專利名稱：從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法及分離所得神經(jīng)元的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法及其 用該方法得到的多巴胺能神經(jīng)元來(lái)治療帕金森綜合癥的用途。
背景技術(shù)：
帕金森綜合癥是一種自發(fā)的、緩慢發(fā)展的、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化性的疾病，它的發(fā)病 特征為運(yùn)動(dòng)緩慢、肌肉僵硬、靜止震顫和姿勢(shì)不穩(wěn)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它是由黑色、藍(lán)斑以及其它腦 干多巴胺能細(xì)胞中著色的神經(jīng)元持續(xù)惡化后所產(chǎn)生的癥狀，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的缺失。 在中年以上的人群中，帕金森綜合癥是危害人們身體健康的第四種常見的神經(jīng)退化疾病， 它影響了 0. 4%的年過(guò)40歲的人和的年過(guò)65歲的人。不管患者年齡的大小，對(duì)于那些 受到該疾病折磨的患者來(lái)說(shuō)，常常造成毀滅性的結(jié)果。造成這種結(jié)果的原因是對(duì)多巴胺能 神經(jīng)元的破壞是不可逆的。對(duì)于這種疾病的治療主要希望是發(fā)展神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞群體，并 使神經(jīng)系統(tǒng)的功能恢復(fù)協(xié)調(diào)。有些證據(jù)已經(jīng)顯示胎兒多巴胺能神經(jīng)元可恢復(fù)帕金森綜合癥 的化學(xué)異常。但是至今沒有找到適當(dāng)?shù)慕M織。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)的發(fā)明目的在于發(fā)現(xiàn)從健康產(chǎn)婦分娩后廢棄物人胎盤上的人羊膜組織組 織內(nèi)的人羊膜上皮細(xì)胞中存在許多用于治療帕金森綜合癥的多巴胺能神經(jīng)元，而提供一種 從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法及其用該方法得到的多巴胺能神 經(jīng)元來(lái)治療帕金森綜合癥的用途。本發(fā)明的從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法通過(guò)以下方式 進(jìn)行實(shí)施本發(fā)明的一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包 括以下步驟(1)取新鮮人胎盤組織，將人羊膜組織剝離，用生理鹽水反復(fù)沖洗除去血凝塊，然 后用無(wú)菌D-hank’ s液浸泡1. 2-2個(gè)小時(shí)后，再用生理鹽水漂洗2_5次；(2)將漂洗過(guò)的人羊膜置于0. 25%的胰蛋白酶溶液中，在36. 5°C -37. 5°C的溫度 下消化10-20分鐘；(3)用含有10%胎牛血清的DMEM/F12終止上述人羊膜組織在胰蛋白酶溶液中的 消化，然后用180-220目細(xì)胞篩對(duì)上述溶液進(jìn)行過(guò)濾，收集得到的細(xì)胞為人羊膜上皮細(xì)胞；(4)分離所獲得的人羊膜上皮細(xì)胞，用10%無(wú)胎牛血清的培養(yǎng)基對(duì)分離出來(lái)的上 述人羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)；(5)選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3或4或5或6代人羊膜上皮細(xì)胞，然后用神經(jīng)干細(xì)胞分
化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；(6)將上述人羊膜上皮細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-14天后，對(duì)收獲部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，確認(rèn)酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞的存在，并進(jìn)行定量分析，得到了含有多巴胺 能神經(jīng)元樣細(xì)胞的細(xì)胞；(7)收獲所有上述細(xì)胞。本發(fā)明的一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其中所 述的步驟(1)中的無(wú)菌D-hank，S液含有1000U/ml青霉素、1000U/ml鏈霉素、100U/ml慶 大霉素和2. 5ng/ml兩性霉素。本發(fā)明的一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其中在 所述的步驟(1)中，人羊膜組織用無(wú)菌D-hank’ S液浸泡1. 5個(gè)小時(shí)后，再用濃度為0. 9% 的生理鹽水漂洗3次。本發(fā)明的一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其中在 所述的步驟(2)中，人羊膜在37. °C的溫度下消化15分鐘。本發(fā)明的一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其中在 所述的步驟(3)中，用200目細(xì)胞篩對(duì)上述溶液進(jìn)行過(guò)濾。本發(fā)明的一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其中 所述的步驟(5)中的神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基每毫升含有15%的血清、200ng的Sonic hedgehogSHH、IOOng的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8、IOng的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8、200 μ M 的維生素C和20ng的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。本發(fā)明的一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其中所 述的步驟(6)中的定量分析是利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記，然后在倒置生物 顯微鏡下選擇至少三個(gè)低倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，該低倍視野的倍數(shù)為10倍。本發(fā)明的一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其中所 述的步驟(4)中的體外傳代培養(yǎng)是在溫度為37°C、濕度為95%和5%的二氧化碳的孵化箱 內(nèi)進(jìn)行的，步驟(5)中人羊膜上皮細(xì)胞的一代的繁殖時(shí)間為10-12天。本發(fā)明的一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其中所 述的無(wú)菌D-hank’ s、DMEM/F12和無(wú)胎牛血清的培養(yǎng)基為市售產(chǎn)品。本發(fā)明的用途為用所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方 法中得到的多巴胺能神經(jīng)元來(lái)治療帕金森綜合癥。本發(fā)明利用健康產(chǎn)婦分娩后醫(yī)療廢棄物人羊膜組織來(lái)源人羊膜上皮細(xì)胞，體外培 養(yǎng)誘導(dǎo)分化酪氨酸陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元，用于帕金森病的治療。人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells, hAECs)源于胚胎早期，保持類似胚胎干細(xì)胞的多分化潛能， 可分化為內(nèi)胚層(胰、肝)、中胚層(心肌細(xì)胞)和外胚層(神經(jīng)細(xì)胞)。其中具有神經(jīng)干 細(xì)胞(神經(jīng)細(xì)胞)特性的人羊膜上皮細(xì)胞是細(xì)胞替代治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的良好細(xì)胞來(lái)源。人羊膜上皮細(xì)胞經(jīng)10% FCS(FCS胎牛血清)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，可以獲得純度在 85%酪氨酸羥化酶陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞，帕金森病動(dòng)物模型腦內(nèi)紋狀體移植，不僅 可以改善帕金森病動(dòng)物模型的行為障礙，腦內(nèi)組織形態(tài)學(xué)異常也得到改善，我們的研究證 實(shí)移植動(dòng)物腦內(nèi)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元明顯優(yōu)于正常對(duì)照。


圖IA-圖IC為用本發(fā)明的方法培養(yǎng)出的細(xì)胞在顯微鏡下的顯示，證明用本發(fā)明的方法可以培養(yǎng)出多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞；圖2A-圖2D為多巴胺能表型分化和神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因；圖3A-圖3C為將本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞移植到小鼠的腦內(nèi)后，對(duì)小鼠進(jìn)行切片分析， 得到的酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞、人羊膜上皮細(xì)胞和外源性酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞在小鼠腦 內(nèi)的表達(dá)；圖4A-圖4C為將本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞移植到小鼠的腦內(nèi)后，對(duì)小鼠進(jìn)行切片分析， 得到的酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞、抗人核抗原和外源性酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞在小鼠腦內(nèi)的 表達(dá)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包 括以下步驟(1)取新鮮人胎盤組織，將人羊膜組織剝離，用生理鹽水反復(fù)沖洗除去血凝塊，然 后用市售的無(wú)菌D-hank’ s液浸泡1.5個(gè)小時(shí)后，再用0. 9%的生理鹽水漂洗3次，無(wú)菌 D-hank，s液含有1000U/ml青霉素、1000U/ml鏈霉素、100U/ml慶大霉素和2. 5ng/ml兩性
霄素；(2)將漂洗過(guò)的人羊膜置于0. 25%的胰蛋白酶溶液中，在37°C的溫度下消化15分 鐘；(3)用含有10%胎牛血清的DMEM/F12(市售的)終止上述人羊膜在胰蛋白酶溶液 中的消化，然后用200目細(xì)胞篩對(duì)上述溶液進(jìn)行過(guò)濾，收集得到的細(xì)胞為人羊膜上皮細(xì)胞；(4)分離所獲得的人羊膜上皮細(xì)胞，用10%市售的無(wú)胎牛血清的培養(yǎng)基對(duì)分離出 來(lái)的上述人羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，該體外傳代培養(yǎng)的環(huán)境是在溫度為37°C、濕 度為95%和5%的二氧化碳的孵化箱內(nèi)進(jìn)行的；(5)選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3或4或5或6代人羊膜上皮細(xì)胞，人羊膜上皮細(xì)胞的一 代的繁殖時(shí)間為10-12天，然后用神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng) 基每毫升含有15%的血清、200ng的Sonic hedgehog SHH、IOOng的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 SUOng的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8、200 μ M的維生素C和20ng的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；(6)將上述人羊膜上皮細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-14天后，對(duì)收獲部 分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，確認(rèn)酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞的存在，由于多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞帶有酪 氨酸羥化酶，所以通過(guò)確認(rèn)酪氨酸羥化酶的存在，就可以確認(rèn)多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的存 在。并利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記法進(jìn)行定量標(biāo)記分析，然后在倒置生物顯微鏡下選擇 至少三個(gè)低倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，該低倍視野的倍數(shù)為10倍，得到了含有多巴胺能神經(jīng)元 樣細(xì)胞的細(xì)胞；(7)收獲上述所有細(xì)胞。用從上述方法中得到的多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞來(lái)治療帕金森綜合癥，即用上述方 法得到的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞向患有金森綜合的病人的腦內(nèi)進(jìn)行移植。對(duì)本發(fā)明的所得到的部分細(xì)胞利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記法進(jìn)行定量標(biāo)記和 分析，可以在顯微鏡下看到如圖IA所示的用紅色熒光標(biāo)記的(由光點(diǎn)表示出)的酪氨酸羥 化酶、如圖IB所示的用藍(lán)色熒光標(biāo)記的(由亮點(diǎn)表示的)所有細(xì)胞核和如圖IC所示的用上述兩種熒光共同標(biāo)記的(由亮點(diǎn)表示的)多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞。通過(guò)上述三個(gè)圖向人 們顯示出用本發(fā)明的方法所得到的細(xì)胞存在一定數(shù)量的多巴胺樣神經(jīng)細(xì)胞，可以作為用 于治療帕金森病的細(xì)胞來(lái)源。用本發(fā)明的方法所得到的部分細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的基因檢測(cè)，得到圖2所示的多巴 胺能表型分化和神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因；圖2A-圖2B分別表示多巴胺能表型分化相關(guān)基因 MathUNGN2 ；圖2C-圖2D分別表示神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因Mashl、N0thl ；可以證明用本發(fā)明的 方法所得到的細(xì)胞含有生成多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的基礎(chǔ)。將本發(fā)明所得到的細(xì)胞移植到小鼠腦內(nèi)，在顯微鏡下對(duì)小鼠的腦進(jìn)行切片分析， 圖3A顯示出在小鼠腦內(nèi)有用FITC(綠色熒光)標(biāo)記的酪氨酸羥化酶。用本發(fā)明的方法所 得到的人羊膜上細(xì)胞在體外經(jīng)紅色熒光素PKH26標(biāo)記后移植到小鼠腦內(nèi)，圖3B中的亮點(diǎn)顯 示小鼠腦內(nèi)紋狀體分布有用PKH26標(biāo)記陽(yáng)性人羊膜上皮細(xì)胞的表達(dá)，圖3C顯示出小鼠腦 內(nèi)有用FITC(標(biāo)記綠色熒光)與PKH26雙標(biāo)記細(xì)胞，證實(shí)小鼠腦內(nèi)存在來(lái)自外源性移植細(xì) 胞的人羊膜上皮細(xì)胞，并且這種人羊膜上皮細(xì)胞含有多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。向小鼠腦內(nèi)移植本申請(qǐng)的從人羊膜上皮細(xì)胞中分離出來(lái)的細(xì)胞，圖4A顯示出在 小鼠腦內(nèi)有用FITC(綠色熒光)標(biāo)記的酪氨酸羥化酶；抗人核抗原為人源細(xì)胞的特異性 標(biāo)記物，圖4B顯示出存在于小鼠腦內(nèi)的用紅色熒光標(biāo)記的抗人核抗原免疫熒光染色的人 羊膜上皮細(xì)胞；圖4C顯示出其中部分酪氨酸羥化酶(FITC標(biāo)記綠色熒光)與抗人核抗原 (Teasered標(biāo)記紅色熒光)雙標(biāo)記細(xì)胞(黃色)，說(shuō)明小鼠腦內(nèi)存在來(lái)自外源性移植細(xì)胞的 人羊膜上皮細(xì)胞，并且這種人羊膜上皮細(xì)胞含有多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。從以上的試驗(yàn)中可以得出將從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出來(lái)的細(xì)胞移植到小 鼠腦后，在小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)了來(lái)自外源性移植細(xì)胞的人羊膜上皮細(xì)胞，并且這種人羊膜上皮 細(xì)胞中有多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。以上方法只是對(duì)本發(fā)明的解釋，不是對(duì)發(fā)明的限定，本發(fā)明所限定的范圍參見權(quán) 利要求，在不違背本發(fā)明的精神的情況下，本發(fā)明可以作任何形式的修改。
權(quán)利要求
一種從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包括以下步驟(1)取新鮮人胎盤組織，將人羊膜組織剝離，用生理鹽水反復(fù)沖洗除去血凝塊，然后用無(wú)菌D-hank’s液浸泡1.2-2個(gè)小時(shí)后，再用生理鹽水漂洗2-5次；(2)將漂洗過(guò)的人羊膜組織置于0.25％的胰蛋白酶溶液中，在36.5℃-37.5℃的溫度下消化10-20分鐘；(3)用含有10％胎牛血清的DMEM/F12終止上述人羊膜在胰蛋白酶溶液中的消化，然后用180-220目細(xì)胞篩對(duì)上述溶液進(jìn)行過(guò)濾，收集得到的細(xì)胞為人羊膜上皮細(xì)胞；(4)分離所獲得的人羊膜上皮細(xì)胞，用10％無(wú)胎牛血清的培養(yǎng)基對(duì)分離出來(lái)的上述人羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)；(5)選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3或4或5或6代人羊膜上皮細(xì)胞，然后用神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；(6)將上述人羊膜上皮細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-14天后，對(duì)收獲的部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，確認(rèn)酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞的存在，并進(jìn)行定量分析，得到了包括多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的細(xì)胞；(7)收獲上述所有細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其特 征在于所述的步驟(1)中的無(wú)菌D-hank，s液含有1000U/ml青霉素、1000U/ml鏈霉素、 100U/ml慶大霉素和2. 5ng/ml兩性霉素。
3.如權(quán)利要求2所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其特 征在于在所述的步驟(1)中，人羊膜組織用無(wú)菌D-hank’ s液浸泡1.5個(gè)小時(shí)后，再用濃 度為0. 9%的生理鹽水漂洗3次。
4.如權(quán)利要求1所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其特 征在于在所述的步驟(2)中，人羊膜在37. °C的溫度下消化15分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其特 征在于在所述的步驟(3)中，用200目細(xì)胞篩對(duì)上述溶液進(jìn)行過(guò)濾。
6.如權(quán)利要求1所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其特 征在于所述的步驟(5)中神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基每毫升含有15%的血清、200ng的Sonic hedgehog SHH、IOOng的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8、IOng的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8、200 μ M 的維生素C和20ng的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
7.如權(quán)利要求1所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其特 征在于所述的步驟(6)中的定量分析是利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記，然后 在倒置生物顯微鏡下選擇至少三個(gè)低倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，該低倍視野的倍數(shù)為10倍。
8.如權(quán)利要求1所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其特 征在于所述的步驟(4)中的體外傳代培養(yǎng)的環(huán)境是在溫度為37°C、濕度為95%和5%的 二氧化碳的孵化箱內(nèi)進(jìn)行的，步驟(5)中人羊膜上皮細(xì)胞的一代的繁殖時(shí)間為10-12天。
9.如權(quán)利要求1所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，其特 征在于所述的無(wú)菌D-hank’ s、DMEM/F12和無(wú)胎牛血清的培養(yǎng)基為市售產(chǎn)品。
10.用如權(quán)利要求1所述的從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法得到的多巴胺能神經(jīng)元來(lái)治療帕金森綜合癥的用途.
全文摘要
本發(fā)明涉及從人羊膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包括以下步驟取新鮮人胎盤，將人羊膜剝離，用生理鹽水反復(fù)沖洗除后，用無(wú)菌D-hank’s液浸泡，再用生理鹽水漂洗；將人羊膜置于0.25％胰蛋白酶溶液中，在36.5℃-37.5℃溫度下消化；用含有10％胎牛血清的DMEM/F12終止上述人羊膜在胰蛋白酶溶液中的消化，然后用細(xì)胞篩對(duì)上述溶液進(jìn)行過(guò)濾，收集得到的細(xì)胞為人羊膜上皮細(xì)胞；分離所獲得的人羊膜上皮細(xì)胞，用10％無(wú)胎牛血清的培養(yǎng)基對(duì)分離出來(lái)的上述人羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)；選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3或4或5或6代人羊膜上皮細(xì)胞，然后用神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；收獲上述多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K35/30GK101824399SQ200910079088
公開日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者蔡哲 申請(qǐng)人:中日友好醫(yī)院