ed).AlanR.Liss,Inc.,1987；固定化細胞和酶(Immobilized Cells andEnzymes),IRL Press,1986；分子克隆實用指南(A Practical Guideto Molecular Cloning)(B.Perbal),1984；酶學方法(Methods inEnzymology),Volumes 154 and 155(Wu etal.,eds),Academic Press,New York；哺乳動物基因轉移載體(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)(J.H.Miller and M.P.Calos,eds.),1987,ColdSpring Harbor Laboratory；細胞和分子生物學免疫化學方法(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology)(Mayerand Walker,eds.),Academic Press,London,1987；實驗免疫學手冊(Handbook of Experiment Immunology),Volumes Ⅰ-Ⅳ(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.),1986；小鼠胚胎操作(Manipulating the Mouse Embryo),Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1986。
由于不想被理論束縛，申請人相信依據本發(fā)明的方法使用CD2結合劑能夠預防和治療性治療上述疾病，因為它們或調節(jié)LFA3/CD2相互作用和/或調節(jié)CD2信號傳遞，其中的一個結果是抑制T細胞增殖和活化，更特別的是調節(jié)記憶效應T淋巴細胞的數目和分布。
申請人相信此處討論的疾病的負面效應是由于這類T細胞的增殖和活化。申請人相信由于多種原因本發(fā)明的方法優(yōu)于先前治療這類疾病的療法，包括抑制呈遞的所有抗原的抗原特異性相互作用，抑制T細胞活化，沒有一般的免疫抑制和可能引發(fā)耐受性。特別地，申請人相信，使用本發(fā)明的方法將能夠實際上在損傷起始階段更特異的靶向治療T細胞，而不影響多形核白細胞或巨噬細胞介導的效應器機制。相應地，與使用類固醇或其它一般免疫抑劑相比病人更不易感染。因而，此處提供的抑制T細胞活化的方法對這類皮膚疾病可以預防和治療。
CD2結合劑本發(fā)明使用的CD2結合劑有其卓越特征，能夠調節(jié)CD2信號傳遞和調節(jié)優(yōu)選是抑制CD2/LFA-3相互作用。給出的CD2結合劑可能同時具有這兩種功能。這類劑包括抗-LFA-3抗體同系物，抗-CD2-抗體同系物，可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，LFA-3和CD2模擬劑及其衍生物。優(yōu)選的CD2結合劑是可溶性CD2和LFA-3多肽，抗-CD2-抗體同系物，以及LFA-3和CD2模擬劑。
可以通過例如檢測它們調節(jié)LFA-3/CD2相互作用的能力來確認本發(fā)明方法中特定可溶性CD2多肽，可溶性LFA-3多肽，抗-LFA-3抗體同系物，抗-CD2-抗體同系物或LFA-3和CD2模擬劑的用途。這種能力可通過例如使用簡單的細胞結合檢驗進行測定，該檢驗能夠可視的(在放大后)評價推定的CD2結合劑抑制LFA-3和CD2在承載這種分子的細胞上的相互作用。Jurkat細胞是優(yōu)選的CD2+底物，綿羊紅血細胞或人JY細胞是優(yōu)選的LA-3+底物?？梢允褂枚喾N已知的方法檢測在本發(fā)明中有用的溶解性多肽，抗體同系物和模擬劑的結合特性，例如如果合適的話，放射性標記抗體同系物，多肽或藥劑(例如35S或125I)并將標記的多肽，模擬物或抗體同系物與LFA-3+細胞的CD2+接觸。也可使用合適的酶標記第二抗體檢測結合特性。還可使用Seed等(Proc.Natl.Acad.Sci.UA,84,pp.3365-69(1987))描述的玫瑰花結競爭檢測方法。
A．抗-LFA-3和抗-CD2抗體同系物許多類型的抗-LFA-3和抗-CD2抗體同系物可用于本發(fā)明的方法。它們包括單克隆抗體，重組抗體。嵌合重組抗體，人源化重組抗體，及其抗原結合部分。
在抗-LFA-3抗體同系物中，優(yōu)選的使用單克隆抗-LFA-3抗體。更優(yōu)選地，使用選自登記號為ATCC HB 10693(1E6),ATCC HB 10694(HC-1B11),ATCC HB 10695(7A6)和ATCC HB 10696(8B8)的組中的雜交瘤產生的單克隆抗-LFA-3-抗體,或稱為TS2/9的單克隆抗體(Sanchez-Madrid等，“與人T淋巴細胞介導的細胞溶解相關的三種不同抗原LFA-1,LFA-2 and LFA-3”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,pp.7489-93(1982))。最優(yōu)選地，單克隆抗LFA-3-抗體由選自登記號為ATCC HB 10695(7A6)和ATCC HB 10693(1E6)的組中的雜交瘤產生。
在抗-CD2抗體同系物中，優(yōu)選地使用單克隆抗-CD2抗體，諸如稱為T11表位抗體的抗-CD2單克隆抗體，包括TS2/18(Sanchez-Madrid等，“與人T淋巴細胞介導的細胞溶解相關的三種不同抗原LFA-1,LFA-2 and LFA-3”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,pp.7489-93(1982))。
產生單克隆抗體的技術是為人熟知的。簡言之，將無限增殖細胞(典型的是骨髓瘤細胞)與來自哺乳動物的用含有給定抗原的劑免疫的淋巴細胞(典型的是脾細胞)融合，篩選產生的雜交瘤細胞培養(yǎng)物上清液中是否含抗該抗原的抗體。一般可參看Kohler等，自然，“分泌具有預定特異性的抗體的融合細胞的連續(xù)培養(yǎng)”，256,pp.495-97(1975)。對本發(fā)明的目的有用的免疫原包括載有CD2或LFA-3的細胞，以及含有LFA-3,CD2或其反受體-結合的片段(例如結合結合CD2的LFA-3或LFA-3片段的CD2片段)的無細胞劑。
可使用標準程序進免疫。單位劑量和免疫體系依賴于免疫的哺乳動物物種，其免疫狀態(tài)，哺乳動物的體重等等。典型地，從免疫的哺乳動物取血并使用適當的篩選方法檢測各血樣的血清中的特定抗體。例如，通過測定免疫血清阻抑由于細胞表面分別有LFA-3和CD2而產生的綿羊紅血細胞重排Jurkat細胞的能力，可以確定有用的抗-LFA-3-或抗CD2-抗體。用于產生雜交瘤的淋巴細胞典型的從免疫的哺乳動物分離，已經使用這類篩選檢測方法證實該動物的血清有所需的抗體存在。
典型地，無限增殖細胞系(例如骨髓瘤細胞系)與淋巴細胞來自相同的哺乳動物。優(yōu)選的無限增殖細胞系是對含次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)物(“HAT培養(yǎng)基”)敏感的鼠骨髓瘤細胞系。典型地，使用聚乙二醇(“PEG”)3350將HAT-敏感的鼠骨髓瘤細胞與鼠脾細胞融合。然后使用HAT培養(yǎng)基篩選融合產生的雜交瘤細胞，培養(yǎng)基能殺死未融合的細胞和非生產性的融合骨髓瘤細胞(未融合的脾細胞數天后因為未轉化而死亡)。通過篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液的例如結合它們各自的對應受體或阻礙Jurkat細胞粘附到綿羊紅血細胞的能力，測定了產生目的抗體的雜交瘤。為了保證單克隆性，典型的通過有限稀釋亞克隆雜交瘤培養(yǎng)物。
為了產生抗-LFA-3或抗-CD2抗體，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中一定條件下培養(yǎng)上述篩選測定中檢測為陽性的雜交瘤細胞，培養(yǎng)足夠的時間使雜雜交瘤細胞將單克隆抗體分泌到培養(yǎng)物中。組織培養(yǎng)技術和合適的培養(yǎng)基是眾所周知的。通過熟知的技術可以收集符合條件的雜交瘤培養(yǎng)上清液和可任選的進一步純化所需的抗體。
或者，可通過將雜交瘤細胞注射到降植烷致敏小鼠的腹腔產生目的抗體。雜交瘤細胞在腹腔增殖，分泌抗體，抗體積累成為腹水?？墒褂米⑸淦魍ㄟ^從腹腔抽取腹水收獲抗體。
本發(fā)明有用的抗-CD2和抗-LFA-3抗體同系物亦可為重組抗體，它們由使用編碼所需抗體的免疫球蛋白輕和重鏈的DNA轉化的宿主細胞產生?？赏ㄟ^熟知的基因工程技術產生重組抗體。參看例如美國專利號4,816,397，以參考文獻并于此處。例如，通過從產生本發(fā)明中有用的抗體同系物的雜交瘤細胞中克隆編碼目的抗體的免疫球蛋白輕和重鏈cDNA或基因組DNA，可以產生重組抗體。然后將編碼這些多肽的cDNA或基因組DNA插入到表達載體使兩種基因可操作的連接到它們自身的轉錄和翻譯表達控制序列。選擇的表達載體和表達控制序列與使用的表達宿主細胞是相容的。典型地，兩基因均插入到同一表達載體?？梢允褂迷嘶蛘婧怂拗骷毎?yōu)選的在真核細胞中表達，因為這種細胞比原核細胞更可能組裝和分泌正確折疊的和具免疫學活性的抗體。然而，任何由于不正確折疊產生的無活抗體都可能依據熟知的方法進行復性(Kim and Baldwin，“小蛋白的折疊反應中的特異性中間體和蛋白折疊機理”，Ann.Rev.Biochem.,51,pp.459-89(1982))。宿主細胞可能產生完整的抗體的部分，諸如輕鏈雙體或重鏈雙體，依據本發(fā)明它們也是抗體同系物。
可以理解本發(fā)明中對上述程序加以變化是有用的。例如，可能需要使用編碼抗體同系物的輕鏈或重鏈(而不是兩者都)的DNA轉化宿主細胞。亦可使用DNA重組技術除去一些或所有編碼為CD2或LFA-3對應受體結合所不需的輕鏈或重鏈的一個或兩者的DNA。從這種截短的DNA分子表達的分子對本發(fā)明的方法是有用的。此外，可以產生雙功能抗體，其中一個重鏈和一個輕鏈是抗-CD2或抗-LFA-3抗體同系物，另一個重鏈和輕鏈是對非CD2或LFA-3，或CD2或LFA-3的另一種表位的抗原專一的。
用合適的表達載體轉化宿主細胞可以產生嵌合重組抗-LFA-3或抗-CD2抗體同系物，該載體含有編碼目的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA，該DNA中編碼重鏈和/或輕鏈的鉸鏈和恒定區(qū)的所有或部分DNA被來自不同物種的免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的相應區(qū)域的DNA取代。當初始的重組抗體是非人的，而CD2結合劑是要用于人的，用相應的人序列取代是優(yōu)選的。一個嵌合重組抗體的例子中含有小鼠的可變區(qū)和人的鉸鏈和恒定區(qū)。通?？蓞⒖疵绹鴮＠?,816,397和Morrison等，“嵌合的人抗體分子帶有人恒定區(qū)結構域的小鼠抗原結合結構域”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81,pp.6851-55(1984)。使用合適的表達載體轉化宿主細胞可以產生人源化重組體抗-LFA-3或抗-CD2抗體，該載體含有編碼目的非人源免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA，該DNA中編碼與抗原結合無關的氨基酸的所有或部分DNA被來自目的人源免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的相應區(qū)域的DNA取代。通?？蓞⒖?，Jones.，“用來自小鼠的區(qū)域代替人抗體中的互補性決定區(qū)”，Nature,321,pp.522-25(1986)。
不是完整抗體的抗-CD2和抗-LFA-3抗體同系物在本發(fā)明中也是有用的。這種同系物可從上述任何抗體同系物衍生。例如，從上述抗體衍生的抗原結合片段，以及全長的單體，雙體或三體多肽本身是有用的。這種類型的抗體抗體同系物包括Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，F(v)片段，重鏈單體或雙體，輕鏈單體或雙體，一個重鏈和一個輕鏈組成的雙體，等等?？?LFA-3重鏈是優(yōu)選的抗-LFA-3抗體片段。
也可通過化學方法產生抗體片段，例如使用蛋白酶諸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶切割完整的抗體，并可任選的用還原試劑處理切割產物。另一種方法是使用截短的重鏈和/或輕鏈基因轉化的宿主細胞產生有用的片段。使用還原試劑諸如二硫蘇糖醇處理完整抗體，隨后純化分離鏈，可產生重鏈和輕鏈單體。也可使用編碼所需重鏈或輕鏈但非同時編碼兩者的DNA轉化的宿主細胞產生重鏈或輕鏈單體。參看例如，Ward等，“從大腸桿菌分泌的單免疫球蛋白可變區(qū)的所有組成成分的結合活性”，Nature,341,pp.544-46(1989)；Sastry等，“在大腸桿菌中克隆產生單克隆催化性抗體的免疫全部組成成分構建重鏈可變區(qū)一特異性cDNA文庫”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,pp.572832(1989)。
B．可溶性CD2和LFA-3多肽調節(jié)LFA-3和CD2相互作用的可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽在本發(fā)明的方法中是有用的。優(yōu)選的是可溶性LFA-3多肽。
可溶性LFA-3多肽可從LFA-3的跨膜形式衍生，特別是胞外結構域(例如序列2的AA1-AA187)。這類多肽描述于美國專利號4,956,281和美國專利號5,547,853(與本申請有相同的受讓人)，以參考文獻并于此處。優(yōu)選的可溶性LFA-3多肽包括由序列2的AA1-AA92，序列2的AA1-AA80，序列2的AA50-AA65以及序列2的AA20-AA80組成的多肽。含有編碼序列2的氨基酸的DNA序列(序列1)的載體已經保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection),Rockyille,Maryland，登記號是75107。
最優(yōu)選的這種類型的蛋白質是融合蛋白，它含有成熟LFA-3氨基末端的92個氨基酸，含有認為它們參與形成鏈間二硫鍵的兩個半胱氨酸的人IgG1鉸鏈區(qū)的C末端10個氨基酸，人IgGⅠ重鏈恒定結構域的CH2和CH3區(qū)(例如序列8)。這種融合蛋白此處稱為“LFA3TIP”編碼示例的LFA3TIP的質粒pSAB152已經保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection),Rockville,Maryland,登記號是ATCC68720。pSAB152插入片段的DNA序列是序列7。設計這種重組蛋白是為了通過與CD2受體的相互作用調節(jié)免疫反應。融合體的LFA-3部分結合到T淋巴細胞上的CD2受體。IgG1部分結合到FcgammaRⅠ(巨噬細胞)和FcgammaRⅢ(NK細胞和噬中性白細胞)受體。已經顯示LFA3TIP和CD2的相互作用能夠體外抑制T淋巴細胞反應。參看美國專利5,728677和5,547,853。在美國專利5,547,853中描述了本發(fā)明方法中使用的LFA3TIP的產生方法。
通常，使用AMICN SI Y30螺旋柱系統(tǒng)(AMICON,Danvers,Massachusetts)將pSAB15轉染的COS7或CHO細胞的條件培養(yǎng)物濃縮并加樣到蛋白質A-瓊脂糖凝膠4B(Sigma,St.Louis,Missouri)層析柱。洗脫結合的蛋白質并加樣到Superose-12(Phamacia/LKB,Piscataway,New Jersey)凝膠層析柱。將通過SDS-PAGE凝膠和Western印跡檢測(參看例如Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,pp.4350-54(1979)；Antibodies:A Laboratory Manual,pp.474-510(Cold Spring Harbor Laboratory(1988))確定的含LFA3TIP和最少量的雜蛋白質的Superose-12級分混合并在YM30 CENTRCON(AMICON)中濃縮。使用兔抗-LFA-3多克隆抗血清在Western印跡上，隨后通過可檢測的標記的山羊抗-兔IgG檢測到LFA3TI。純化的COS7或CHO細胞的LFA3TIP是兩個單體LFA-3-Ig融合蛋白的雙體，通過二硫鍵連接。
另一個優(yōu)選的融合蛋白由融合到人IgG1鉸鏈CH2和CH3區(qū)域的第一和第二個LFA-3胞外結構域構成，此處稱為LFA3-Ig。
可溶性LFA-3多肽亦可衍生自PⅠ-連接形式的LFA-3，諸如PCT專利申請系列號WO 90/02181中所述。含有編碼PⅠ-連接的LFA-3(即序列3)的DNA序列的載體已經保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection),Rockville,Maryland，登記號是68788。應當理解PⅠ-連接形式的LFA-3和跨膜形式的LFA-3在整個胞外結構域有相同的氨基酸序列。
相應地，優(yōu)選的PⅠ-連接的LFA-3多肽和跨膜形式的LFA-3是相同的。可溶性CD2多肽可以衍生自全長的CD2，特別是胞外結構域(例如序列6的AA1-AA185)。這種多肽可能含有CD2的所有或部分胞外結構域。示例的可溶性CD2多肽描述于PCT WO 90/08187，以參考文獻并于此處。
本發(fā)明中有用的可溶性多肽可通過多種已知方法產生。例如，多肽可通過組合使用特定的內切肽酶和外切肽酶蛋白酶解，Edman降解或兩者結合處理完整的跨膜LFA-3或CD2分子或完整的PⅠ-連接的LFA-3分子衍生出來。隨之可使用常規(guī)方法從天然來源純化完整的LFA-3分子或完整的CD2分子。另一種方法是，通過重組DNA技術使用cDNA產生完整的LFA-3或CD2(參看例如美國專利號4,956,281,Wallner等；Aruffo和Seed,Proc.Natl.Acad.Sci.,84,pp.2941-45(1987)；Sayre等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,pp.2941-45(1987))。
優(yōu)選地，本發(fā)明中可溶性多肽是直接產生的，從而消除了以完整的LFA-3分子或完整的CD2分子作為起始材料的需要。這可以通過常規(guī)化學合成技術或熟知的重組DNA技術完成，其中只有那些編碼所需肽的DNA序列在轉化的宿主中表達。例如，使用寡核苷酸合成儀通過化學方法可以合成編碼所需可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽的基因。這種寡核苷酸是基于所需的可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽的氨基酸序列設計的。通過分離特定的限制性內切核酸酶片段或PCR合成特定區(qū)域可以從全長DNA序列衍生編碼目的肽的特定DNA序列。
可以使用標準方法合成編碼本發(fā)明中有用的可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽的基因。例如，可以使用完整的氨基酸序列構建出反向-翻譯基因?？梢砸徊胶铣珊芯幋a本發(fā)明中有用的可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽的核苷酸序列的DNA寡聚體。另一種方法是，可以合成幾個較小的編碼部分的目的多肽的寡核苷酸然后進行連接。優(yōu)選地，將本發(fā)明中有用的可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽合成為幾個分離的寡核苷酸然后將其連接在一起。各寡核苷酸典型的含有5’或3’突出端進行互補組裝。組裝后，優(yōu)選的基因序列上的特征是，能被限制性內切核酸酶識別(包括單一限制性位點用于直接組裝到克隆或表達載體)，考慮了使用的宿主表達系統(tǒng)的優(yōu)選的密碼子以及轉錄時能夠產生穩(wěn)定的，有效翻譯的MRNA的序列?？梢酝ㄟ^核苷酸測序，限制性圖譜，以及在適當的宿主中表達生物活性多肽等來證實正確的組裝。
本技術領域熟練人員將可意識到，由于遺傳密碼的簡并性，含有許多其它核苷酸序列的DNA分子能夠編碼由上述特定DNA序列編碼的可溶性LFA-3和CD2多肽。這些簡并序列亦編碼本發(fā)明中有用的多肽。
DNA序列可以在單細胞宿主中表達。如本領域人員所熟知，為了獲得在宿主中轉染基因的高表達水平，基因必須可操作的連接到在選擇的表達宿主中有功能的轉錄和翻譯表達控制序列。優(yōu)選地，表達控制序列和感興趣的基因將包含在表達載體中并進一步含有一個細菌選擇標記和復制起點。如果表達宿主是真核細胞，表達載體應當進一步含有附加的在表達宿主中有用的表達標記。編碼所需可溶性多肽的DNA序列可能編碼或不編碼信號序列。如果表達宿主是原核的，通常優(yōu)選的是DNA序列不編碼信號序列。如果表達宿主是真核的，通常優(yōu)選的是編碼信號序列。在表達產物中可能存在或不存在氨基末端甲硫氨酸。若表達載體未切除末端甲硫氨酸，如果需要可以使用標準技術化學法切除。
可以使用多種表達宿主/載體的組合。對真核宿主有用的表達載體包括例如含有來自SV40，牛乳頭瘤病毒，腺病毒和巨細胞病毒的表達控制序列的載體。對細菌宿主有用的表達載體包括已知的細菌質粒，諸如來自E.coli的質粒，包括col E1,PCRⅠ,pBR322,pMB9及其衍生物，廣泛宿主范圍質粒，諸如RP4，噬菌體DNA，例如噬菌體λ的多種衍生物，例如NM989，以及其它DNA噬菌體，諸如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。對酵母細胞有用的表達載體包括2μ質粒及其衍生物。對昆蟲細胞有用的載體包括Pv1941。另外，在這些載體中可以使用多種表達控制序列。這類表達控制序列包括與上述表達載體的結構基因有關的表達控制序列。有用的表達控制序列的例子例如是，SV40或腺病毒的早期和晚期啟動子，lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，TAC或TRC系統(tǒng)，噬菌體λ的主操縱基因和啟動子區(qū)，fd包被蛋白質的控制區(qū)，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，酸性磷酸酶的啟動子，例如Pho5，酵母非-交配(a-mating)系統(tǒng)的啟動子以及已知能控制原核或真核細胞或其病毒的基因的表達的其它序列，及其不同的組合。
多種單細胞宿主細胞是可用的。這些宿主可包括熟知的真核和原核宿主，諸如大腸桿菌，假單胞菌，芽孢桿菌，鏈霉菌，真菌，酵母，昆蟲細胞諸如草地夜蛾細胞(Spodoptera frugiperda(SF9))，動物細胞諸如CHO和小鼠細胞，非洲綠猴細胞諸如COS1,COS7,BSC1,BSC40以及BMT10，以及人細胞，還有組織培養(yǎng)中的植物細胞。對動物細胞表達，我們優(yōu)選C140細胞和COS7細胞。當然，必須理解的是并非所有的載體和表達控制序列均能同樣好的表達此處描述的DNA序列。也不是所有的宿主同樣好的匹配同一表達系統(tǒng)。但是，不需更多實驗，本領域熟練人員可以選擇出載體，表達控制序列和宿主。例如，選擇載體時必須考慮宿主，因為載體必須在其中表達。還要考慮載體的拷貝數，控制該拷貝數的能力，以及載體編碼的任何其它蛋白質的表達，諸如抗生物素標記。
選擇表達控制序列時，要考慮多種因素。包括例如該序列的相對強度，的控制能力，及其與此處討論的DNA序列的相容性，特別是相對于可能的二級結構的相容性。選擇單細胞宿主時，要考慮它們與選擇的載體的相容性，DNA序列編碼產物的毒性，它們的分泌特征，它們正確折疊可溶性多肽的能力，它們的發(fā)酵或培養(yǎng)需求，以及純化DNA序列編碼的產物的難易程度。在這些參數中，本領域熟練人員可能選擇出多種載體/表達控制序列/宿主的組合，該組合可在發(fā)酵或大規(guī)模動物培養(yǎng)中表達所需的DNA序列，例如使用CHO細胞或COS7細胞。
可以使用任何常規(guī)方法從發(fā)酵液或細胞培養(yǎng)物中分離可溶性LFA-3和CD2多肽并純化。本領域熟練人員可任選擇最合適的分離和純化技術。
重組DNA技術是優(yōu)選的產生序列長度大于20氨基酸的有用的可溶性CD2多肽或可溶性LFA-3多肽的方法，而常規(guī)的化學合成技術則是生產序列長度小于20氨基酸的CD2多肽或LFA-3多肽的方法。合成的本發(fā)明有用的多肽具有極高產量的優(yōu)勢，并易于純化。優(yōu)選地，這種可溶性CD2多肽或可溶性LFA-3多肽通過液相或固相多肽合成方法合成并且可任選地，用羧肽酶消化(除掉C末端氨基酸)或通過手工Edman降解來降解(除掉N末端氨基酸)。如Kent在多肽和蛋白質的化學合成Ann.Rev.Biochem.,57,pp.95789(1988))中所述，在易于形成二硫鍵的氧化條件下可獲得多肽的正確折疊。然后使用本領域熟知的分離技術純化產生的多肽，優(yōu)選的使用反向HPLC。使用液相合成的優(yōu)勢是可以向生長的多肽鏈直接添加某種衍生的氨基酸，諸如酪氨酸的O-硫酸酯。這樣避免了對隨后的修飾本發(fā)明有用的多肽的任何殘基的修飾步驟的需要。
C．LFA-3和CD2模擬劑LFA-3和CD2模擬劑在本發(fā)明的方法中也是有用的。這些劑可能是肽，半-肽化合物或非-肽化合物，它們是CD2結合劑能夠調節(jié)CD2信號傳遞(signaling)和/或CD2/LFA-3相互作用。最優(yōu)選的CD2和LFA-3模擬劑至少象抗-LFA3單克隆抗體7A6或抗-CD2單克隆抗體TS2/18(見上面所述)一樣抑制CD2/LFA-3相互作用。這類模擬劑可通過合成多種肽(例如長度為520個基酸)，半-肽化合物或非-肽化合物，有機化合物，然后篩選它們抑制CD2/LFA-3相互作用的能力而產生。一般可參看美國專利號4,833,092,Scott和Smith,“用表位文庫篩選肽配體”，Science,249,pp.386-90(1990),以及Devlin等，“隨機肽文庫特異性蛋白結合分子的來源”，Science,249,pp.40407(1990)，以參考文獻并于此處。
D．衍生的CD2結合劑衍生的CD2結合劑諸如CD2/LFA-3相互作用的調節(jié)劑在本發(fā)明的方法中也是有用的，其中，例如，此處描述的任何抗體同系物，可溶性CD2和LFA-3多肽，或CD2和LFA-3模擬劑功能性連接到(通過化學偶聯(lián)，遺傳融合或其它方式)獨立的選自抗-LFA-3和抗-CD2抗體同系物，可溶性LFA-3和CD2多肽，CD2和LFA-3模擬劑，細胞毒性劑和藥劑的一個或多個成分。一類衍生的CD2結合劑是交聯(lián)兩個或多個CD2結合劑(相同類型或不同類型)產生的。合適的交聯(lián)包括那些異雙功能的，含有被適當的間隔臂分開的兩個不同的反應基團(例如間-順丁烯二酰亞氨苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯)或同雙功能的(例如disuccinimidyl suberate)?？蓮腜ierce Chemical Company,Rockford,Illinois獲得這種接頭。另一種可能的交聯(lián)是利用PⅠ-連接的LFA-3中的PⅠ接頭信號序列或其片段。特定地，將編碼PⅠ連接信號序列(例如序列4的AA162-AA212)的DNA連接到編碼所需多肽優(yōu)選的是可溶性LFA-3多肽的DNA的下游。如果這種構建體在合適的真核細胞中表達，細胞將會識別PⅠ連接信號序列并將PⅠ共價連接到多肽。然后可利用PⅠ的疏水特性來形成多肽的膠束聚集體。
連接到一種或多種細胞毒性或藥物劑的CD2結合劑也是有用的?？捎玫乃幬飫┌ㄉ锘钚噪?，多肽和蛋白質，諸如對人的非CD2或LFA-3的多肽專一的抗體同系物，或其部分?？捎玫乃幬飫┖图毎拘詣┻€包括環(huán)孢霉素A，強的松，FK506，氨甲蝶呤，類固醇，類維生素A，干擾素，和氮芥。
用藥物劑衍生的優(yōu)選CD2結合劑包括重組產生的多肽，其中將可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，或肽基CD2或肽基LFA-3模擬劑融合到所有或部分的免疫球蛋白重鏈鉸鏈區(qū)和所有或部分重鏈恒定區(qū)。用于制備這類融合蛋白的優(yōu)選多肽是可溶性LFA-3多肽。最優(yōu)選的融合蛋白含有LFA-3的AA1-AA92(例如序列2)，其融合到人IgGⅠ鉸鏈區(qū)的一部分(包括鉸鏈區(qū)的C末端10個氨基酸，它含有兩個認為參與形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基)和IgG1重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)域。預期這種融合蛋白顯示延長的血清半壽期和使CD2結合劑二聚化。
亦預期顯示延長的血清半壽期的其它衍生的CD2結合劑是最優(yōu)選的連接到一個或多個多聚物(包括聚(亞烷基)二醇多聚物)的CD2結合劑。預期多聚物選擇性的與CD2結合劑的自由氨基或其它反應基團反應，并且理論上，多聚物的反應可使結合發(fā)生在任何存在的氨基基團，諸如賴氨酸的α氨基或ε氨基，或半胱氨酸的-SH基團。CD2結合劑的自由的羧基，合適的活化羰基，羥基，胍基，氧化的碳氫組分和巰基基團(如果存在)均可作為結合部位。
特別地，如果CD2結合劑是蛋白質，為了保護硫醇而對任何半胱氨酸(例如內部或N-末端半胱氨酸)的化學修飾，伴隨與聚二醇組分(即聚乙二醇或PEG)的綴合，可由本領域熟練人員通過多種方法進行。參看美國專利4,179,337。巰基組分，以硫醇鹽離子作為活性部分，是蛋白質中最活躍的官能基團。有許多試劑與硫醇的反應比對任何其它基團的反應快。參看蛋白質偶合與交聯(lián)的化學(S.S.Wong,CRC Press,Boca Raton,FL,1991)。
其它提供聚二醇和半胱氨酸連接的方法的例子是與α-鹵乙?；衔铮袡C汞劑，二硫化物試劑，以及其它N-取代順丁烯二酰亞胺的反應。這些活性物質的許多衍生物是商品化的(例如，碘乙酸乙酯(Aldrich,Milwaukee WI)，二硫二苯(Aldrich)，以及N-芘順丁烯二酰亞胺(Molecular Probes,Eugene OR))或可以容易的合成(例如，N-烷基碘乙酰胺，N-烷基順丁烯二酰亞胺，以及有機汞劑)。由于沒有簡單的化學策略可以將聚二醇多聚物諸如PEG靶向CD2結合劑，直接的方法是遺傳工程制造一個可用于靶定聚合物部分的位點，諸如使用定點誘變。例如，在蛋白質性質的CD2結合劑的C末端或其附近插入Cys使得可以允許使用順丁烯二酰亞胺，乙烯砜或鹵乙酸-活化的聚(亞烷基)二醇(例如PEG)進行專一修飾?？梢允褂萌魏斡糜趯⑸锘钚晕镔|與惰性多聚物反應的適當方法進行反應。
通常該反應包括制備活化的多聚物(可能至少含有一個末端羥基)，然后使蛋白質與活化的多聚物反應，產生適于用作藥劑的可溶性蛋白。上述修飾反應可通過多種方法實現，包含一個或多個步驟。在本發(fā)明的實踐中，將C1-C4烷基聚二醇的聚二醇殘基，優(yōu)選的是聚乙二醇(PEG)，或這類乙二醇的聚(氧)二醇殘基，有利地引入在感興趣的多聚物系統(tǒng)中。這樣，蛋白質附著的多聚物可以是聚乙二醇(PEG)的同聚物，或者是聚氧乙烯化多烴基化合物，只要聚合物在室溫下溶于水即可。這類多聚物的非限制的例子包括聚環(huán)氧烷同聚物諸如PEG或聚丙二醇，聚氧乙烯化二醇，它們的共聚物以及嵌段共聚物，條件是保持嵌段共聚物的水溶性。
聚氧乙烯化多烴基化合物的例子包括，例如聚氧乙烯化甘油，聚氧乙烯化山梨醇，聚氧乙烯化葡萄糖等。聚氧乙烯化甘油的骨架是以單-，雙，和三甘油酯形式在例如動物和人中天然存在的相同骨架。因此，這種分支無需認為是身體的外源劑。
作為聚環(huán)氧烷的替代物，可以使用基于葡聚糖，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，碳水化合物的多聚物及類似物。此外，可以使用美國專利5,359,030中描述的雜聚物(即由種類超過一種的單體組成的聚合物，諸如共聚物)(例如綴合到含有聚二醇部分和一個或多個脂肪酸的多聚物的蛋白質)。本領域普通技術人員將會認識到前面的列舉只是為了說明并且所有具有此處描述的性質的多聚物材料均在考慮之內。
另外，本發(fā)明的另一個方面，可以使用共價連接到多聚物組分的衍生的CD2結合劑，其中的綴合的性質涉及可以切斷的共價化學鍵。這樣可以根據時間進程控制多聚物從CD2結合劑的切除。共價鍵可以通過化學或酶法反應切除。多聚物-CD2結合劑產品保持可接受量的活性。同時，在綴合多聚物中含有聚二醇部分，賦予多聚物-CD2結合劑綴合物很高的水溶性和延長的血液循環(huán)能力。作為改進特征的結果，本發(fā)明考慮對活性多聚物-CD2結合劑種類的腸胃外的，氣霧劑的，和口服給藥以及在水解切除后CD2結合劑本身在體內應用中的生物利用度。
依據本發(fā)明的藥物組合物和方法本發(fā)明提供了一種預防和治療哺乳動物疾病的優(yōu)選方法，該疾病特征是記憶效應T淋巴細胞浸潤到哺乳動物的一種或多種器官；和/或此類T淋巴細胞與該疾病有關。該方法包括向哺乳動物給藥一種或多種CD2結合劑，諸如CD2/LFA-3相互作用的抑劑，或它們的衍生形式，它們能夠較之于幼稚T淋巴細胞選擇性的調節(jié)記憶效應器淋巴細胞。優(yōu)選的，給藥有效量的CD2結合劑或其衍生物。“有效量”意思是指能夠降低此處描述的疾病的擴展或嚴重程度。
對本領域熟練技術人員顯而易見的是，有效量的CD2結合劑依賴于，其中包括，給藥方式，給藥單位劑量，CD2結合劑是否與其它藥物聯(lián)用，病人的免疫狀況和健康狀況，特定CD2結合劑的治療活性以及血清半壽期。
CD2結合劑或藥物組合物可以是多種形式的。包括例如，固體，半固體和液體劑量形式，諸如片劑，丸劑，粉劑，溶液，散劑或懸劑，脂質體，栓劑，可輸液注射的，以及局部劑。優(yōu)選的形式依賴于想采取的用藥和治療應用的方式。優(yōu)選的形式是可注射或輸液的溶液。CD2結合劑或藥物組合物可以通過灌注，口服，局部用藥或吸入的方法進行靜脈內，肌肉內，皮下，關節(jié)內，鞘內，骨膜，腫瘤內，病灶內，病灶周圍給藥。優(yōu)選的是皮下，肌肉內或靜脈內給藥。最優(yōu)選的是皮下給藥。CD2結合劑可通過口服，頰，腸胃外，直腸，鞘給藥，鼻內吸入噴劑，肺內吸入或其它方式給藥。特別地，根據本發(fā)明的藥劑可制成劑，成為用于吸入的噴劑或粉劑，用于注射(例如皮下，肌肉內，靜脈內，關節(jié)內或腦池內注射)的劑，用于灌注或用于口服給藥的劑，可以是安瓿或片劑的單位劑量形式或多劑量小管或其它容器，有添加的防腐劑。組合物可采取存在于油或水溶液賦形劑中的懸液，溶液或乳濁液或凝膠的形式，并可含有形成劑的藥劑，諸如使懸浮，使穩(wěn)定和/或致散的藥劑。另一種方法是，活性成分是可直接給藥的或使用前與適當的賦形劑(例如無菌，無熱源水，標準鹽或5％葡萄糖)配藥的粉劑和/或凍干形式。
優(yōu)選地，單位劑量以每星期一到三次或每天一到三次給藥。更優(yōu)選地，大約每天給藥一到三次持續(xù)3到7天，或一個月為基礎大約每天給藥一到三次持續(xù)3到7天。但是將可認識到可以使用低或高些的劑量和其它的流程。優(yōu)選地，CD2結合劑以每公斤體重在大約0.001和約50毫克之間的劑量給藥，更優(yōu)選地每公斤體重在約0.01和約10毫克之間給藥，最優(yōu)選地每公斤體重在約0.1和約4毫克之間給藥。
例如，為了向病人給藥本發(fā)明的CD2結合劑(可溶性LFA-3多肽LFA3TIP)，特別優(yōu)選的CD2結合劑是包裝成小管中的冷凍溶液形式，含有10毫克/毫升的重組LFA-3/IgG1融合蛋白和賦形劑(氯化鈉，磷酸氫鉀和磷酸二氫鈉。在冰箱或室溫溶解小管并用0.9％氯化鈉稀釋至終體積5毫升，用于靜脈內給藥(IV bolus administration)。如Miller等(1993)J.Exp.Med.178:211所述構建LFA3TIP，以參考文獻并于此處，并通過吸附到蛋白質-A Sepharose 4B(Pharmacia)和使用50mM甘氨酸，250mM氯化鈉(pH3.0)洗脫，從轉染的CHO(中國倉鼠卵巢)細胞系的培養(yǎng)物中分離。混合含蛋白質的級分并在Superose-6(Phamacia)上磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中進行凝膠過濾。混合峰級分并通過12％的還原和非還原的SDS-PAGE檢測純度。
在一個示例方案中，該病人每星期接受一次靜脈內給藥，劑量優(yōu)選地在大于0.025毫克/公斤的范圍，可以高至0.075毫克/公斤和0.150毫克/公斤之間。這個CD2結合劑的劑量基于對象的基線體重。其它給藥方案可包括一次肌肉內(IM)注射，劑量不少于0.005毫克/公斤，優(yōu)選的劑量范圍至0.025毫克/公斤，最優(yōu)選的劑量選自0.005,0.075,0.1125和0.165毫克/公斤。
應當給予單位劑量直到觀察到效果?？赏ㄟ^多種方法檢測效果。對MS，可通過標準的磁共振方法測定治療效果。對IBD，測定腹痛程度，瘺管痊愈程度，大便頻率等等，在牛皮癬性關節(jié)炎時，檢測關節(jié)腫脹和活動范圍。參考熟知的醫(yī)療程序，醫(yī)療領域的一般技術人員可容易的測定此處描述的任何一種臨床效果。
CD2結合劑或其衍生物優(yōu)選的以含有藥學可接受載體的組合物形式給藥。“藥學可接受載體”意思是不使用藥的病人產生過敏反應或其它不適效應的載體。合適的藥學可接受載體包括例如，水，鹽，磷酸緩沖液鹽，葡萄糖，甘油，乙醇等等中的一種或幾種，以及它們的組合。藥學可接受載體可進一步含有少量的輔助性物質諸如潤濕或乳化劑，防腐劑或緩沖液，它們能延長CD2結合劑的貨架時間或效果。
藥物組合物或CD2結合劑可以與其它的治療或預防藥劑聯(lián)合給藥。這些藥劑包括例如，環(huán)孢霉素A，類固醇，類維生素A，氮芥，干擾素，氨甲蝶呤，抗生素和抗組胺藥。這些藥劑可以以單劑的形式與CD2結合劑一起給藥(即作為同一藥物組合物的一部分)，以多劑的形式與CD2結合劑分開，但同時給藥，或以多劑的形式對兩者分別但順序給藥。另一種方法是，CD2結合劑和其它活性藥劑成為單一綴合分子?？赏ㄟ^本技術領域熟知的標準交聯(lián)技術進行兩種組分的綴合。單一分子也可以采取重組融合蛋白的形式。此外，本發(fā)明有用的CD2結合劑或藥物組合物可與其它療劑諸如化療劑組合使用。這種組合治療的優(yōu)勢是可使用低劑量的治療藥物。
基因治療本發(fā)明進一步基于基因治療為基礎的CD2結合劑給藥，即作為哺乳動物宿主中核酸序列的表達產物。優(yōu)選的對基因產物的用活體材料的系統(tǒng)給藥使用重組的病毒或非病毒載體，隨后體外轉染特定哺乳動物細胞種群，回收和純化轉染的細胞并對病人給藥。體內基因治療使用相同的載體和轉染，而不除去病人的任何細胞或組織。作為含有目的核酸序列的重組載體的轉染的靶的特定細胞種群包括，但不限于，(1)含有造血祖細胞的骨髓細胞種群；(2)外周血白細胞種群，優(yōu)選的是CD34+血液白細胞種群，它富含造血細胞并可用于無須脫離的引入病人后用于種群恢復轉染的造血細胞；(3)外周血液淋巴細胞種群；(4)成肌細胞，在體外轉染了感興趣核酸后可移植回宿主；和(5)通過肌肉內注射進行含有感興趣核酸序列的重組病毒或非病毒載體的或核酸序列本身的給藥。
例如，對含有包括一個能編碼表達CD2結合劑的載體的造血祖細胞的骨髓細胞的離體使用在本領域熟練技術人員能力內。簡言之，取出骨髓細胞，用重組病毒感染，重新引入哺乳動物宿主。這樣，一個基因或基因片段在哺乳動物宿主系統(tǒng)性分布，表達該DNA序列使基因產物在哺乳動物宿主中系統(tǒng)性給藥。
外周血液是用作病毒介導的載體感染的哺乳動物細胞的一個來源。更特定的地，血液白細胞，特別是含有循環(huán)造血干細胞的CD34+種群，可用作病毒感染的靶細胞，隨后使哺乳動物宿主骨髓種群恢復化而不需脫離(Karsson等，1993，骨髓移植(Bone Marrow Transplant)11(supp.1):124-127)。另外，淋巴細胞也可用作促進感興趣核酸序列的系統(tǒng)性給藥的靶細胞?？蓮乃拗鞯耐庵苎喝〕隽馨图毎?，用已知技術培養(yǎng)并用作含有感興趣核酸序列的病毒載體感染的靶細胞種群。然后可將感染的淋巴細胞注射到哺乳動物宿主(例如參看Anderson等，1990，人類基因治療(Human Gene Therapy)1:331-361)。另外一個靶細胞種群是成肌細胞。血液流入相對大量的骨骼肌使這些組織成為感興趣核酸序列的局部保藏處。這樣，將成肌細胞體外注射和重新引入到哺乳動物宿主在宿主中提供了局部靶，能夠將CD2產物系統(tǒng)給藥?？梢酝ㄟ^已知技術進行成肌細胞培養(yǎng)，感染和重新引入到宿主(例如參看Dai等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10892-10895)。
為此，體內直接注射到細胞或組織是將編碼CD2結合劑的載體分子局部給藥的另一種方法。直接注射，在表達基因產物后，最終導致將治療產物在哺乳動物宿主中系統(tǒng)給藥(Wolff等，1990，科學(Science)247:1465-1468；Raz等，1993，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:4523-4527)。在這種方式的局部給藥中使用了直接注射裸DNA，優(yōu)選的是一種非病毒載體諸如質粒DNA。
在質粒載體構建中可以使用本領域熟練技術人員可得的已知可上調感興趣核酸的表達的任何真核生物啟動子和或增強子序列，包括但不限于巨細胞病毒(CMV)啟動子，Rous肉瘤病毒(RSV)啟動子，鼠白血病病毒(MLV)啟動子，β-肌動蛋白啟動子，以及任何已知在細胞中靶向轉導的活性細胞-特異性真核啟動子序列?？梢允褂帽绢I域任何已知方法將多核苷酸序列插入載體。參看例如，Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)和Ausubel等，分子生物學現代方法(Current Protocols in MolecularBiology),J.Wiley&Sons,NY(1992)。常規(guī)載體由可操作的連接到用作特定干擾素的多核苷酸序列的合適的轉錄/翻譯控制信號組成。亦可使用啟動子/增強子控制干擾素的表達。(參看第Ⅲ部分)用于細胞基因治療的與哺乳動物宿主細胞相容的表達載體包括例如質粒；禽，鼠和人反轉錄載體；腺病毒載體；皰疹病毒載體；細小病毒載體；和非復制型痘病毒；特別地，在只能產生有復制-缺陷的病毒的包裝細胞系中可產生復制-缺陷重組病毒。參看分子生物學現代方法(Current Protocols in Molecular Biology):Sections 9.10-9.14(Ausubel et al.,eds.),Greene Publishing Associcates,1989。
用于基因轉移系統(tǒng)的特定病毒載體現已充分確定。參看例如Madzak等，J.Gen.Virol.,73:1553-36(1992)(乳多空病毒SV40)；Berkner等,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:39-61(1992)(腺病毒)；Moss等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:25-38(1992)(痘苗病毒)；Muzyczka,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:97-123(1992)(腺-伴隨病毒)；Margulskee,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:67-93(1992)(單純皰疹病毒和Epstein-Barr病毒(HBV))；Miller,Curr.Top.Microbiol.Immunol..158:1-24(1992)(反轉錄病毒)；Bradyopadhyay等，Mol.Cell.Biol.,4:749-754(1984)(反轉錄病毒)；Miller等，Nature,357:455-450(1992)(反轉錄病毒)；Anderson,Science,256:808-813(1992)(反轉錄病毒)。
優(yōu)選的載體是DNA病毒，包括腺病毒(優(yōu)選地是基于Ad-2或Ad-5的載體)，皰疹病毒(優(yōu)選地是基于單純皰疹病毒的載體)，以及細小病毒(優(yōu)選地是基于“缺陷”或非-自主的細小病毒的載體，更優(yōu)選地是基于腺-伴隨病毒的載體，最優(yōu)選地是基于AAV-2的載體)。參看例如，Ali等，基因治療(Gene Therapy)1:367-384,1994；美國專利4,797,368和5,399,346并在下面討論。腺病毒載體可以向事實上所有細胞類型提供極高水平的轉基因遞藥，無論它們處于何種有絲分裂階段。在293個細胞中(腺病毒-轉化的，互補的人胚胎腎細胞系ATCC CRL1573)很容易的產生高滴度的(1011噬斑形成單位/毫升)重組病毒并且冷凍很長一段時期而沒有可見的損失。在有各種疾病的模式動物中證實了該系統(tǒng)向體內傳遞與遺傳不平衡互補的治療性轉基因的效率。參看，Y.Watanabe,Atherosclerosis,36:261-268(1986)；K.Tanzawa等，FEBS Letters.118(1):81-84(1980)；J.L.Golasten等，New Engl.J.Med.,309(1983):288-296(1983)；S.Ishibashi等，J.Clin.Invest.,92:883-893(1993)；和S.Ishibashi等，J.Clin.Invest.,93:1889-1893(1994)。實際上已經批準了將編碼囊性纖維化跨膜調節(jié)蛋白(CFTR)的cDNA的重組的復制缺陷腺病毒用于人類CF臨床實驗。參看J.Wilson,Nature,365:691-692(Oct.,21,1993)。對于將重組腺病毒用于基因治療的安全性的進一步支持是活腺病毒疫苗在人類種群中應用的廣泛經驗。
腺-伴隨病毒(AAV)也已經用作體基因治療的載體。AAV是小的單鏈DNA病毒，基因組組織簡單(4.7kb)，使它成為基因工程的理想材料。兩個開放閱讀框編碼一系列rep和cap多肽。Rep多肽(rep68,rep62和rep40)涉及復制，拯救和整合AAV基因組。cap蛋白質(VP1,VP2和VP3)形成病毒粒子衣殼。在5’和3’末端的rep和cap開放閱讀框側翼是145bp的反轉末端重復(ITRs)，其中開始的125bp能夠形成Y-或T-形雙螺旋結構。在開發(fā)AAV載體中重要的是，可以切掉整個rep和cap結構域并替換上治療或報告轉基因。參看B.J.Carter，細小病毒手冊(Handbook of Parvoviruses),ed,P.Tijsser,CRCPress,pp.155-168(1990)。已經表明ITR代表AAV基因組復制，拯救，包裝，和整合所需的最小序列。以表明AAV在小鼠中的高水平基因表達持續(xù)至少1.5年。參看Xiao,Li和Samulski(1996)Journalof Virology 70,8089-8108。由于未發(fā)現病毒毒性或細胞宿主免疫反應，已經克服了病毒基因治療的這些局限。Fisher等(NatureMedicine(1997)3,306-312)報道將AAV注射到小鼠后小鼠中的穩(wěn)定基因表達。再次證明該病毒是安全的。未測到對病毒或外源基因產物的細胞或體液免疫反應。
動物模型存在有不同指征的合適的動物模型(諸如用于多發(fā)性硬化的已知的EAE模型)使得能夠測定描述的CD2結合劑和方法。實施例中描述了多種動物模型。
保藏本發(fā)明中有用的鼠雜交瘤細胞和抗-LFA-3抗體作為例子按照布達佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockyille,Maryland,U.S.A.,1991年3月5日，鑒定為命名 ATCC登記號1E6 HB 10693HC-1B11 HB 106947A6 HB 106958B8 HB 10696攜帶編碼跨膜LFA-3的質粒的噬菌體根據布達佩斯條約保藏在InVitro International,Inc.,Linthicum,Maryland,U.S.A.,1987年5月28，登記號IVI-10133。該保藏物在1991年6月20轉移到美國典型培養(yǎng)物保藏中心(10801 Univeristy Blvd.,Manassas,Virginia 20110-2209,United States)并鑒定為命名ATCC登記號λHT16[λgt10/LFA-3]75107用編碼PⅠ-連接的LFA-3的質粒轉化的大腸桿菌根據布達佩斯條約保藏在In Vitro International,Inc.,Linthieum,Maryland,U.S.A.,1988年7月22日，登記號IVI-10180。該保藏物在1991年6月20日轉移到美國典型培養(yǎng)物保藏中心(目前地址是1080Univeristy Blvd.,Manassas,Virginia,U.S.A.)并鑒定為命名ATCC登記號p24 68788序列下面是序列表中列舉的序列的總結序列1跨膜LFA-3的DNA序列序列2跨膜LFA-3的氨基酸序列序列3 PⅠ-連接的LFA-3的DNA序列序列4 PⅠ-連接的LFA-3的氨基酸序列序列5 CD2的DNA序列序列6 CD2的氨基酸序列序列7 LFA3TIP的DNA序列序列8 LFA3TIP的氨基酸序列為了更好的理解本發(fā)明，舉出下列實施例。這些實施例僅是為了說明，而不以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實施例1記憶效應T淋巴細胞的調節(jié)本實施例說明特定的CD2結合劑，LFA3TIP(序列8)，將會在有牛皮癬的哺乳動物個體中選擇性調節(jié)記憶效應T淋巴細胞。
材料和方法我們進行了LFA3TIP在慢性斑牛皮癬病人中的二期，隨機，雙盲，平行設計，四分支(four arm)，安慰劑-對照的研究實驗。主要研究目的是測定臨床反應與0.025至0.15毫克/公斤劑量范圍之間的關系。在美國的22個地方登記了229例從18到70歲的病人。登記的標準包括至少有一年的斑牛皮癬，涉及超過10％的表面積并且不能通過局部藥劑控制。平均病齡是16年(范圍在1-62)。在研究開始前一個月中斷光線治療和系統(tǒng)治療。LFA3TIP以冷凍溶液包裝在小管中，每管含有10毫克/毫升的融合蛋白，以及賦形劑(氯化鈉，磷酸二氫鉀，以及磷酸氫二鈉)。小管貯存在-70℃(-94°F)，在冰箱或室溫融化并用0.9％氯化鈉稀釋至終體積5毫升，用于靜脈內塊給藥。
將CD2結合劑通過靜脈內注射每星期給藥一次持續(xù)12個星期；在最后一次給藥后對病人再給藥12個星期。使用身體綜合評價和牛皮癬活性及嚴重指數(PASI)評價了疾病的程度，在最后一次將研究的藥物給藥后2個星期時評價主要功效終點。
從病人抽取外周血液并使用ficoll-hypaque梯度離心分離淋巴細胞。通過流式細胞計量術(FACSTAR PLUS,Becton Dickinson,San Jose,CA)檢測細胞(大約3×105)。監(jiān)測了一萬個事例。
結果在許多終點，我們看到LFA3TIP和安慰劑之間的統(tǒng)計差別，包括在兩個較高的LFA3TIP劑量時的PASI值降低。臨床反應速率隨LFA3TIP濃度的增加而增強(未發(fā)表資料)。此外，使用這種CD2結合劑的治療是與外周CD4+和CD8+T淋巴細胞的降低相關的，且與天然殺傷細胞有關。我們觀察到CD45RO+記憶-效應T細胞相對于CD45RA+原初的CD4+和CD8+細胞的選擇性降低。特別地，流式細胞儀檢測揭示，有記憶/效應器表型的高密度T細胞(CD4-CD45RO和CD8-CD45RO)比有原初的表型的低密度CD2 T細胞(CD4-CD45RA和CD8-CD45RA)有更多的減低。圖1圖示在接受LFA3TIP治療后的牛皮癬病人中記憶效應T細胞相對原初的T細胞的選擇性降低。X軸上方的水平框代表長期治療的持續(xù)期，在接近80天時停止。曲線代表在各治療組中的57位病人的平均絕對淋巴細胞亞群的計數。記憶效應T細胞(CD45RO+)有統(tǒng)計學顯著的劑量-相關減少。不管治療方案如何，均未觀察到外周原初的T細胞(CD45RA+)的變化。不同的CD2結合劑治療中的T細胞計數顯示出降低，在80天的長期給藥期中達到某種相對恒定的值。在治療終止后，記憶效應T細胞計數開始增加。
LFA3TIP可以很好耐受報道的非藥物-相關的嚴重負面事件。在接受LFA3TIP的所有病人中觀察到外周淋巴細胞的絕對數量有一個從輸注前水平的瞬時，溫和，劑量-依賴的降低。在總的CD2,CD4，和CD8淋巴細胞，但設在CD19淋巴細胞記錄到這種降低。
實施例Ⅱ類風濕性關節(jié)炎的治療選擇有類風濕性關節(jié)炎(RA)的病人進行治療，使用CD2結合劑諸如LFA3-TIP。本藥物如實施例1中所述制備和包裝，以每星期大約7.5至10毫克的劑量向病人給藥，持續(xù)12-24個星期。為了確定最優(yōu)化的劑量和程序，使用上面引用的不同體系進行平行設計研究。從病人抽取外周血液并使用ficoll-hypaque梯度離心分離淋巴細胞。如上所述通過流式細胞計量術(FACSTAR PLUS,Becton Dickinson,SanJose,CA)檢測細胞(大約3×105)。使用多種標記(indicia)監(jiān)測病人，包括關節(jié)腫脹和觸痛分數，作為一部分包括在標準化的“ACR 20”研究中。參看Felson,D.T.等，“美國風濕學院的類風濕性關節(jié)炎臨床試驗的疾病活性檢測”，Arth.Rheum.,26:729-740(1993)。
實施例Ⅲ炎性腸病(IBD)，局限性回腸炎，結腸炎的治療炎性腸病是一個通用術語，與一組涉及胃腸道的未知病因的慢性炎性疾病有關。潰瘍性結腸炎(UC)和局限性回腸炎，兩種主要形式的自發(fā)炎性腸病(IBD)，是廣泛存在但對其了解甚少的疾病(Kirsner,J.B.等編，Inflammatory Bowel Disease:3rded.,Lea和Febiger,Philadephia(1988)；Goldner,F.H.等，Idiopathic InflammatoryBowel Disease,in Stein,J.H.,編，Internal Medicine,LittleBrown & Co.,Boston,pp.369-380(1990)；Cello,J.P.等，Ulcerative Colitis,in Sleisenger,M.H.,等，等編，Gastrointestinal Disease:Pathophysiology DiagnosisManagement,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,p.1435(1989))。由于不知道炎性腸病的原因，可能的病因因素包括感染的，免疫學的，家族的或心理學的因素。在慢性炎性腸病中常常出現次級腸外表現，諸如關節(jié)炎和膽管周炎。對炎性腸病的藥物治療包括將抗炎癥藥柳氮磺胺吡啶(活性組分認為是5-氨基水楊酸鹽，最可能的是通過抑制前列腺素合成)和糖皮質激素給藥。
局限性回腸炎或區(qū)域性回腸炎是用于小腸的一個區(qū)域發(fā)炎的疾病的術語。這通常伴隨有腹痛，腸不規(guī)則，失重和輕微發(fā)熱。腹部通常不舒服并且可能感到增厚的腸。變窄的腸道可能會阻塞，需要立即做手術。不知道該疾病的病因。主要損傷是腸粘膜下層和淋巴腺的淋巴組織增生。局限性回腸炎是慢性胃腸道疾病，最常感染回腸，結腸或兩者都感染。通過不同的診斷使其與潰瘍性結腸炎相區(qū)分。
與局限性回腸炎的深層，常常涉及跨粘膜和裂隙相比較，潰瘍性結腸炎的病理學通常更多的是指淺層粘膜疾病(Riddle,R.H.編，Pathology of Drug-induced and Toxic Diseases,ChurchillLivingstone,New York(1982)；Morrison,B.C.等編，Gastrointestinal Pathology,2d ed.,London(1979)；Fenoglio-Pieiser,C.M.等編，Gastrointestinal Pathology:AnAtlas and Text,Raven Press,New Vork(1989)；Goldman,H.等，Hum.Pathol.13:981-1012(1982))。潰瘍性結腸炎典型地涉及直腸并鄰近延伸，但不干涉無關的“跳躍(skip)”區(qū)域，那是局限性回腸炎的標志。
用于IBD的現有動物模型可分為天然存在的和實驗-誘導的動物模型。不幸的是，只有少數自發(fā)的并很少出現的由于遺傳缺陷造成的腸炎癥的模型，它們大都不是自發(fā)性的而是由細菌或其它感染劑誘發(fā)的(例如用Bacillus psyliformnis在小鼠中誘導和使用“桿狀細菌”在倉鼠中誘導增生，隱窩膿腫，潰瘍)(Strober,W.,Dig.Dis.Sci.33 Suppl.:3S-10S(1988))。少見形式的自發(fā)潰瘍性結腸炎和肉芽小腸結腸炎亦分別在鼠和馬中出現。此外，絨猴和the cotton-toptamarin用作潰瘍性結腸炎和結腸腺癌的模型(Clapp,N.K.等編，Dig.Dis.Sci.33 Suppl.:1S-158S(1988))。實驗誘導的潰瘍性結腸炎的動物模型通常是暴露于有毒的食物，藥理劑或其它環(huán)境化學物質，或注射來自病人的物質或對動物免疫系統(tǒng)進行操作來誘導的(Strober,W.,Dig.Dis.Sci 33 Suppl.:3S-10S(1988)；Beekan,W.L.，實驗性腸病，見于Kirsner,J.B.等編，炎性腸病，Lea和Febiger,Philadelphia,pp.37-49(1988)；Onederdonk,A.B.,Dig.Dis.Sci.33 Suppl.:40S-44S(1988))。
可以檢查CD2結合劑在使用cotton-top tamarin模型動物時治療局限性回腸炎的潛在治療功效和機制。參看例如，J.Madara等，“Characterization of Spontaneous Colitis in Cotton-Top Tamarin(Saguinus oedipus)and Its Response to Sulfasalazine,”Gastroenterology,88,pp.13-19(1985)。準備了在無菌鹽水中的CD2結合劑(例如LFA3TIP)和安慰劑對照(只有鹽水)的貯備液用于向表現自發(fā)性結腸炎(即腹瀉等:參看前面Madara等)的10只CottonTop Tamarin(CTTs)給藥。通過靜脈內注射，5只CTT接受CD2結合劑，5只接受安慰劑。向接受CD2結合劑的CTTs每天注射1毫克藥劑(基于CTT的大約半公斤的重量，即為2毫克/公斤/天)持續(xù)8天(在實驗的0,1,2,3,4,5,6,和7天)。隔天對獲自動物的結腸組織樣品進行活組織檢查(在實驗的0,2,4,6,8和10天)。使用活組織檢查的資料確定各動物的急性炎癥指數，提供結腸炎病程的半-定量分析。(參看前面Madara等)抽取外周血液并使用ficoll-hypaque梯度離心分離淋巴細胞。如上所述通過流式細胞計量術(FACSTAR PLUS,Becton Dickinson,San Jose,CA)檢測細胞(大約3×105)。預期結果會顯示記憶效應T淋巴細胞的選擇性降低以及用CD2結合劑導致急性炎癥指數的顯著(p＜0.01)降低。
在人中選出IBD病人進行CD2結合劑諸如LFA3-TIP治療。這種藥劑如實施例1中所述制備和包裝，并以每星期大約7.5至10毫克的劑量對病人用藥，持續(xù)12-24個星期。為了確定最優(yōu)化的劑量和程序，使用上面引用的不同體系進行了平行設計研究。從病人抽取外周血液并使用ficoll-hypaque梯度離心分離淋巴細胞。如上所述通過流式細胞計量術(FACSTAR PLUS,Becton Dickinson,San Jose,CA)檢測細胞(大約3×105)。使用多種指標監(jiān)測病人，包括局限性回腸炎活性指數(Kjeeldsen,J,and Schaffalitzky de Muckadell,O.B.,Scand.J.Gastroenterol.28:1-9(1993))。
實施例Ⅳ治療眼色素層炎眼色素層炎是眼部疾病，可遍及眼部包括眼睛的后和前眼房以及玻璃體。眼色素層炎是眼色素層發(fā)炎，在美國占大約10％的視力損傷由此產生。全色素層炎是指整個眼睛的眼色素層(血管的)。后眼色素層炎通常是指脈絡膜視網膜炎而前眼色素層炎是指虹膜睫狀體炎。在眼睛的流體區(qū)域包括前眼房，后眼房和玻璃體區(qū)域以及涉及炎癥反應的組織，通?？砂l(fā)現這些炎癥的發(fā)炎產物，即細胞，血纖蛋白，多余的蛋白質。眼色素層炎可發(fā)生在手術或眼睛創(chuàng)傷后，作為自體免疫疾病諸如類風濕性關節(jié)炎，貝赫切特綜合征病，關節(jié)強硬性脊椎炎結節(jié)病的組分，或作為獨立的免疫介導的眼病，即扁平部睫狀體炎，虹膜睫狀體炎等，與已知的病因學無關，和發(fā)生在造成抗原-抗體復合體沉積在眼色素層組織的某些系統(tǒng)疾病之后。這些疾病總的說來代表非-感染性眼色素層炎。
在哺乳動物中的治療使用了三只短尾猴(cynomologous monkeys)。對所有程序使用氯胺酮麻醉動物(30毫克/公斤)。將含有6毫克LFA3-TIP的裝置移植到右眼并將只含有多聚物的對照裝置移植到左眼。猴子有發(fā)育完好的pars plana因而不需cryopexy。所有的裝置均移植到下顳部邊緣后方3毫米處。在第一星期，2星期，4星期，2月，4月和6月麻醉動物并使用檢眼鏡間接檢查法和視網膜電描記法檢測。按所述進行視網膜電描記法，但5個反應的平均是使用Nicolet CA-1000臨床平均器(clinical averager)(Madison,Wis.)和CKA Ganzfeld flash(Gaithersbur,MD.)獲取的。在第6個月時，使用HPLC檢測血樣的環(huán)孢霉素(檢測限度=25納克/毫升)。在6個月后使用過量戊巴比妥殺死動物然后立即通過左室灌注10％福爾馬林緩沖液。將眼睛置入固定劑隨后包埋在石蠟中，切片并以掩蔽方式檢查毒性證據。抽取外周血液并使用ficoll-hypaque梯度離心分離淋巴細胞。通過流式細胞計量術(FACSTAR PLUS,Becton Dickinson,San Jose,CA)檢測細胞(大約3×105)。
藥物動力學使用了24只動物(第一組)。將CD2結合劑混合到50∶50的乙醇水保藏溶液，濃度為1微克/20微升和10微克/20微升。亦將含氚的CD2結合劑(1微居里/20毫升)加入保藏溶液。用氯胺酮(60毫克)和塞拉嗪(20毫克)麻醉并用一滴鹽酸苯福林(25％)和托吡卡胺(1％)擴大瞳孔。使用30號針頭通過邊緣后方大約5毫米的上直肌向玻璃體內注射CD2結合劑。12只動物接受20微升中1微克的劑量，12只動物接受20微升中10微克的劑量。注射到玻璃體中央空腔并小心避免晶狀體。對于1微克組，在0.5,3,6和24小時各殺死3只動物。對于10微克組，在0.5,6,24和48小時各殺死3只動物。摘出眼球并隨后立即在-70℃冷凍。如下所述制備組織進行檢測。從1n濃度對時間作圖的回歸分析確定了玻璃體內半壽期和分布體積。
治療使用了11只動物。將含有CD2結合劑的緩釋裝置插入右眼。將只含有多聚物的裝置插入左眼。在插入裝置前進行了包括檢眼鏡檢查法和視網膜電描記法(ERG)檢測。使用接觸晶狀體電極(ERG-Jet)和兩頻道臨床信號平均器(Cadwell 5200,Kennewick,Wash)和Ganzfeldflash unit(Cadwell VPA-10,Kennewick,Wash.)記錄了兩眼的暗適應和光適應視網膜電描記信號(ERG’s)。在暗適應至少30分鐘后進行的暗適應ERG在0.33Hz激發(fā)并且平均了20個刺激的顯示。光適應ERG在光適應至少5分鐘后在2.8Hz進行，亦為20刺激的平均。評估了產生的波的振幅和潛伏期。為了盡量減小個體效應和不同天的差異(13-15)，使用實驗振幅(右)和對照振幅(左)的比率評價ERG反應。當實驗和對照眼的振幅相同時，比率為1。比率的降低反映實驗眼的振幅的相對降低。
實驗在第1,7,14和然后的6個月內兩周一次重復進行。在第6周殺死3只動物，在第16周殺死2只動物。為了評價可逆毒性，在16周從3只動物除去該裝置。每周檢查動物一次，持續(xù)兩個月，然后殺死。剩余的兩只動物在26周殺死。殺死后使用固定液(10％緩沖的福爾馬林或6％磷酸鹽緩沖戊二醛)通過左室灌注動物。摘除眼睛并置于固定液。然后將來自后極(posterior pole)的3個3毫米×6毫米樣品包埋在石蠟或塑料中并切片。每一樣品一個切片，以掩蔽的方式檢查毒性的證據。
實施例Ⅴ．牛皮癬性關節(jié)炎的治療本實施例提供了一個方案，檢測CD2結合劑在牛皮癬性關節(jié)炎病人中的臨床效果和組織反應。
牛皮癬性關節(jié)炎存在于5-8％的牛皮癬病人中，是常見的慢性風濕性疾病，如果不加治療可能導致相當嚴重的關節(jié)損傷。最近的臨床研究關注于確定不良的預后。在有顯著的關節(jié)炎癥和某些HLA抗原病人中需要早期的積極治療。牛皮癬和牛皮癬性關節(jié)炎被認為是典型的T細胞介導疾病。免疫發(fā)病機制的證據繼續(xù)指向I類HLA介導的疾病，其可能有CD8+T細胞重要作用。
研究設計這是在牛皮癬性關節(jié)炎病人中對作為實例的CD2結合劑Ⅱ期臨床研究。
該研究將包括3個月的療程，每周靜脈注射CD2結合劑。在治療開始、期間和治療后，使用本領域的臨床和常規(guī)實驗室方法測定對牛皮癬性皮膚損傷和關節(jié)炎的功效。緊接的以前，4周后和治療期結束后使用標準方法實施滑液的活組織檢查，以進行免疫組織學研究。緊接的以前，4周和12周后以及在3個月的治療后時期的末尾使用標準方法實施皮膚活組織檢查，以進行免疫組織學研究。
研究群體對象的數量為了選擇用于本研究的病人，篩選了有牛皮癬的病人是否符合下列的所有標準1)18到70歲之間(包括)的男性或女性病人。
2)女性病人必須是不具生育可能的(手術絕育或至少絕經一年)或在篩選就診時有陰性的妊娠結果并在研究給藥之前至少一個月，研究中和給藥后6個月內保持有效的生育控制方法。
3)病人必須滿足明確的牛皮癬性關節(jié)炎診斷。
4)病人必須至少一個膝關節(jié)和3個其他關節(jié)有臨床上明顯的關節(jié)炎，至少30分鐘的早晨強直以及至少28mm的紅細胞沉降速率(ESR)。
5)病人必須有比第一劑研究藥物給藥前12個月更嚴重的斑-型牛皮癬診斷。
6)病人的PASⅠ必須是12或更高。
7)在至少篩選面試前4周，除了非-類甾醇類抗-炎癥藥物(NSAID)外，病人必須中斷使用所有免疫調節(jié)藥物諸如氨甲蝶呤，環(huán)孢霉素A和皮質類固醇以及所有其它用于治療牛皮癬和/或牛皮癬性關節(jié)炎的化合物。
8)在第一劑給藥之前14天內，病人的絕對CD4+淋巴細胞計數必須在或大于正常的低限。
治療方案將CD2結合劑以7.5毫克固定劑量的靜脈內塊bolus給藥，每周一次，總共12劑。
治療方案的改進為了病人能接受下一劑的研究藥物，必須有下列情況出現-在給藥24小時內從每一受試者獲得的外周淋巴細胞的絕對數目必須大于正常下限的67％或大于受治者的基線測定值的50％。
-在上一次給藥前獲得的絕對CD4+淋巴細胞必須大于300細胞/立方毫米。
如果任何一條上述標準不能滿足，將停止向該受治者給藥并在下一個星期對該受治者重新評估。如果受治者在超過28天的時間內外周淋巴細胞絕對數目或絕對CD4+淋巴細胞數目持續(xù)減少，將永遠的停止使用研究藥物。
研究藥物和受治者的終止下面的部分描述了停用研究藥物的標準，以及撤出研究的標準。
事件方案檢測和評價在某日的同一時間收集血液學和淋巴細胞亞群分析所需的血液樣品，以防止晝夜變化造成的假象。
除非特別說明，在每次將研究藥物給藥前的指定的時間點進行下列測試和評價-在就診5,9和13(Visits5,9,and 13)進行完整的體格檢查。
-在就診1到13和15到17進行生命體征檢測。
-在就診1到13和15到17進行體重記錄。
-在就診5,9,13和17進行尿分析。
-在就診5,9,13和17進行血液化學分析。
-在就診1到17進行血液學分析。第一個實驗室檢測在第一劑研究藥物前48小時內進行。所有其它檢測在每次給藥前24小時內進行。
-在就診1到17進行淋巴細胞亞群分析。
-在就診5,13和17進行女性妊娠(尿)檢測。
-在就診13進行免疫球蛋白IgG,IgA和IgM的定量測定。
-在就診1,3,5,7,9,11和13到17進行PASⅠ。
-在就診1,3,5,7,9,11和13到17進行甲評估。
-在就診1,3,5,7,9,11和13到17測定sIL-2R和sCD27。
-在就診1,5,13對相關的，來自未暴露于陽光的非-靶的損傷，可任選的在就診17進行皮膚打孔活組織檢查。
-在就診1,5,9,13和17評價ACR Core Set。
-在就診5,9,13和17評價ACR改進標準。
-在就診1,5和13進行滑膜的膝關節(jié)鏡活組織檢查。
功效評價臨床功效評價關節(jié)炎對各個對象由同一個檢查人/風濕病學家進行對關節(jié)炎的所有功效評價-ACR cote Set和改進測定皮膚損傷對各病人由同一個檢查人/皮膚學家進行對皮膚損傷的所有功效評價-PASⅠ分數-指(趾)甲評估。
實驗室功效評估-關節(jié)鏡檢查法滑液活組織檢查-滑膜的免疫組織學研究-牛皮癬的血清疾病活性標記-皮膚活組織檢查-皮膚的免疫組織學研究安全性評估臨床安全性評估-體格檢查-生命體征(溫度，心率，呼吸頻率，以及仰臥血壓)-體重-監(jiān)控感染-監(jiān)控副事件實驗室安全性評估-血液學服藥24小時內進行示差和血小板計數的全血細胞計數，并由檢查人在各位點監(jiān)測。
-血液化學分布鈉，鉀，氯，重碳酸鹽，血液尿素氮，肌酸酐，鈣，磷酸鹽，白蛋白，總蛋白，堿性磷酸酶，總膽紅素，ALAT,ASAT,以及γ-谷氨酰轉氨酶。
-尿分析產物/實驗專一性安全評價-利用T淋巴細胞(CD4,CD8)明確的亞群標記，使用流式細胞計量術進行外周淋巴細胞亞群定量。
統(tǒng)計聲明和分析計劃樣本大小的考慮使用10位對象的臨床試驗研究認為適用于評價安全性和功效。做過的用CD2結合劑諸如LFA-3/IgG1融合蛋白的實驗證實了對總淋巴細胞以及CD4和CD8亞群的一致功效。
終點的描述關節(jié)炎和牛皮癬的主要臨床功效終點基于12周后治療的結束。臨床功效的替代終點基于治療4周和8周。主要安全性終點基于治療后3個月觀察期的結束。在皮膚和滑膜中免疫組織學變化的替代終點是基于兩個時間點治療后4周和12周。
在客觀分析中要使用的統(tǒng)計學方法分析的一般方法是建立基線和治療結束時的臨床和實驗室差別。這可以使用例如方差或協(xié)方差，或邏輯回歸完成。在分析前可能需要將反應進行轉換。合適時，使用非參數技術。
臨床功效分析確定在ACR Core Set檢測中顯示20％的改進的病人的比例。確定其PASⅠ分數比基線至少降低50％的病人的比例。其它的功效測定包括最小PASⅠ分數，總紅斑分數，總硬結分數，總脫屑分數和指(趾)甲分數。
實驗室功效分析對滑膜和皮膚的免疫組織學研究以及牛皮癬活性標記的血清水平將提供與基線值比較的資料。
我們描述了本發(fā)明的多種實施方案，顯而易見可將我們的基本實施方案加以改變提供使用本發(fā)明方法的其它的實施方案。因而，應當理解本發(fā)明的范圍包括所有可任選擇的實施方案和變體，并在上面的說明和附錄的權利要求書中定義；本發(fā)明不受此處列舉作為例子的特定實施方案限制。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人Magilavy,Daniel(ⅱ)發(fā)明名稱調節(jié)記憶效應器T-細胞的方法和組合物(ⅲ)序列數目8(ⅳ)通訊地址(A)聯(lián)系人BIOGEN,INC.
(B)街道14Cambridge Center(C)城市Cambridge(D)州Massachusetts(E)國家美國(F)郵編02142(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件patentIn(ⅵ)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)提交日期31-AUG-1999(ⅶ)先前申請資料(A)申請?zhí)?6/098,456
(B)提交日期31-AUG-1999(ⅷ)律師/代理人資料(A)姓名Kaplan,Warren(B)注冊號34,199(C)參考/檔案號A005PCT(ⅸ)電傳信息(A)電話(617)679-3598(B)電傳(617)679-2838(2)序列1信息(ⅰ)序列特征(A)長度753堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞CDS(B)位置1..750(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞sig-peptide(B)位置1..84(ⅸ)特征
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TGT CCT ATG GAG CAA TGT AAA CGT AAC TCA ACC AGT ATA TAT TTT AAG 528Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys135 140 145ATG GAA AAT GAT CTT CCA CAA AAA ATA CAG TGT ACT CTT AGC AAT CCA 576Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro150 155 160TTA TTT AAT ACA ACA TCA TCA ATC ATT TTC ACA ACC TGT ATC CCA AGC 624Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser165 170 175 180AGC GGT CAT TCA AGA CAC AGA TAT GCA CTT ATA CCC ATA CCA TTA GCA 672Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala185 190 195GTA ATT ACA ACA TGT ATT GTG CTG TAT ATG AAT GGT ATT CTG AAA TGT 720Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Ile Leu Lys Cys200 205 210GAC AGA AAA CCA GAC AGA ACC AAC TCC AAT TGA 753Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn215 220(2)序列2信息(ⅰ)序列特征(A)長度250個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述序列2Met val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val-28 -25 -20 -15Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln-10 -5 1Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn5 10 15 20Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala25 30 35Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg40 45 50
Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr55 60 65Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp70 75 80Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr85 90 95 100Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile105 110 115Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp120 125 130Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys135 140 145Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro150 155 160Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser165 170 175 180Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala185 190 195Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Ile Leu Lys Cys200 205 210Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn215 220(2)序列3信息(ⅰ)序列特征(A)長度723堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞CDS(B)位置1..720
(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞sig-peptide(B)位置1..84(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞成熟肽(mat-peptide)(B)位置85..720(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞混合特征(misc-feature)(B)位置1..720(D)其它信息/注釋=“人PI-連接的LFA-3”(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞混合特征(misc-feature)(B)位置568..720(D)其它信息/注釋=“PI-連接的信號序列”(ⅹⅰ)序列描述序列3ATG GTT GCT GGG AGC GAC GCG GGG CGG GCC CTG GGG GTC CTC AGC GTG 48Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val-28 -25 -20 -15GTC TGC CTG CTG CAC TGC TTT GGT TTC ATC AGC TGT TTT TCC CAA CAA 96Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln-10 -5 1ATA TAT GGT GTT GTG TAT GGG AAT GTA ACT TTC CAT GTA CCA AGC AAT 144Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn5 10 15 20GTG CCT TTA AAA GAG GTC CTA TGG AAA AAA CAA AAG GAT AAA GTT GCA 192Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala25 30 35
GAA CTG GAA AAT TCT GAA TTC AGA GCT TTC TCA TCT TTT AAA AAT AGG 240Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg40 45 50GTT TAT TTA GAC ACT GTG TCA GGT AGC CTC ACT ATC TAC AAC TTA ACA 288Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr55 60 65TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG CCA AAT ATT ACT GAT 336Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp70 75 80ACC ATG AAG TTC TTT CTT TAT GTG CTT GAG TCT CTT CCA TCT CCC ACA 384Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr85 90 95 100CTA ACT TGT GCA TTG ACT AAT GGA AGC ATT GAA GTC CAA TGC ATG ATA 432Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile105 110 115CCA GAG CAT TAC AAC AGC CAT CGA GGA CTT ATA ATG TAC TCA TGG GAT 480Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp120 125 130TGT CCT ATG GAG CAA TGT AAA CGT AAC TCA ACC AGT ATA TAT TTT AAG 528Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys135 140 145ATG GAA AAT GAT CTT CCA CAA AAA ATA CAG TGT ACT CTT AGC AAT CCA 576Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser ASn Pro150 155 160TTA TTT AAT ACA ACA TCA TCA ATC ATT TTG ACA ACC TGT ATC CCA AGC 624Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser165 170 175 180AGC GGT CAT TCA AGA CAC AGA TAT GCA CTT ATA CCC ATA CCA TTA GCA 672Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala185 190 195GTA ATT ACA ACA TGT ATT GTG CTG TAT ATG AAT GGT ATG TAT GCT TTT 720Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Met Tyr Ala Phe200 205 210TAA 723(2)序列4信息(ⅰ)序列特征(A)長度240個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述序列4
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(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞CDS(B)位置1..1053(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞信號肽(sig-peptide)(B)位置1..72(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞成熟肽(mat-peptide)(B)位置73..1053(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞混合特征(misc-feature)(B)位置1..1053(D)其它信息/注釋=“人CD2”(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞混合-特征(B)位置628..702(D)其它信息/注釋=“跨膜結構域”(ⅹⅰ)序列描述序列5
ATG AGC TTT CCA TGT AAA TTT GTA GCC AGC TTC CTT CTG ATT TTC AAT 48Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn-24 -20 -15 -10GTT TCT TCC AAA GGT GCA GTC TCC AAA GAG ATT ACG AAT GCC TTG GAA 96Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu-5 1 5ACC TGG GGT GCC TTG GGT CAG GAC ATC AAC TTG GAC ATT CCT AGT TTT 144Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe10 15 20CAA ATG AGT GAT GAT ATT GAC GAT ATA AAA TGG GAA AAA ACT TCA GAC 192Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp25 30 35 40AAG AAA AAG ATT GCA CAA TTC AGA AAA GAG AAA GAG ACT TTC AAG GAA 240Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu45 50 55AAA GAT ACA TAT AAG CTA TTT AAA AAT GGA ACT CTG AAA ATT AAG CAT 288Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His60 65 70CTG AAG ACC GAT GAT CAG GAT ATC TAC AAG GTA TCA ATA TAT GAT ACA 336Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr75 80 85AAA GGA AAA AAT GTG TTG GAA AAA ATA TTT GAT TTG AAG ATT CAA GAG 384Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu90 95 100AGG GTC TCA AAA CCA AAG ATC TCC TGG ACT TGT ATC AAC ACA ACC CTG 432Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu105 110 115 120ACC TGT GAG GTA ATG AAT GGA ACT GAC CCC GAA TTA AAC CTG TAT CAA 480Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln125 130 135GAT GGG AAA CAT CTA AAA CTT TCT CAG AGG GTC ATC ACA CAC AAG TGG 528Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp140 145 150ACC ACC AGC CTG AGT GCA AAA TTC AAG TGC ACA GCA GGG AAC AAA GTC 576Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val155 160 165AGC AAG GAA TCC AGT GTC GAG CCT GTC AGC TGT CCA GAG AAA GGT CTG 624Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu170 175 180GAC ATC TAT CTC ATC ATT GGC ATA TGT GGA GGA GGC AGC CTC TTG ATG 672Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met185 190 195 200GTC TTT GTG GCA CTG CTC GTT TTC TAT ATC ACC AAA AGG AAA AAA CAG 720Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln205 210 215AGG AGT CGG AGA AAT GAT GAG GAG CTG GAG ACA AGA GCC CAC AGA GTA 768Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val220 225 230GCT ACT GAA GAA AGG GGC CGG AAG CCC CAC CAA ATT CCA GCT TCA ACC 816Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr235 240 245CCT CAG AAT CCA GCA ACT TCC CAA CAT CCT CCT CCA CCA CCT GGT CAT 864Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His250 255 260
CGT TCC CAG GCA CCT AGT CAT CGT CCC CCG CCT CCT GGA CAC CGT GTT 912Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val265 270 275 280CAG CAC CAG CCT CAG AAG AGG CCT CCT GCT CCG TCG GGC ACA CAA GTT 960Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val285 290 295CAC CAG CAG AAA GGC CCG CCC CTC CCC AGA CCT CGA GTT CAG CCA AAA 1008His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys300 305 310CCT CCC CAT GGG GCA GCA GAA AAC TCA TTG TCC CCT TCC TCT AAT 1053Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn315 320 325TAA 1056(2)序列6信息(ⅰ)序列特征(A)長度351個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述序列6Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn-24 -20 -15 -10Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu-51 5Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe10 15 20Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp25 30 35 40Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu45 50 55Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His60 65 70Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr75 80 85Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu90 95 100Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu105 110 115 120
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln125 130 135Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp140 145 150Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val155 160 165Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu170 175180Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met185 190 195 200Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln205 210 215Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val220 225 230Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr235 240 245Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln Mis Pro Pro Pro Pro Pro Gly His250 255 260Arg Ser Gln Ala Pro Ser Mis Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val265 270 275 280Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val285 290 295His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys300 305 310Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn315 320 325(2)序列7信息(ⅰ)序列特征(A)長度1050堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)特征(A)命名/關鍵詞CDS(B)位置1..1041
(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞信號肽(sig-peptide)(B)位置1..84(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞成熟肽(mat-peptide)(B)位置85..1041(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞混合特征(misc-feature)(B)位置85..1041(D)其它信息/注釋=“LFA3TIP”(ⅸ)特征(A)命名/關鍵詞混合特征(misc-feature)(B)位置360..361(D)其它信息/注釋=“LFA-3/IgG融合位點”(ⅹⅰ)序列描述序列7ATG GTT GCT GGG AGC GAC GCG GGG CGG GCC CTG GGG GTC CTC AGC GTG 48Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val-28 -25 -20 -15GTC TGC CTG CTG CAC TGC TTT GGT TTC ATC AGC TGT TTT TCC CAA CAA 96Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln-10 -5 1ATA TAT GGT GTT GTG TAT GGG AAT GTA ACT TTC CAT GTA CCA AGC AAT 144Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn5 10 15 20GTG CCT TTA AAA GAG GTC CTA TGG AAA AAA CAA AAG GAT AAA GTT GCA 192Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala25 30 35GAA CTG GAA AAT TCT GAA TTC AGA GCT TTC TCA TCT TTT AAA AAT AGG 240Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg40 45 50GTT TAT TTA GAC ACT GTG TCA GGT AGC CTC ACT ATC TAC AAC TTA ACA 288Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr55 60 65
TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG CCA AAT ATT ACT GAT 336Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp70 75 80ACC ATG AAG TTC TTT CTT TAT GTC GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG 384Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro85 90 95 100TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC 432Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro105 110 115CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA 480Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr120 125 130TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC 528Cys Val Val Va1 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn135 140 145TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG 576Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg150 155 160GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGG GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC 624Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Va1 Val Ser Val Leu Thr Val165 170 175 180CTG CAC CAG GACTGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC 672Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser185 190 195AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA 720Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys200 205 210GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT 768Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp215 220 225GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC 816Glu Leu Thr Lys Asn Gln Va1 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe230 235 240TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG 864Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu245 250 255 260AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC 912Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe265 270 275TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG 960Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly280 285 290AAC GTC TTC TCA TCC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC1008Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr295 300 305ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGAGTGCGG 1050Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys310 315(2)序列8信息(ⅰ)序列特征(A)長度347個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲類型線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述序列8
Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val-28 -25 -20 -15Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln-10 -5 1Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn5 10 15 20Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala25 30 35Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg40 45 50Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr55 60 65Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp70 75 80Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro85 90 95 100Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro105 110 115Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr120 125 130Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn135 140 145Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg150 155 160Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val165 170 175 180Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser185 190 195Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys200 205 210Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp215 220 225Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe230 235 240Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu245 250 255 260Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe265 270 275Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly280 285 290Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr295 300 305Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys310 31權利要求
1．選擇性調節(jié)有醫(yī)學病癥的受治者中記憶效應T淋巴細胞的方法，該方法包括給予受治者有效量的CD2結合劑。
2．權利要求1的方法，其中記憶效應T淋巴細胞是CD45 RO T淋巴細胞。
3．權利要求1的方法，其中的CD2結合劑選自抗-LFA-3抗體同系物，抗-CD2抗體同系物，可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，CD2模擬劑，以及LFA-3模擬劑。
4．權利要求3的方法，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
5．權利要求3的方法，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
6．權利要求5的方法，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
7．治療受治者疾病的方法，其中疾病的特征是記憶效應T淋巴細胞在上述疾病的發(fā)病機理中起作用，且其中的方法包括給予受治者足以調節(jié)記憶效應T淋巴細胞的量的CD2結合劑。
8．權利要求7的方法，其中的CD2結合劑選自抗-LFA-3抗體同系物，抗-CD2抗體同系物，可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，CD2模擬劑，以及LFA-3模擬劑。
9．權利要求8的方法，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
10．權利要求9的方法，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
11．權利要求10的方法，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
12．權利要求7的方法，其中的記憶效應T淋巴細胞是CD45 RO T淋巴細胞。
13．權利要求1到7的方法，其中的疾病選自牛皮癬性關節(jié)炎，類風濕性關節(jié)炎，多發(fā)性硬化，特應性皮炎，眼色素層炎，炎性腸病，局限性回腸炎，潰瘍性結腸炎，以及皮膚T細胞淋巴瘤。
14．在哺乳動物中調節(jié)記憶效應T淋巴細胞的方法，其中的哺乳動物含有記憶效應T淋巴細胞浸潤的器官，該方法包括給予哺乳動物一定量的CD2結合劑，該量在所述器官中足以選擇性調節(jié)記憶效應T淋巴細胞。
15．權利要求14的方法，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
16．權利要求15的方法，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
17．權利要求16的方法，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
18．權利要求14的方法，其中的哺乳動物患有選自包括牛皮癬性關節(jié)炎，類風濕性關節(jié)炎，多發(fā)性硬化，特應性皮炎，眼色素層炎，炎性腸病，局限性回腸炎，潰瘍性結腸炎，以及皮膚T細胞淋巴瘤的組中的疾病。
19．治療哺乳動物的牛皮癬性關節(jié)炎的方法，包括給予哺乳動物有效量的CD2結合劑。
20．權利要求19的方法，其中的CD2結合劑的量足以在哺乳動物中選擇性調節(jié)記憶效應T淋巴細胞。
21．權利要求19的方法，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
22．權利要求21的方法，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
23．權利要求22的方法，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
24．治療哺乳動物的類風濕性關節(jié)炎的方法，包括給予哺乳動物有效量的CD2結合劑。
25．權利要求24的方法，其中的CD2結合劑的量足以在哺乳動物中選擇性調節(jié)記憶效應T淋巴細胞。
26．權利要求25的方法，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
27．權利要求26的方法，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
28．權利要求27的方法，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
29．治療哺乳動物的多發(fā)性硬化的方法，包括給予哺乳動物有效量的CD2結合劑。
30．權利要求29的方法，其中的CD2結合劑的量足以在哺乳動物中選擇性調節(jié)記憶效應T淋巴細胞。
31．權利要求30的方法，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
32．權利要求31的方法，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
33．權利要求32的方法，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
34．治療哺乳動物的眼色素層炎的方法，包括給予哺乳動物有效量的CD2結合劑。
35．權利要求34的方法，其中的CD2結合劑的量足以在哺乳動物中選擇性調節(jié)記憶效應T淋巴細胞。
36．權利要求35的方法，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
37．權利要求36的方法，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
38．權利要求37的方法，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
39．治療哺乳動物的炎性腸病的方法，包括給予哺乳動物有效量的CD2結合劑。
40．權利要求39的方法，其中的CD2結合劑的量足以在哺乳動物中選擇性調節(jié)記憶效應T淋巴細胞。
41．權利要求40的方法，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
42．權利要求41的方法，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
43．權利要求42的方法，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
44．治療哺乳動物的局限性回腸炎的方法，包括給予哺乳動物有效量的CD2結合劑。
45．權利要求44的方法，其中的CD2結合劑的量足以在哺乳動物中選擇性調節(jié)記憶效應T淋巴細胞。
46．權利要求45的方法，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
47．權利要求46的方法，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
48．權利要求47的方法，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
49．治療哺乳動物的潰瘍性結腸炎的方法，包括給予哺乳動物有效量的CD2結合劑。
50．權利要求49的方法，其中的CD2結合劑的量足以在哺乳動物中選擇性調節(jié)記憶效應T淋巴細胞。
51．權利要求50的方法，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
52．權利要求51的方法，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
53．權利要求52的方法，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
54．治療哺乳動物的皮膚T細胞淋巴瘤的方法，包括給予哺乳動物有效量的CD2結合劑。
55．權利要求54的方法，其中的CD2結合劑的量足以在哺乳動物中選擇性調節(jié)記憶效應T淋巴細胞。
56．權利要求55的方法，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
57．權利要求56的方法，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
58．權利要求57的方法，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
59．從有疾病的哺乳動物獲取的記憶效應T淋巴細胞群體，該疾病特征是存在記憶效應T淋巴細胞浸潤到哺乳動物的某器官，其中的群體與CD2結合劑聯(lián)合。
60．權利要求59的細胞群體，其中的CD2結合劑是可溶性LFA-3多肽，它含有選自下列組中的氨基酸序列(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。
61．權利要求60的細胞群體，其中的可溶性LFA3多肽是融合蛋白，含有成熟LFA-3的氨基末端92個氨基酸和人IgG1鉸鏈區(qū)的C-末端10個氨基酸。
62．權利要求61的細胞群體，其中的可溶性LFA3融合蛋白進一步包含人IgGⅠ重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。
63．權利要求59的細胞群體，其中的細胞獲自具有選自牛皮癬性關節(jié)炎，類風濕性關節(jié)炎，多發(fā)性硬化，特應性皮炎，眼色素層炎，炎性腸病，局限性回腸炎，潰瘍性結腸炎，以及皮膚T細胞淋巴瘤的疾病的哺乳動物。
全文摘要
公開了選擇性調節(jié)具有疾病的受治者的記憶效應T－淋巴細胞的方法。該方法使用CD2結合劑。
文檔編號A61P29/00GK1315866SQ9981031
公開日2001年10月3日 申請日期1999年8月31日 優(yōu)先權日1998年8月31日
發(fā)明者D·瑪吉拉維 申請人:拜奧根有限公司