專利名稱：轉(zhuǎn)移刺激因子作為新的腫瘤血管靶標(biāo)在篩選抗腫瘤藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的腫瘤血管靶標(biāo)在篩選抗腫瘤藥物中的用途，更具體地，本發(fā)明涉 及轉(zhuǎn)移刺激因子作為新的腫瘤血管靶標(biāo)在篩選抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術(shù)：
在體內(nèi)選擇性地單一靶向一個器官或疾病是人們所期望的，如對于實體瘤的治 療上。但是這個愿望在分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域很難實現(xiàn)(Jain，R. K. (1998)The next frontier of molecular medicine :delivery of therapeutics. Nature medicine 4,655-657.禾口 Dvorak, H. F. , Nagy, J. A. , and Dvorak, A.M. (1991) Structure of solid tumors and their vasculature implications fortherapy with monoclonal antibodies. Cancer Cells 3, 77-85. )0要達(dá)到這些目標(biāo)，需要更有效地和新的藥物模式和基因治療的方法 來針對已經(jīng)患有的疾病以及遺傳性疾病。Folkman等人研究表明腫瘤生長依賴于血管的 生成，這一研究使抗血管生成治療的方法得到發(fā)展。有研究表明腫瘤血管是高度特異性 的。一項全球性調(diào)查的mRNA表達(dá)的基因表達(dá)系列分析發(fā)現(xiàn)，許多差異顯著的內(nèi)皮細(xì)胞分 離出人類結(jié)腸癌(St Croix, B.，Rago, C.，Velculescu, V.，Traverso, G.，Romans，K. Ε.， Montgomery, Ε.，Lal, Α.，Riggins，G. J.，Lengauer, C.，Vogelstein，B.，and Kinzler, K. W. (2000)Genes expressed in human tumor endothelium. Science(New York，N.Y289， 1197-1202.)。最近一項研究也表明在惡性乳腺癌組織與正常組織中的內(nèi)皮細(xì)胞有差異 性基因表達(dá)(Bhati，R.，Patterson，C.，Livasy, C. A.，F(xiàn)an，C.，Ketelsen, D.，Hu, Z.， Reynolds, Ε.，Tanner，C.，Moore, D. Τ.，Gabrielli，F(xiàn).，Perou，C. Μ.，and Klauber-Demore, N. (2008)MolecularCharacterization of Human Breast Tumor Vascular Cells.The Americanjournal of pathology，1381-1390. )。Annexin I 是一種確定的消減蛋白，它可以 特異性地表達(dá)于乳腺腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，并可能成為人類乳腺癌的靶標(biāo)。(0h，P.，Li，Y.， Yu, J.，Durr, E.，Krasinska, K. M.，Carver, L Α.，Testa，J. Ε.，and Schnitzer, J. Ε. (2004) Subtractive proteomic mapping ofthe endothelial surface in lung and solid tumours for tissue-specific therapy. Nature 429，629-635·)。雖然抗血管生成治療在腫瘤治療方面是具有高度吸引力的概念，一些探針 直接結(jié)合的天然內(nèi)皮細(xì)胞表面蛋白確顯示在體內(nèi)具有組織和功能特異的藥物傳遞上 (von Mehren, Μ.，Adams，G. P.，and Weiner, L. Μ. (2003)Monoclonal antibody therapy for cancer. Annual review ofmedicine 54，343-369 ；Mcintosh，D. P.，Tan，X.Y.，Oh, P., and Schnitzer, J. E. (2002)Targeting endothelium and its dynamic caveolae fortissue-specific transcytosis in vivo :a pathway to overcome cell barriers todrug and gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 99，1996-2001·以及 Schnitzer，J. E. (1998) Vascular targeting as a strategy for cancer therapy. The New Englandjournal ofmedicine339,472-474.)。這可能是由于從腫瘤組織中分離內(nèi)皮細(xì)胞有一定的困難，并且腫瘤內(nèi)皮 細(xì)胞在體外很快就失去了它們的腫瘤特異性。因為這些特性受到局部組織微環(huán)境所發(fā) 出的信號進(jìn)行調(diào)整的，而在體外(單獨腫瘤內(nèi)皮的情況下)不能復(fù)制這些微環(huán)境(Aird， W. C.，Edelberg, J. M.，Weiler-Guettler, H.，Simmons, W. W.，Smith，Τ. W.，and Rosenberg， R. D. (1997)Vascular bed-specific expression of anendothelial cell gene is programmed by the tissue microenvironment. TheJournal of cell biology 138， 1117-1124.禾口 Durr，E.，Yu, J.，Krasinska，K. M.，Carver, L A.，Yates, J. R.，Testa， J. E.，Oh, P.，and Schnitzer, J. E. (2004) Direct proteomic mapping of the lung microvascular endothelial cellsurface in vivo and in cell culture. Nature biotechnology 22，985_992.)。此外，從腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的膜蛋白中找到靶點并進(jìn) 一步驗證其在腫瘤靶向治療臨床應(yīng)用中的效果是一項費時費力的工作。
換言之，腫瘤形成和血管重塑是復(fù)雜的過程。這個過程由表現(xiàn)為惡性細(xì)胞的生 成前因子產(chǎn)生和控制，這些惡性細(xì)胞包括在細(xì)胞外基質(zhì)中的隱藏因子，以及表達(dá)在細(xì)胞 膜上的分子，這些分子直接參與內(nèi)皮腫瘤和內(nèi)皮-細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用(Hanahm，D.， and Folkman， J. (1996)Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch duringtumorigenesis. Cell 86，353-364.)。不僅如此，宿主組織也使內(nèi)皮擁有組織特 異性表型。不同組織中的血管內(nèi)皮不僅在形態(tài)上而且在功能上不相同(Turner，R.R.， Beckstead，J. H.，Warnke, R. Α.，and Wood, G. S. (1987)Endothelial cell phenotypic diversity. In situ demonstration ofimmunologic and enzymatic heterogeneity that correlates with specificmorphologic subtypes. American journal of clinical pathology 87，569-575.禾口 Kumar，S.，West, D. C.，and Ager, A. (1987) Heterogeneity in endothelialcells from large vessels and microvessels. Differentiation ；research inbiological diversity 36, 57-70. )D個體器官或組織的血管作為器官特異性候選， 以使在特異器官中的血管通過“血管定位成為靶標(biāo)(vascularaddressing) ” (Arap, W.， Haedicke, W.，Bernasconi, M.，Kain, R.，Rajotte, D.，Krajewski, S.，Ellerby, H. M.， Bredesen, D.E. ， Pasqualini, R. ， andRuoslahti， Ε. (2002)Targeting the prostate for destruction through avascular address. Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 99，1527-1531 禾口 Izawa，J. I.，and Dinney, C.P. (2001)The role of angiogenesis in prostate and other urologic cancers areview. Cmaj 164，662-670.)。因此，不同器官的內(nèi)皮形成了一個連續(xù)的但非同種的系 統(tǒng)，此系統(tǒng)對特異性組織的血管生成啟動子/抑制子和藥物的反應(yīng)不同(Ho，M.，Ymg，Ε.， Matcuk, G.，Deng，D. , Sampas, N. , Tsalenko, Α.，Tabibiazar，R.，Zhang，Y. , Chen, Μ.，Talbi， S. , Ho, Y. D. , Wang, J.Tsao，P. S. , Ben-Dor, Α. , Yakhini, Ζ.，Bruhn，L，and Quertermous, Τ. (2003)Identification of endothelial cell genes by combined databasemining and microarray analysis. Physiological genomics 13，249-262.禾口 Campbell，S. C. (1997) Advances in angiogenesis research :relevance tourological oncology. The Journal of urology 158，1663-1674.)。作為個體器官血管的延伸，腫瘤內(nèi)皮也抑制組織特異 性(Ruoslahti, E. (2002)Specialization of tumour vasculature. Nat Rev Cancer 2， 83-90.)。然而，腫瘤特異性多數(shù)情況和腫瘤小環(huán)境相關(guān)(Aird等人，1997 ;Durr等人，2004 禾口 Khodarev，N. N.，Labay，Ε.，Darga, Τ.，Yu, J.，Mauceri，H.，Gupta，N.，Kataoka, Y.，and Weichselbaum, R. R. (2004)Endothelial cellsco-cultured with wild-type and dominant/negative p53-transfectedglioblastoma cells exhibit differential sensitivity to radiation-inducedapoptosis. International journal of cancer 109， 214-219.)。在本發(fā)明之前，有人建立了一個用HECECs直接免疫小鼠得到的抗-HECECS的抗 體庫。在體外培養(yǎng)從食管癌中提取的內(nèi)皮細(xì)胞來獲得研究所需的足夠數(shù)量的樣本，并不接 受任何治療以保證腫瘤特異性。從這個抗體庫中直接獲得了功能性和特異性抗體(Zhang， Y. , Ran, Y. , Yu, L. , Hu, H. , Zhou, Ζ. , Sun, L. , Lou, J. , and Yang, Ζ. (2006)Monoclonal antibody to humanesophageal cancer endothelium inhibits angiogenesis and tumor growth. Anticancer research 26，2963-2970.)。因此，如何在體外保持腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的腫 瘤特異性對腫瘤血管生成研究至關(guān)重要。在近期研究中，為了修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤特異性特征，采取了體外與食管腫瘤HECECs共培養(yǎng)的方法。在共培養(yǎng)的模型中，發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞相互作用的類型在腫瘤細(xì) 胞和HUVECs共培養(yǎng)的情況下，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了癌巢的形成(Khodarev，N. N.，Yu, J.，Labay, E. , Darga, Τ. , Brown, C. K. , Mauceri, H. J. , Yassari, R. , Gupta, N. , and ffeichselbaum, R. R. (2003)Tumour-endothelium interactions in co-culture :coordinatedchanges of gene expression profiles and phenotypic properties ofendothelial cells. Journal of cell science 116，1013-1022.)。而且，HECECs在發(fā)明人共培養(yǎng)的模型中比單獨培養(yǎng)的 模型中生長速度快，表達(dá)腫瘤血管生成相關(guān)分子的水平要高，其中包括VEGFR1、VEGFR2和 整聯(lián)蛋白 β 3 (Brekken, R. Α.，and Thorpe, P. Ε. (2001) VEGF-VEGF rec印torcomplexes as markers of tumor vascular endothelium. J Control Release 74,173-181.禾口 Liu, W., Ahmad, S. A. ， Reinmuth, N. ， Shaheen, R. Μ. ， Jung, Y. D. ， Fan, F. ， and Ellis, L. Μ. (2000) Endothelial cell survival and apoptosisin the tumor vasculature. Apoptosis 5, 323-328.)。這些證據(jù)證明共培養(yǎng)模型可以模仿腫瘤微環(huán)境，并且可以在形態(tài)和功能學(xué)兩個 方面修復(fù)HECECs的腫瘤特異性表型。之后，可以使用腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠建立功能性單 克隆抗體庫。轉(zhuǎn)移刺激因子(Migration Stimulating Factor, MSF)是纖維結(jié)合蛋白的一個亞 型。纖維結(jié)合蛋白是一種糖蛋白，具有多種結(jié)合功能域，可與某些整合素家族成員結(jié)合，是 一種非常重要的胞外基質(zhì)大分子(Pankov，R.，and Yamada, K. Μ. (2002)Fibronectin at a glance. Journalof cell science 115,3861-3863 禾口 Magnusson, Μ. K. , and Mosher, D.F. (1998)Fibronectin -structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 18,1363-1370·)。纖維結(jié)合蛋 白與ECM間接地發(fā)生相互作用，并且在細(xì)胞黏附、侵襲、生長、分化中有極其重要的作用 (Pankov等人，2002和Magnusson等人，1998)。纖維結(jié)合蛋白在過去20年的研究中被認(rèn) 為是非常復(fù)雜的蛋白，就像EDA、EDB—樣。這些亞型可以作為腫瘤新生血管的標(biāo)志，并 且可以應(yīng)用在腫瘤抗血管治療中(Rybak, J. N.，Roesli, C.，Kaspar，M.，Villa, Α.，and Neri, D. (2007)The extra-domain A of fibronectin is avascular marker of solid tumors and metastases. Cancer research 67,10948-10957. ；Berndorff, D. ,Borkowski, S. , Moosmayer, D. , Viti, F. , Muller-Tiemann, B. , Sieger, S. , Friebe, Μ. , Hilger, C. S.,Zardi, L. , Neri, D. , and Dinkelborg, L. Μ. (2006)Imaging of tumor angiogenesis using99mTc-labeled human recombinant anti-ED-B fibronectin antibodyfragments. J Nucl Med 47，1707—1716.禾口Berndorff，D.，Borkowski，S. ,Sieger,S. ,Rother,A.，F(xiàn)riebe， Μ. , Viti, F. , Hilger, C. S. , Cyr, J. Ε. , andDinkelborg, L. M. (2005)Radioimmunotherapy of solid tumors bytargeting extra domain B fibronectin !identification of the best-suitedradioimmunoconjugate. Clin Cancer Res 11, 7053s_7063s.)。MSF 被石角定 在胎兒和腫瘤病人成纖維細(xì)胞中，很少表達(dá)在正常成人組織中(Schor，S.L.，and Schor, Α. Μ. (2001)Phenotypic and genetic alterations inmammary stroma !implications for tumour progression. Breast Cancer Res3,373-379.禾口 Schor, S.L. , Schor, Α. Μ., Grey,Α. Μ. ,and Rushton,G. (1988)Foetal and cancer patient fibroblasts produce an autocrinemigration-stimulating factor not made by normal adult cells. Journal of cellscience 90 (Pt 3)，391-399.)。雖然MSF可能參與血管生成，但是很少有直接的證據(jù) 來支持這種分子在腫瘤相關(guān)血管生成中發(fā)揮作用的觀點。

發(fā)明內(nèi)容
因此，一方面，本發(fā)明的目的在于提供轉(zhuǎn)移刺激因子作為新的腫瘤血管靶標(biāo)在篩 選抗腫瘤藥物中的用途。優(yōu)選地，所述腫瘤是食管鱗狀細(xì)胞癌。優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物的 主要成分為對轉(zhuǎn)移刺激因子特異的單克隆抗體，更有選地，所述單克隆抗體是1D2。另一方 面，本發(fā)明的目的也在于提供一種特異于轉(zhuǎn)移刺激因子的單克隆抗體1D2及其在制備抗腫 瘤藥物中的用途。本發(fā)明涉及的單克隆抗體1D2，已于2006年7月5日保藏在CGMCC，其由保藏號為 CGMCC No. 1749的小鼠雜交瘤細(xì)胞系HECEC1D2產(chǎn)生。換言之，本發(fā)明利用從腫瘤組織中分離的人類食管癌內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng) 維持其腫瘤特異性表型，之后，使用腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠建立了功能性單克隆抗體庫，隨 后，利用抗體庫技術(shù)篩選出了抗HECECs的功能性抗體1D2，從抗體庫所篩選的單克隆抗體 1D2特異地識別內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原，并且此抗原經(jīng)過免疫共沉淀以及質(zhì)譜進(jìn)行分析，確定為 纖維連接蛋白的一個亞類-轉(zhuǎn)移刺激因子(MSF)，實驗證明1D2抗體能抑制HECECS在纖維 結(jié)合蛋白I(FNl)中的轉(zhuǎn)移和粘附。因此，MSF可以作為針對腫瘤血管瘤的抗血管生成的治 療靶點，利用其特異性單克隆抗體可以針對MSF進(jìn)行腫瘤的抗血管生成治療。


圖1 顯示共培養(yǎng)后HECEC(食管癌內(nèi)皮)細(xì)胞恢復(fù)了其腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的特性。A HECEC細(xì)胞與KYSE150細(xì)胞共培養(yǎng)。共培養(yǎng)三天后，HECEC細(xì)胞開始環(huán)繞腫瘤細(xì)胞生長。6 天后，腫瘤細(xì)胞形成的癌巢被HECEC細(xì)胞包繞。箭頭指向癌細(xì)胞巢，三角指向HECEC細(xì)胞。 B :HECEC細(xì)胞數(shù)量。HECEC細(xì)胞分別在共培養(yǎng)模式下，單獨培養(yǎng)模式(普通培養(yǎng)基或腫瘤條 件培養(yǎng)基)培養(yǎng)后計數(shù)細(xì)胞數(shù)量。C:免疫細(xì)胞化學(xué)檢測活化內(nèi)皮相關(guān)分子。上一排顯示單 獨培養(yǎng)的HECEC細(xì)胞，下一排顯示共培養(yǎng)的HECEC細(xì)胞。星號表示有統(tǒng)計學(xué)差異。圖2 顯示HECEC細(xì)胞的行為被小鼠免疫血清所干擾。A =HECEC細(xì)胞的增殖被用 HECEC細(xì)胞免疫的小鼠血清所抑制。左圖不同稀釋度下，免疫的小鼠血清對HECEC細(xì)胞增殖的抑制情況。右圖1 200的稀釋度下，3號免疫小鼠血清對HECEC細(xì)胞增殖的抑制情況。以未免疫的小鼠血清和PBS作對照。B 1 200的稀釋度下，免疫小鼠血清對HECEC細(xì) 胞成管的抑制情況。C:，1 200的稀釋度下，免疫小鼠血清對HECEC細(xì)胞遷移的抑制情 況。D:1 200的稀釋度下，免疫小鼠血清對HECEC細(xì)胞黏附的抑制情況。腫瘤細(xì)胞以綠 色熒光標(biāo)記。星號表示有統(tǒng)計學(xué)差異。圖3 顯示用抗HECEC細(xì)胞的功能性抗體庫篩選HECEC細(xì)胞的表面蛋白抗原。A 一株單克隆抗體與HECEC細(xì)胞，正常食管內(nèi)皮細(xì)胞，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的反 應(yīng)情況。B :1D2,15D10，6A2單抗與食管癌組織的免疫組化反應(yīng)情況。C 未通透HECEC細(xì)胞 的雙色免疫熒光反應(yīng)。左邊是與α微管蛋白抗體的免疫熒光反應(yīng)，為陰性。中間是與1D2 抗體的免疫熒光反應(yīng)。右邊是擬合的圖像。D=HECEC細(xì)胞的行為被識別HECEC細(xì)胞膜蛋白 的單抗所干擾。抑制率低于0表示促進(jìn)的效率。圖4:顯示MSF被鑒定為1D2單抗的抗原。A 1D2抗原的分子量為70Kd。左圖1D2 單抗免疫沉淀蛋白的銀染結(jié)果，右圖HECEC細(xì)胞蛋白的1D2抗體免疫印跡結(jié)果。B =MSF蛋 白的氨基酸序列。下劃線的序列代表被質(zhì)譜檢測到的序列。C:二級質(zhì)譜測定的代表性序列 的質(zhì)譜圖(B圖中劃綠線的序列)，其序列是GNLLQCICTGNGR，為MSF分子C端13位氨基酸 序列。圖5 顯示MSF參與食管癌血管形成。A 在纖維結(jié)合蛋白膠原上的劃痕遷移實驗。 1D2抗體以劑量依賴的方式抑制HECEC細(xì)胞的遷移。B 在transwell小室中的穿過纖維結(jié) 合蛋白膠原遷移實驗。1D2抗體以劑量依賴的方式抑制HECEC細(xì)胞的遷移。C=HECEC細(xì)胞 對纖維結(jié)合蛋白膠原的黏附試驗，1D2抗體以劑量依賴的方式抑制HECEC細(xì)胞的黏附。星號 表示有統(tǒng)計學(xué)差異。圖6 顯示1D2抗體特異的靶向具有人源化血管的KYSE150細(xì)胞移植瘤。A 荷瘤 老鼠尾靜脈注射標(biāo)記抗體后觀察腫瘤放射％ ID/g的變化。B:荷瘤老鼠尾靜脈注射標(biāo)記抗 體后觀察T/NT(腫瘤/正常組織放射活性比)的變化。C和D 荷瘤老鼠gamma閃爍成像。 放射自顯影的結(jié)果顯色隨著時間變化，1D2抗體在腫瘤局部逐漸濃聚(C圖)，對照抗體不能 在腫瘤局部逐漸濃聚(D圖)。圖7 顯示1D2抗體通過抑制血管形成顯著抑制腫瘤的生長。A :1D2抗體顯著抑制 腫瘤的生長。左圖鼠背上的腫瘤圖像，右圖各個研究組的老鼠腫瘤生長曲線。B:腫瘤移 植29天后各組老鼠腫瘤瘤腫。C:在鼠IgG和1D2高劑量組的腫瘤中血管密度情況。腫瘤 中總血管由抗⑶31抗體顯示，人血管由抗人⑶31抗體顯示。D 各組中血管密度的統(tǒng)計學(xué) 分析。1D2治療組中人血管密度顯著降低，鼠血管密度沒有明顯變化。星號表示有統(tǒng)計學(xué)差
巳
具體實施例方式本發(fā)明使用上述的共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠得到抗HECECs的單克隆抗體，然 后通過功能蛋白組學(xué)篩選細(xì)胞表面的異性抗原。類似的辦法，這種蛋白篩選也適用于確 定己知基因新的功會邑(Eustace，B. K.，Sakurai, T.，Stewart, J. K.，Yimlamai, D.，Unger, C.，Zehetmeier, C.，Lain，B.，Torella, C.，Henning, S. W.，Beste, G.，Scroggins, B. T.， Neckers, L，Ilag, LL，and Jay, D. G. (2004)Functional proteomic screens revealanessential extracellular role for hsp90 alpha in cancer cell invasiveness. Nature cell biology 6，507-514.禾口 Hauptschein，R. S.，Sloan，K. E.，Torella，C.， Moezzifard, R.，Giel-Moloney, Μ.，Zehetmeier, C.，Unger, C.，Ilag，L. L.，and Jay, D.G. (2005)Functional proteomic screen identifies amodulating role for CD44 in death receptor-mediated apoptosis· Cancerresearch 65，1887-1896·)。本發(fā)明通過檢 查血清免疫功能的皮外實驗修改了這種方法。血清阻止內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，這證明血 清中也存在功能性單抗。發(fā)明人免疫了 5只小鼠，最后選擇了 3號小鼠，因為它的血清抗 HECECs細(xì)胞血管生成的作用比較顯著。發(fā)明人用它建立了單克隆抗體庫。這個抗體庫所建立的功能性單克隆抗體遠(yuǎn)多于 其余小鼠所建立的抗體庫。之后，運用功能性蛋白組學(xué)鑒定，證明發(fā)明人所建立的功能性單 克隆抗體庫所針對的細(xì)胞表面抗原均與腫瘤血管生成有關(guān)。這些單克隆抗體均經(jīng)過了多次免疫組化和免疫細(xì)胞化學(xué)的分析，這些實驗主要是基于食管癌內(nèi)皮細(xì)胞被選定為細(xì)胞表面抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)和功能的分析。經(jīng)過這種篩查以 后，單克隆抗體專門針對功能性的HECECs所被選定的抗原。經(jīng)過免疫沉淀和質(zhì)譜分析，證實1D2單克隆抗體所結(jié)合的抗原為MSF，是基因截斷 腫瘤胎兒纖維亞型(Schor, S. L.，Ellis, I. R.，Jones, S. J.，Baillie, R.，Seneviratne, K. , Clausen, J. , Motegi, K. , Vojtesek, B. , Kankova, K. , Furrie, Ε. , Sales, Μ. J. , Schor, Α. Μ. , and Kay, R. Α. (2003)Migration-stimulating factor :a genetically truncated onco-fetal fibronectinisoform expressed by carcinoma and tumor-associated stromal cells. Cancer research 63,8827-8836.)。在本研究中，發(fā)明人證明，MSF 在食管 癌血管內(nèi)皮細(xì)胞中以及腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞表達(dá)比較強(qiáng)烈。然而，1D2單克隆抗體不能擾亂 HECECs在基質(zhì)膠或膠原蛋白I中的侵襲和黏附。MSF是與FN的N末端70_KDa高度同源的 片段。它是FN與細(xì)胞表面相互作用的媒介物，并且在FN分子與ECM形成二硫鍵并形成多 聚物的過程中發(fā)揮啟動作用，而且在細(xì)胞外基質(zhì)中影響細(xì)胞的形態(tài)和功能。發(fā)明人添加纖 維結(jié)合蛋白1到間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)1D2抗體可以顯著抑制HECECs在間質(zhì)中的侵襲與粘附。gamma影像成像分布分析顯示，1D2在體內(nèi)可以特異地靶向食管癌血管內(nèi)皮細(xì)胞， 故1D2可以快速特異地結(jié)合食管癌包括血管。最后發(fā)明人檢測了靶向MSF的抗體在體內(nèi)的 潛在功能。1D2單抗對腫瘤生長的抑制率可以達(dá)到70%。發(fā)明人的治療組在腫瘤體積增長到0. 2mm3及腫瘤脈管系統(tǒng)可以被發(fā)現(xiàn)的時候進(jìn) 行治療，平均可以抑制57%的腫瘤生長。當(dāng)注射劑量增加到10mg/kg的時候發(fā)明人沒有觀 測到其對小鼠有任何的影響。因此，最大耐藥量高于10mg/kg。發(fā)明人同時發(fā)現(xiàn)治療組的血 管密度顯著低于對照組，降低脈管系統(tǒng)形成的原因可能是抑制了人類血管的形成而不是鼠 的。發(fā)明人推論，治療的顯著效果是抑制了人類腫瘤的脈管形成系統(tǒng)。綜上所述，發(fā)明人通過對腫瘤相關(guān)血管生成的功能性單克隆抗體的篩選建立了抗 體庫來對腫瘤進(jìn)行靶向治療。通過這個平臺，發(fā)明人找到功能性單抗可以特異靶向腫瘤內(nèi) 皮細(xì)胞。MSF被證明是針對食管癌血管生成的靶點。針對MSF的單克隆抗體在抗腫瘤血管 生成中是非常有效的。本發(fā)明將在下文通過具體的實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明的核心內(nèi)容，所述實施例闡 述本發(fā)明的概念和幾個優(yōu)選的實施方案。本發(fā)明的其它實施例在不背離本發(fā)明的核心的前提下為本領(lǐng)域技術(shù)人員所預(yù)見。 實施例實施例1組織標(biāo)本新鮮食管癌組織及配對正常組織標(biāo)本由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科從外科 切除病人組織中分離。腫瘤組織及其配對正常組織標(biāo)本來源于同一個病人，經(jīng)過病理學(xué)家 鑒定，保存于-70 V備用，并且之前該病人未經(jīng)過任何手術(shù)治療。實施例2人組織中分離內(nèi)皮細(xì)胞人食管癌內(nèi)皮細(xì)胞(HECECs)由食管鱗狀細(xì)胞癌組織中分離，并且在手術(shù)切除30 分鐘內(nèi)獲得。將該組織在 BSA (Sigma，St. Louis,MO, USA) /Hanks (Gibco BRL, Gaithersburg, MD,USA)中清洗并研磨。之后將組織置于膠原酶中在37°C條件下消化2小時。細(xì)胞依次經(jīng) 過400目及100目篩網(wǎng)篩選，并置于25% Percoll (Sigma)/D-MEM(Gibco)培養(yǎng)基中，800g 離心 15 分鐘。所得細(xì)胞在含有 100μ g/ml ECGS(Sigma)，15% FBS(Hyclone Labs. ,Logan, UT, USA)的D-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板使用前用2%明膠包被。2_3天后，大約有 50%的匯合，用磁力珠子(Miltenyi Biotec, Gmbh, Bergisch Gladbach, Germany)及 CD31 抗體聯(lián)合吸附內(nèi)皮細(xì)胞。用D-MEM培養(yǎng)基把細(xì)胞從珠子上洗脫，共計洗滌3次。用IOmM EDTA/0. 胰蛋白酶(Gibco)對細(xì)胞結(jié)合在磁力珠子上的亞成分進(jìn)行處理，用D-MEM培養(yǎng) 液洗滌，再用ECECs對結(jié)合在磁力珠子上的亞成分進(jìn)行純化，共重復(fù)3次。最后，人食管癌 內(nèi)皮細(xì)胞采用含有10% FBS, 100 μ g/ml內(nèi)皮生長添加物(ECGS)的D-MEM培養(yǎng)基在37°C， 5%0)2的條件下培養(yǎng)于2%明膠包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。人食管正常內(nèi)皮細(xì)胞(HENECs) 分離方法及步驟同上。實施例3細(xì)胞培養(yǎng)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(KYSE150)培養(yǎng)在含有10 % FBS的MEM培養(yǎng)基中 (Gibco)。人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)培養(yǎng)在含有10% FBS的D-MEM培養(yǎng)基中(Yang，H.， Majno, P. , Morel, P. , Toso, C. , Triponez, F. , Oberholzer, J. , Mentha, G. , and Lou, J. (2002)Prostaglandin E(I)protectshuman liver sinusoidal endothelial cell from apoptosis induced by hypoxiareoxygenation. Microvascular research 64，94—103·)。 HECECs，HENECs，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs，CASCADE C-003-5C)均培養(yǎng)在活化內(nèi)皮培養(yǎng)液 中，該培養(yǎng)液含有10 % FBS, 100 μ g/ml ECGS的D-MEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶使用前用 2%明膠包被。在開始實驗前HENECs，HUVECs，LSECs需要在含有10% FBS的D-MEM培養(yǎng)基 中培養(yǎng)3天使其恢復(fù)靜止?fàn)顟B(tài)。 將1 X IO4HECEC和1 X IO4KYSE 150s混合接種于6孔板，培養(yǎng)7天。同時，將 1 X IO4HECECs和KYSE150s分別在沒有腫瘤培養(yǎng)基的條件下單獨培養(yǎng)進(jìn)行對照。這兩組細(xì) 胞都在含有10% FBS, 100 μ g/mlECGS的D-MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶使用前用 2%明膠包被。實施例4細(xì)胞免疫化學(xué)內(nèi)皮細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，用PBS洗滌3次。加入含有丙酮甲醛(50 50v/ ν)的固定液，固定15分鐘。用含有3% H2O2的PBS阻斷內(nèi)生過氧化物酶的活性，然后加 入10%山羊血清在37°C條件下孵育30分鐘。加入一抗1 100稀釋度的VEGFRl抗體(Sigma) ；1 200稀釋度的VEGFR2抗體(Sigma) ；1 200稀釋度的整合素β3抗體 (Chemicon, Temecula, CA)，在4°C條件下孵育45分鐘，PBS洗滌3次，然后加入生物素標(biāo)記 的二抗。用常規(guī)的生物素聯(lián)合過氧化物酶、DAB(Dak0，Carpinteria，CA)染色進(jìn)行觀察。實施例5細(xì)胞計數(shù)和增殖分析把共同培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)的細(xì)胞的三組細(xì)胞用胰蛋白酶消化，懸浮于PBS中，用顯 微鏡放大100倍進(jìn)行計數(shù)。HECEC細(xì)胞與KYSE150細(xì)胞共同培養(yǎng)的一組加入抗FactorVIII 抗體標(biāo)記的一抗(Dako)和FITC標(biāo)記的二抗。用流式細(xì)胞檢測儀分析在三種方法中內(nèi)皮細(xì) 胞所占共培養(yǎng)模型的比率。用流式細(xì)胞檢測儀分析單獨培養(yǎng)KYSE150細(xì)胞作為對照。用內(nèi) 皮細(xì)胞所占比率乘以總細(xì)胞數(shù)量為內(nèi)皮細(xì)胞在共培養(yǎng)模型中的細(xì)胞數(shù)。按照CCK-8試劑盒 說明書并在450/655nm紫外光下測定活細(xì)胞數(shù)量，并重復(fù)兩次進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞增殖鑒定。實施例6用共培養(yǎng)HECECs細(xì)胞免疫小鼠建立功能性抗體庫用HECEC細(xì)胞免疫小鼠制備單克隆抗體庫方法參見參考文獻(xiàn)(Harlow，E. & Lane， D. (1988)Antibodies :A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.)，采用SouthernBiotech的單抗亞類檢測試劑盒測定待測單抗的亞類。 內(nèi)皮表面的抗原與抗體反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞用多聚甲醛固定，并且用雜交瘤上清進(jìn)行免疫細(xì)胞 學(xué)檢測。具體步驟如下。通過選擇性消化將共培養(yǎng)HECECs和KYSE150s從內(nèi)皮細(xì)胞和瘤細(xì)胞的混合物中分 離出來后，立即對5只小鼠進(jìn)行免疫。接受免疫12個月后，從接受免疫的小鼠體內(nèi)抽取血 清做功能性鑒定。3號小鼠的血清在體外功能實驗分析中表現(xiàn)的抑制血管增生的功能最強(qiáng)。 成量效關(guān)系如圖2A所示，3號小鼠的血清在抑制HECEC細(xì)胞生長方面最為有效。發(fā)明人在 后面的功能性實驗中選擇的血清檢測中提示抑制增生效果最好進(jìn)行研究，也就是3號和5 號小鼠。以1 200比例稀釋的免疫血清就可以表現(xiàn)出極高的抑制能力，而以同等比例稀 釋的普通血清對抑制HECECs的增殖作用明顯。所以發(fā)明人在做下面的功能性分析時選擇 了 1 200的稀釋比例。根據(jù)對增殖實驗的分析，實驗中取自3號小鼠的血清比取自5號 小鼠的血清表現(xiàn)出更高的抑制率，包括了體外功能分析實驗，HECECs在基質(zhì)膠的轉(zhuǎn)移實驗 和HECECs與KYSE150細(xì)胞的粘附實驗。由于抗體不能通過細(xì)胞膜，必須由功能性抗體結(jié)合 血清中的HECECs細(xì)胞表面抗原。因此，源于這些免疫小鼠的抗體庫應(yīng)該含有功能性抗體， 這種抗體能抑制HECECs的血管生成。從而建立了由SP2/0細(xì)胞和3號小鼠的脾細(xì)胞相互 融合的包括2021株單克隆抗體(mAbs)的抗體庫。實施例7活細(xì)胞表面免疫熒光分析細(xì)胞依次加入以下抗體進(jìn)行孵育單克隆抗體庫中的抗體(10yg/ml)；兔 抗-α-微管蛋白抗體(5yg/ml, Sigma)；分別加入FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG和Cy3標(biāo)記羊抗 兔IgGCJackson ImmunoResearch)進(jìn)行標(biāo)記，最后用含有DAPI的熒光封片劑進(jìn)行封閉，在 熒光顯微鏡(Nikon)下進(jìn)行觀察。 實施例8免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)觀察分析食管癌組織和移植瘤連續(xù)組化切片。采用SP法。一抗加 入單克隆抗體(10μ g/ml)；抗⑶31抗體(人和小鼠共同反應(yīng)，Abcam，Cambridge, UK)采 用1 200稀釋度；抗huCD31抗體(只與人反應(yīng)，Zymed, South San Francisco, CA)采用 1 100稀釋度。操作程序嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。
采用抗體庫技術(shù)對抗HECECs功能性抗體進(jìn)行篩選發(fā)明人用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法篩選與HECECs反應(yīng)特異的，而與其他內(nèi)皮不反應(yīng) 的單克隆抗體。一共有296株單克隆抗體與HECECs、ENECs、LESCs、HUVECs反應(yīng)。其中有 60株單抗特異的與HECECs反應(yīng)。圖3A是單抗與不同內(nèi)皮細(xì)胞相互反應(yīng)的免疫細(xì)胞化學(xué) 結(jié)果。發(fā)明人用免疫組化的方法分析這60株單抗在人食管癌組織和正常組織之間的差異。 有47株單抗在癌組織或正常組織中有表達(dá)。17株單抗在食管癌的血管表達(dá)中明顯高于正 常食管血管的表達(dá)情況。然而有5株抗體于癌組織中新生血管和腫瘤細(xì)胞均有明顯陽性反 應(yīng)。圖3B顯示抗體與癌組織反應(yīng)的免疫組化結(jié)果。
發(fā)明人隨后對于HECEC細(xì)胞表面抗原相結(jié)合的17株抗體進(jìn)行篩選。采用雙染法 對這些株單抗和抗α-微管蛋白抗體進(jìn)行染色。α-微管蛋白抗體染色用來證明這些單抗 沒有通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)(20)。其中9株抗體識別HECEC細(xì)胞表面抗原(圖3C)，發(fā)明人 用這9株抗體進(jìn)行功能性分析。用正常小鼠IgG作為對照，通過粘附、轉(zhuǎn)移、血管形成實驗 對這9株抗體進(jìn)行篩選(圖3D)。其中2F7、10B8、15H10、6A2具有抗粘附能力；2E3具有抗 轉(zhuǎn)移能力；15H10、2E3具有抗血管形成能力(抑制率彡20% ),1D2同時具有較強(qiáng)的抗轉(zhuǎn)移 能力和抗血管形成能力，因此，1D2為最終選定的抗HECECs的功能性抗體。將產(chǎn)生1D2的雜 交瘤細(xì)胞系命名為HECEC1D2，并于2006年7月5日保藏到中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC), 保藏號為 CGMCCNo. 1749。實施例9蛋白質(zhì)免疫印跡檢測用RIPA(50mM Tris pH 7. 4,150mM NaCl, 1 % NP-40,1 % TritonX-100,0. 1% SDS, 0. 5% sodium deoxycholate)緩沖液加入蛋白抑制劑(Sigma)提取HECEC蛋白。以1D2 為探針在封閉的PVDF膜上進(jìn)行雜交，加入二抗辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育，ECL發(fā)光試劑盒 (Applygen，中國，北京)顯影。實施例10免疫沉淀反應(yīng)和質(zhì)譜分析用RIPA緩沖液加入0. 02% (w/v)NaN3和蛋白酶抑制劑裂解HECEC細(xì)胞。用1D2 抗體在提取的細(xì)胞蛋白中進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，免疫沉淀復(fù)合物在SDS-PAGE分離后進(jìn)行銀 染顯色。從銀染的PAGE膠中挖取相應(yīng)蛋白條帶，脫色后用胰蛋白酶進(jìn)行消化。消化下來的 肽放入C18RP毛細(xì)管(內(nèi)徑為100X0. 17mm)中，加入緩沖液A(0. 1 %體積的甲酸和99. 9% 體積的ACN)。該肽在5 % -30 %的緩沖液B (0. 1 %體積的甲酸和99. 9 %體積的ACN)中洗 提，流動速率為2μ 7π η，共3小時。質(zhì)譜分析是用裝配有微電噴霧源的LCQ Deca XP+ion trap質(zhì)譜分光儀(Thermo Fisher ；San Jose, CA)進(jìn)行分析。操作工程中測量HPLC泵和質(zhì)譜分光儀在Xcalibur 1.3系統(tǒng)控制下全自動進(jìn)行。一次全掃描(m/Z400 to 1500)的連續(xù)循環(huán)在35%標(biāo)準(zhǔn) 碰撞能量的條件下進(jìn)行5次數(shù)據(jù)相關(guān)MS/MS測量，測量被允許的激活排除清單為25m/z values (士 1. 5Da)，最長時限為3分鐘。MS/MS分析光譜提取RAW文件，規(guī)定最低限度為50信號，強(qiáng)度至少為1 X IO5單位。 提取MS/MS分析光譜自動分配到最佳匹配的多肽序列是使用SEQUEST算法和SEQUEST瀏覽 器軟件包，Bioworks3. 1 (Thermo Fisher)。SEQUEST搜查的實現(xiàn)是通過個人電腦對IPI人類蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(V3.28)中的68043項下載fasta格式的序列進(jìn)行分析，歐洲生物信息學(xué)研究所(http://www. ebi.ac.uk/IPI/)。為提高搜索速度，蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)作處理，以 創(chuàng)造一個二進(jìn)制數(shù)據(jù)庫包含所有可能的胰蛋白酶肽。錯過了一個胰蛋白酶裂解位點是允許 的，+57Da半胱氨酸殘基靜態(tài)的修正和+16Da的蛋氨酸殘基變量的修正在考慮之列。前體 離子和碎片離子質(zhì)譜容錯度分別為1. 4Da和1. 5Da。SEQUEST 標(biāo)準(zhǔn)制定如下(I)DeltaCn 得分至少 0.1 (2) Rsp 為 1(3) Xcorr≥1. 9for+l被控多肽；Xcorr≥2. 2for+2,伴有完全或部分的胰蛋白酶末端； Xcorr ≥3. Ofor+2，不伴有末端殘基；Xcorr ≥ 3. 75for+3被控多肽。結(jié)果如下用western blotting和SDS-PAGE免疫沉淀測定1D2抗體所識別的抗原相對分子 量為70kDa(圖4A)。用膠原酶消化凝膠電泳中的蛋白條帶，這個抗原多肽用離子阱電噴霧 質(zhì)譜分析儀進(jìn)行分析母離子從總離子色譜圖中被選出經(jīng)過MS/MS從碎片中從頭分析。多 肽結(jié)果顯示序列如(圖4C)，證實此為纖維結(jié)合蛋白的一個亞型(IPI :IPI00411462)，為轉(zhuǎn) 移刺激因子(MSF)。MSF的理論分子量為72kDa，并經(jīng)過western blotting和SDS-PAGE檢 測，MSF序列圖譜見(圖4B)。實施例11體外功能實驗分析用50 μ L混合FN的預(yù)冷的基質(zhì)膠包被96孔板。將2 X IO4HECECs懸浮于100 μ L 不同濃度梯度的mAb 1D2或正常鼠IgG，加入胞間質(zhì)，37°C培養(yǎng)6小時。已經(jīng)進(jìn)行的功能性篩選顯示單克隆抗體1D2在HECECs的轉(zhuǎn)移，粘附和血管形成中 沒有作用。但是有文獻(xiàn)報道(Pankov等人，2002和Magnusson等人，1998)纖維結(jié)合蛋白始 終適應(yīng)同質(zhì)或異質(zhì)聚合物參加在細(xì)胞外基質(zhì)與內(nèi)皮的相互作用。所以，重新設(shè)計體外功能 實驗探討MSF在HECECs血管形成中的作用。1D2抗體不能抑制HECECs在基質(zhì)膠或膠原蛋 白I的轉(zhuǎn)移和粘附能力。但是，如果HECECs在纖維結(jié)合蛋白1中培養(yǎng)，1D2抗體對其轉(zhuǎn)移 和粘附能力的抑制呈劑量依賴關(guān)系。劃痕實驗證明培養(yǎng)基中加入一定量的1D2抗體可以使 HECECS的轉(zhuǎn)移能力能力明顯降低，所用培養(yǎng)板先包被一層纖維結(jié)合蛋白1(圖5A)。細(xì)胞 遷移實驗證明在包被有纖維結(jié)合蛋白1的聚碳酸脂薄膜中，1D2抗體可以明顯抑制HECECs 穿過薄膜向底層小室遷移(圖5B)。計算了在培養(yǎng)基中加入不同濃度的1D2抗體的條件下 HECECs與Fm的粘附能力。結(jié)果顯示增加HECECs與基質(zhì)的粘附可以抑制細(xì)胞遷移。如圖 5C所示，1D2也能抑制HECECs與FNl的粘附。然而用1D2抗體中和MSF后不能影響HECECs 在含F(xiàn)Nl的基質(zhì)中的血管形成能力。人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞系(HSLEC)表面較少表達(dá)MSF，作為對 照進(jìn)行實驗分析。1D2不能干擾HSLECs在FN基質(zhì)中的功能(數(shù)據(jù)隱去)因此，MSF與FNl 聯(lián)合可以促進(jìn)人源化血管的形成。實施例12腫瘤模型裸鼠(BALB/cnu/nu,雌性，5 周)購于 Jackson 研究所(Vitalriver，中國)。 腫瘤模型建立方法見參考文獻(xiàn)(Hu, H，Zhang, Y.，Ran, Y.，Zhou, Ζ.，Yu, L.，Lou, J.，and Yang, Ζ. (2007)Human esophageal cancerendothelial cells increase tumor growth by incorporating with mouseendothelium. Cancer Lett, 123—130.)。 IX IO6 月中瘤細(xì)胞 KYSE150s混合4X IO6HECECs接種于裸鼠右后位皮下，進(jìn)行生物分布分析，伽瑪射線顯像和 使用1D2抗體進(jìn)行體內(nèi)抑瘤實驗。在體內(nèi)模型中，在小鼠血管的協(xié)作下，HECECs形成了人類腫瘤脈管系統(tǒng)。我們利用這個模型鑒定1D2抗體在體內(nèi)靶向治療人源化血管的能力。實施例13生物分布分析1D2抗體或正常鼠抗體聯(lián)合99mTc(17)。生物分布分析方法見參考文獻(xiàn) (Arulsudar, N. , Subramanian, N. , Mishra, P. , Chuttani, K. , Sharma, R. K. , and Murthy, R. S. (2004)Preparation, characterization, andbiodistribution study of technetium-99m_labeled leuprolide acetate—loadedliposomes in Ehrlich ascites tumor-bearing mice. AAPS pharmSci 6，E5.)。荷瘤小鼠麻醉并經(jīng)尾靜脈注射99mTc標(biāo)記的 抗體(2 μ g IgG 60 μ Ci/μ g)。切開胸廓，心臟穿刺取血液標(biāo)本，每4小時和24小時取出 組織器官進(jìn)行"mTc標(biāo)記抗體的生物分布分析，監(jiān)測每克注射劑量的百分比(％ ID/g)和腫 瘤與正常組織的比率(T/NT)。組織分離并用生理鹽水洗滌，稱重，用閃爍法測量伽瑪射線放 射性強(qiáng)度。結(jié)果表明，當(dāng)％ ID/g在正常組織和血液中隨著時間而降低時，％ ID/g在腫瘤 組織中增高。在注射24小時以后，大多數(shù)正常組織中％ ID/g在血中的含量明顯低于腫瘤 組織中的含量。％ ID/g在血液中的含量比在腫瘤中的含量大概高出26%。這種結(jié)果可能 歸因于1D2在小鼠體內(nèi)的半衰期。％ ID/g在腎中的的含量顯著高于腫瘤組織，這可能是由 于在腎臟中經(jīng)過過濾作用"Te與1D2分離。T/NT表明，腫瘤特異性靶向單克隆抗體ld2在 體內(nèi)持續(xù)上升超過了 24小時(圖6A，B)。
實施例14伽瑪射線顯像荷瘤小鼠經(jīng)尾靜脈注射"mTc標(biāo)記的抗體(360yCi，12yg).分別注射99mTc標(biāo)記 的1D2抗體(360 μ Ci, 12 μ g) ；0. 6mg冷的1D2抗體或mIgG(沒有"mTc標(biāo)記)作為對照。 分別在注射后2小時，4小時和24小時將小鼠固定在板子上利用單光子發(fā)射計算機(jī)斷層 (SPECT.，LC75-005, Diacam, Siemens, USA)伽瑪照相機(jī)進(jìn)行觀察(如圖6C所示)?？梢娦?生物分布顯示出瘤內(nèi)lD2mAb的積聚程度。含用放射性同位素99Te標(biāo)記的lD2mAb可以靶 向抑制腫瘤，原因是由于與超過7. 5-fold的lD2mAb競爭，而不是被普通小鼠IgG抑制(數(shù) 據(jù)隱去)。實施例15體內(nèi)抑瘤實驗按每只雌性BALB/c 裸鼠(ffeitonglihua Biotechnology,北京，中國)(η = 30， 5-6周)，接種4Χ IO6個HECECs和1. 5 X IO6個KYSE150s細(xì)胞，兩種細(xì)胞充分混合后，接 種于皮下。將30只裸鼠隨機(jī)分成5組，每組6只，當(dāng)腫瘤直徑為2-5mm時，其中4組分別 按以下要求進(jìn)行靜脈注射(i)高劑量抗體mAb lD2(10mg/kg)治療(ii)低劑量抗體mAb 1D2 (2. 5mg/kg)治療(iii)正常mlgG(10mg/kg)對照組(iv)PBS對照組。注射第一周每天 1次，連續(xù)5天；以后每周2次，連續(xù)2周。另外一組六只小鼠當(dāng)腫瘤平均直徑達(dá)到8mm時 注射10mg/kg，mAb 1D2抗體。再把6只BALB/c裸鼠分成一組作為陰性對照，每只裸鼠接種 1. 5X106KYSE150s細(xì)胞，并且不經(jīng)過任何治療。觀察到裸鼠成瘤后，每周兩次用游標(biāo)卡尺量 取裸鼠腫瘤直徑，腫瘤體積=η/6·長徑 短徑2。實驗結(jié)束處死裸鼠收獲腫瘤，稱瘤重。結(jié) 果表明，在用lD2mAb治療后的瘤的平均體積明顯比用普通小鼠IgG或PBS治療的對照組小 (如圖7A所示)。在皮下注射瘤細(xì)胞29天后對瘤的重量做了測量，經(jīng)lD2mAb治療后顯著 減少了瘤的平均重量(如圖7B所示)。發(fā)明人也對用高劑量ID2mAb做延期治療的效果做 了調(diào)查，這些治療是在皮下注射后7天開始的，因為這時的瘤的平均體積已經(jīng)增到0. 2cm3。 用1D2抗體做延期治療也對食道瘤重量的降低起到了類似的效果。
對包括心臟，肺臟，腎臟，脾臟和消化道等器官做了組織分析后，并未發(fā)現(xiàn)接受治療的小鼠器官出現(xiàn)明顯的向藥性副作用(數(shù)據(jù)隱去)。除瘤的重量外，治療結(jié)束時，接受治 療的小鼠與對照組小鼠的平均重量并未表現(xiàn)出明顯差異(數(shù)據(jù)隱去)。實施例16檢測血管密度為了評估降低血管生長是否能抑制腫瘤的生長，發(fā)明人用組織化學(xué)來測定瘤中微 血管密度。利用免疫組織化學(xué)的方法在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察石蠟包埋的移植瘤切片。 分別用抗CD31的抗體和抗huCD31抗體為一抗，每個瘤組織隨機(jī)挑選3個視野(0. 5mm2)，計 數(shù)并計算平均值，求出每個視野的微血管密度，和新生人員血管密度，用Microsoft Excel 2000對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算兩組之間的血管密度是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明， 用1D2治療的小鼠總的微血管密度比用mlgG治療的低20%。相比用mlgG治療的實驗對照 組，用低劑量治療的實驗組和延期治療的實驗組中，人源化血管密度降低了 50% ；用高劑量 治療的實驗組中，人源化血管密度降低了 65%。發(fā)明人用總的微血管密度減去人源化血管 密度后得到鼠類血管密度(如圖7D所示)，發(fā)現(xiàn)相比用mlgG治療的對照組，用1D2治療的 實驗組中鼠類的微血管并未減少。用1D2治療的實驗組中瘤的總體血管的減少應(yīng)該歸因于 這些瘤中人源化血管的減少。序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所<120>轉(zhuǎn)移刺激因子作為新的腫瘤血管靶標(biāo)在篩選抗腫瘤藥物中的用途<130>880254CG<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>657<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Leu Arg Gly Pro Gly Pro Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val Gln Cys151015Leu Gly Thr Ala Val Pro Ser Thr Gly Ala Ser Lys Ser Lys Arg Gln202530Ala Gln Gln Met Val Gln Pro Gln Ser Pro Val Ala Val Ser Gln Ser354045Lys Pro Gly Cys Tyr Asp Asn Gly Lys His Tyr Gln lie Asn Gln Gln505560Trp Glu Arg Thr Tyr Leu Gly Asn Ala Leu Val Cys Thr Cys Tyr Gly65707580Gly Ser Arg Gly Phe Asn Cys Glu Ser Lys Pro Glu Ala Glu Glu Thr859095Cys Phe Asp Lys Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Arg Val Gly Asp Thr Tyr
100105110Glu Arg Pro Lys Asp Ser Met lie Trp Asp Cys Thr Cys lie Gly Ala115120125Gly Arg Gly Arg lie Ser Cys Thr lie Ala Asn Arg Cys His Glu Gly130135140Gly Gln Ser Tyr Lys lie Gly Asp Thr Trp Arg Arg Pro His Glu Thr145150155160Gly Gly Tyr Met Leu Glu Cys Val Cys Leu Gly Asn Gly Lys Gly Glu165170175Trp Thr Cys Lys Pro lie Ala Glu Lys Cys Phe Asp His Ala Ala Gly180185190Thr Ser Tyr Val Val Gly Glu Thr Trp Glu Lys Pro Val Gln Gly Trp195200205Met Met Val Asp Cys Thr Cys Leu Gly Glu Gly Ser Gly Arg lie Thr210215220Cys Thr Ser Arg Asn Arg Cys Asn Asp Gln Asp Thr Arg Thr Ser Tyr225230235240Arg lie Gly Asp Thr Trp Ser Lys Lys Asp Asn Arg Gly Asn Leu Leu245250255Gln Cys lie Cys Thr Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Lys Cys Glu Arg260265270His Thr Ser Val Gln Thr Thr Ser Ser Gly Ser Gly Pro Phe Thr Asp275280285Val Arg Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro290295300Tyr Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met305310315320Gln Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu325330335Gly Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly340345350Gly Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly355360365Arg Thr Phe Tyr Ser Cys Thr lie Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu370375380Trp Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe385390395400Cys Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn405410415
Gly Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His Asn Tyr Thr420425430Asp Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp Cys Gly Thr435440445Thr Gln Asn Tyr Asp Ala Asp Gln Lys Phe Gly Phe Cys Pro Met Ala450455460Ala His Glu Glu lie Cys Thr Thr Asn Glu Gly Val Met Tyr Arg lie465470475480Gly Asp Gln Trp Asp Lys Gln His Asp Met Gly His Met Met Arg Cys485490495Thr Cys Val Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Thr Cys lie Ala Tyr Ser500505510Gln Leu Arg Asp Gln Cys lie Val Asp Asp lie Thr Tyr Asn Val Asn515520525Asp Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu Asn Cys Thr530535540Cys Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro Val Asp Gln545550555560Cys Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln lie Gly Asp Ser Trp565570575Glu Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys Tyr Gly Arg580585590Gly lie Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr Pro Ser Ser595600605Ser Gly Pro Val Glu Val Phe lie Thr Glu Thr Pro Ser Gln Pro Asn610615620Ser His Pro lie Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His lie Ser Lys625630635640Tyr lie Leu Arg Trp Arg Pro Val Ser lie Pro Pro Arg Asn Leu Gly645650 655Tyr
權(quán)利要求
轉(zhuǎn)移刺激因子作為新的腫瘤血管靶標(biāo)在篩選抗腫瘤藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述腫瘤為食管鱗狀細(xì)胞癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述抗腫瘤藥物的有效成分為對轉(zhuǎn)移刺激 因子特異的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述單克隆抗體為1D2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的單克隆抗體為小鼠雜交瘤細(xì) 胞系HECEC1D2產(chǎn)生的，該小鼠雜交瘤細(xì)胞系已于2006年7月5日保藏在CGMCC，保藏號為 CGMCC No. 1749。
6.一種單克隆抗體1D2，其特征在于所述的單克隆抗體為小鼠雜交瘤細(xì)胞系HECEC1D2 產(chǎn)生的，該小鼠雜交瘤細(xì)胞系已于2006年7月5日保藏在CGMCC，保藏號為CGMCC No. 1749。
7.如權(quán)利要求6所述的單克隆抗體1D2在制備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)移刺激因子作為新的腫瘤血管靶標(biāo)在篩選抗腫瘤藥物中的用途。更具體地，本發(fā)明利用分離培養(yǎng)的人食管癌細(xì)胞免疫小鼠制備功能性單克隆抗體庫，然后利用抗體庫技術(shù)篩選出了抗HECECs的功能性抗體1D2，該抗體所識別的抗原經(jīng)驗證是纖維結(jié)合蛋白的一個亞類-轉(zhuǎn)移刺激因子，實驗證明1D2抗體能抑制HECECS在纖維結(jié)合蛋白1(FN1)中的轉(zhuǎn)移和粘附。因此，轉(zhuǎn)移刺激因子作為新的腫瘤血管靶標(biāo)在篩選基于抗血管生成的抗腫瘤藥物中提供了新的選擇。本發(fā)明也涉及1D2抗體及其在制備抗腫瘤藥物中的用途。
文檔編號A61P35/00GK101822831SQ200910078718
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日
發(fā)明者冉宇靚, 楊治華, 胡海 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所