一種誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及細(xì)胞工程領(lǐng)域，尤其是設(shè)及一種誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為血 管內(nèi)皮樣細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管的發(fā)生和發(fā)育對胚胎形成各器官的發(fā)育分化，對成體的創(chuàng)傷修復(fù)和生殖功 能具有重要意義。血管內(nèi)皮樣細(xì)胞是形成屯、血管封閉管道系統(tǒng)的形態(tài)基礎(chǔ)。體外多種細(xì) 胞可經(jīng)誘導(dǎo)分化產(chǎn)生出內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells, EPCs)/內(nèi)皮細(xì)胞 (endothelial cells, ECs)，由骨髓來源的單個核細(xì)胞、血液來源的祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞 定向誘導(dǎo)分化而成的內(nèi)皮祖細(xì)胞等都已顯示出廣泛的治療前景。但是運(yùn)些細(xì)胞用于替代治 療依然存在缺陷，如單個核細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞存在分化效率低、移植的長期效果不顯著 等問題，血液來源的EPCs分化能力有限，起始細(xì)胞的數(shù)量受限，難W滿足治療的需要量等。
[0003] 人類胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞均具備自我更新和無限增殖的潛能，其 向ECs分化的可能性為屯、血管疾病和四肢缺血的治療提供了新途徑。目前普遍采用與小 鼠的基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)、誘導(dǎo)形成擬胚體并添加（VEGF)-A、BMP-4、8化-cAMP、（VEGF)-C及 Angiopoietin-1等細(xì)胞因子或化學(xué)分子或與特殊的二維介質(zhì)共培養(yǎng)等營造內(nèi)皮發(fā)育微環(huán) 境進(jìn)行誘導(dǎo)分化，整個過程需要在不同階段更換不同的培養(yǎng)基并加入相應(yīng)作用的細(xì)胞因 子，誘導(dǎo)周期一般為15天左右，然后需要進(jìn)一步利用內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記CD31、KDR、vWF等進(jìn) 行分離純化。
[0004] 目前已有多個研究小組從人類胚胎干細(xì)胞OiESCs)或人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 化iPSCs)中分化、分離到了 EPCs/ECs。研究結(jié)果顯示，hESCs來源的ECs能形成新的血管， 提高梗死屯、臟的功能，是細(xì)胞替代治療中新的細(xì)胞來源。美國魏爾康奈爾醫(yī)學(xué)院利用人體 胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化內(nèi)皮細(xì)胞，把胚胎干細(xì)胞暴露在轉(zhuǎn)化生長因子-P (TGF-beta)的環(huán)境 中時，內(nèi)皮細(xì)胞繁殖速度顯著增強(qiáng)。當(dāng)把培育的內(nèi)皮細(xì)胞置入老鼠體內(nèi)時，細(xì)胞可W正常工 作，并迅速被老鼠的循環(huán)系統(tǒng)所同化，和正常血管細(xì)胞一起工作。此外，現(xiàn)有研究還發(fā)現(xiàn)可 W利用羊膜穿刺術(shù)（amniocentesis)取得的診斷性的產(chǎn)前羊水細(xì)胞，對其重編程為數(shù)量充 足和穩(wěn)定的內(nèi)皮細(xì)胞，而且所產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞能夠再生受損的血管和修復(fù)受損的器官。美 國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的研究人員首次將干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有血腦屏障特性的內(nèi)皮細(xì) 胞，制成了可保護(hù)大腦的屏障模塊。研究人員表示，此前科學(xué)家從未借助干細(xì)胞生產(chǎn)出特定 的血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞，而其是采用了胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞兩種干細(xì)胞來形成血腦 屏障的內(nèi)皮細(xì)胞。
[0005] 由于W hESCs或hiPSCs為起始進(jìn)行誘導(dǎo)分化的方式不同，導(dǎo)致誘導(dǎo)分化的效率存 在差異。例如，利用邸S添加內(nèi)皮相關(guān)誘導(dǎo)因子進(jìn)行誘導(dǎo)分化，可能會因為培養(yǎng)的邸S大小 不同，致使誘導(dǎo)分化效率不一；與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)又會帶來不同種屬之間的交叉污染等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，有必要提供一種能夠消除基質(zhì)細(xì)胞污染，并可縮短誘導(dǎo)周期、提高分化效 率的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的方法。
[0007] 一種誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
[0008] 步驟S1，提供或制備誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；
[0009] 步驟S2,將化II相關(guān)基因轉(zhuǎn)入所述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞中，篩選陽性克隆得到 FLIl-iPSC細(xì)胞系，其中所述化II相關(guān)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)氨基酸序列與SEQ ID NO. 2所示 的氨基酸序列的相似度不低于80% ;
[0010] 步驟S3,將所述化Il-iPSC細(xì)胞系置于無飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)，使 細(xì)胞克隆增殖長大；
[0011] 步驟S4,啟動所述化II相關(guān)基因的過表達(dá)，并加入蛋白激酶C的誘導(dǎo)劑，將所述 FLIl-iPSC細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成血管內(nèi)皮樣細(xì)胞。
[0012] 在其中一個實施例中，所述步驟S1中，采用病毒感染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、mRNA導(dǎo)入、miRNA 導(dǎo)入或化學(xué)分子添加方式將誘導(dǎo)因子導(dǎo)入人類細(xì)胞中，誘導(dǎo)所述人類細(xì)胞分化為誘導(dǎo)性多 能干細(xì)胞。
[0013] 在其中一個實施例中，所述誘導(dǎo)因子包括0CT4、S0X2、NAN0G及Lin28。
[0014] 在其中一個實施例中，所述步驟S2中，是利用誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)將所述化II相關(guān) 基因轉(zhuǎn)入所述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞中。
[0015] 在其中一個實施例中，所述誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)為四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)、光誘 導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)或甲氧節(jié)氨喀晚誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。
[0016] 在其中一個實施例中，所述步驟S2中，所述篩選陽性克隆是使用所述表達(dá)調(diào)控系 統(tǒng)中相應(yīng)的真核細(xì)胞篩選因子進(jìn)行篩選，并在篩選后挑選單克隆構(gòu)建得到所述化Il-iPSC 細(xì)胞系。
[0017] 在其中一個實施例中，所述真核細(xì)胞篩選因子為遺傳霉素G418。
[0018] 在其中一個實施例中，所述遺傳霉素G418的濃度為50~1000 y g/mL。
[0019] 在其中一個實施例中，所述步驟S3中，是將所述化11-iPSC細(xì)胞系接種在鋪設(shè)有 基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿中，使用mTeSR培養(yǎng)基培養(yǎng)使細(xì)胞克隆增殖長大。
[0020] 在其中一個實施例中，所述步驟S4中，是使用向培養(yǎng)容器中加入強(qiáng)力霉素D0X啟 動化II相關(guān)基因的過表達(dá)。
[0021] 在其中一個實施例中，所述強(qiáng)力霉素D0X的濃度為0. 1~4 y g/mL。
[0022] 在其中一個實施例中，所述蛋白激酶C的誘導(dǎo)劑包括但不限于丙二醇甲酸醋酸 醋。
[0023] 在其中一個實施例中，所述丙二醇甲酸醋酸醋的濃度為0. 1~10 yM。 W24] 上述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的方法采用無 feeder (飼養(yǎng)層細(xì)胞）的培養(yǎng)體系，僅通過過表達(dá)化II相關(guān)基因和激活蛋白激酶C(PKC)通 路就能獲得血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，且經(jīng)過檢測，純度較高。通過使用上述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞定向 誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的方法，誘導(dǎo)周期短、效率高，且得到的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞性能穩(wěn) 定，不存在基質(zhì)細(xì)胞污染的問題。
【附圖說明】
[00巧]圖1為本發(fā)明實施例hiPS誘導(dǎo)形成過程中細(xì)胞形態(tài)變化示意圖，其中，A :人胚胎 成纖維細(xì)胞，B :病毒感染后D4天細(xì)胞形態(tài)，C :感染2周左右天形成的非ES樣克隆，D-F : 人feeder上傳代培養(yǎng)的典型的iPS克隆，F(xiàn):iPSCs周邊自發(fā)分化的克隆，A-D和F標(biāo)尺為 200 y m，E 標(biāo)尺為 50 y m;
[00%] 圖2為本發(fā)明實施例hiPSCs中的全能型相關(guān)基因表達(dá)檢測示意圖；
[0027] 圖3為本發(fā)明實施例hiPSCs與hESCs來源的邸不同分化時間點內(nèi)、中、外立胚層 代表基因表達(dá)示意圖，其中，S0X17 :內(nèi)胚層，RUNX1 :中胚層，PAX6 :外胚層；
[0028] 圖4為本發(fā)明實施例hiPSCs中端粒酶水平檢測示意圖；
[0029] 圖5為本發(fā)明實施例hiPSCs的免疫組化分析示意圖，其中，A :AKP染色，B: SSEA-3, C :SSEA-4, D :TRA-1-60, E :TRA-1-81，F(xiàn) :0CT4, A 標(biāo)尺為 200 ym，B-F 標(biāo)尺為 100 ym；
[0030] 圖6為本發(fā)明實施例hiPSCs體外S胚層分化檢測示意圖，其中，A :B-tubulin/ DAPI，B :SMA/DAPI，C :AFP/DAPI，崎胎瘤組織切片顯示S胚層來源的細(xì)胞D :軟骨（中胚