細胞轉化誘導液及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程、組織工程和生物醫(yī)藥領域，特別涉及用于將UC-MSC誘導轉 化為胰島細胞的細胞轉化誘導液。
【背景技術】
[0002] 糖尿病是胰島素分泌相對或絕對不足或胰島素受體等缺陷引起的糖、脂肪和蛋白 質(zhì)代謝紊亂性疾病。臨床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射胰島素來治療。而細 胞治療是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治療策略，尤其對于已經(jīng)喪失胰島細胞功能的糖 尿病患者來說，植入能分泌胰島素的胰島細胞或其替代物是最理想的治療方法。目前，胰島 細胞移植治療糖尿病取得了一些療效，但供者細胞來源不足、嚴重的免疫排斥反應等困難 極大的限制了這種療法的應用。
[0003] 干細胞具有極強的自我更新能力及多向分化潛能，是基因治療的理想靶細胞。干 細胞分為全能干細胞（如胚胎干細胞，可以分化為機體所有組織細胞）、多能干細胞胞（具 有多向分化潛能，可以分化為多種組織細胞，如間充質(zhì)干細胞等）和專能干細胞（維持某一 特定組織細胞的單一方向自我更新，如腸上皮干細胞等）。干細胞技術的不斷突破及干細胞 本身所具有的特性使人類有可能在體外培養(yǎng)某些干細胞，定向誘導其分化為我們所需要的 各種組織細胞，或作為種子細胞用于組織工程以供臨床所需，以此為目的的干細胞工程涉 及人體幾乎所有重要組織器官及人類面臨的大多數(shù)醫(yī)學難題，如心血管疾病、糖尿病、惡性 腫瘤、骨及軟骨缺損、老年性癡呆、帕金森病、燒傷、脊髓損傷和遺傳性缺陷等的治療。由于 人羊水、臍帶血、外周血和骨髓中的多能干細胞，具有增殖能力強、來源豐富、采集方便等優(yōu) 點，此類干細胞移植在血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等的治療中發(fā)揮了重要的 作用。
[0004] 對干細胞進行適當?shù)幕蛐揎棧怪蔀槟芊置谝葝u素的細胞，是治療I型糖尿 病的理想策略之一，而將干細胞轉化為胰島細胞過程中，誘導液起到至關重要的作用，針對 干細胞不同的誘導方式，所需要的誘導液不同。然而，現(xiàn)有技術中最常用的誘導干細胞轉化 為胰島細胞的方法為應用插入式細胞培養(yǎng)皿共培養(yǎng)板體外誘導UC-MSC(即臍帶間充質(zhì)干 細胞）向胰島樣細胞轉化具體為：選取第3代UC-MSC，用含10 %FBS(胎牛血清）的L-DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1X105個/ml，接種于普通6孔板，倒置顯微鏡下觀察細 胞貼壁后，改為L-DMEM/RPMI1640(1:1)培養(yǎng)基（低糖型改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基與RPMI 16401:1混合而成的培養(yǎng)基）；同時將已分離獲得的胰島細胞，以50個/孔接種于共培養(yǎng)板 的中，進行UC-MSC和胰島細胞兩種細胞的共培養(yǎng)。然而，此種共培養(yǎng)方法不僅需要一定的 胰島細胞源，過程較繁瑣，花費較大，而且所獲得的更多為散在胰島樣細胞，數(shù)量較少，胰島 細胞團幾乎沒有，而且散在的胰島樣細胞相對較小，胰島素分泌量少難以達到臨床移植要 求。目前，也有研究者正在研究一種將UC-MSC直接誘導成胰島細胞的方法，因此，迫切需要 一種用于將UC-MSC直接誘導成胰島細胞的誘導液。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是，針對現(xiàn)有技術中誘導液誘導UC-MSC與胰島細胞 共培養(yǎng)方式所獲得的胰島細胞較小，數(shù)量較少，且花費較大等缺陷，提供一種可將UC-MSC 轉化為胰島細胞的誘導液。
[0006] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種細胞轉化誘導液，所述誘導液 包括尼克酰胺和表皮生長因子。
[0007] 在本發(fā)明提供的細胞轉化誘導液中，所述誘導液中尼克酰胺的濃度為5-15mmol/L 和表皮生長因子的濃度為15-30yg/L。
[0008] 在本發(fā)明提供的細胞轉化誘導液中，所述誘導液還包括60yg/L-150yg/L的 0 -神經(jīng)生長因子和l-l〇nmol/L激活素A。
[0009] 在本發(fā)明提供的細胞轉化誘導液中，所述誘導液還包括還原劑。
[0010] 在本發(fā)明提供的細胞轉化誘導液中，所述還原劑為e-琉基乙醇，且e-琉基乙醇 為 5-15yg/L。
[0011] 在本發(fā)明提供的細胞轉化誘導液中，所述誘導液中尼克酰胺的濃度為5mmol/L，表 皮生長因子的濃度為30yg/L，0 -神經(jīng)生長因子的濃度為150yg/L，激活素A的濃度為 10nmol/L，-琉基乙醇的濃度為10yg/L。
[0012] 在本發(fā)明提供的細胞轉化誘導液中，所述誘導液中尼克酰胺的濃度為15mmol/L， 表皮生長因子的濃度為15yg/L，0 -神經(jīng)生長因子的濃度為60yg/L，激活素A的濃度為lnmol/L，0 -琉基乙醇的濃度為15yg/L。
[0013] 在本發(fā)明提供的細胞轉化誘導液中，所述誘導液中尼克酰胺的濃度為10mm〇l/L， 表皮生長因子的濃度為25yg/L，0 -神經(jīng)生長因子的濃度為100yg/L，激活素A的濃度為 4nmol/L，0 -琉基乙醇的濃度為5yg/L。
[0014] 本發(fā)明進一步保護上述細胞轉化誘導液在UC-MSC轉化為胰島細胞過程中的應 用。
[0015] 實施本發(fā)明提供的細胞轉化誘導液及其應用，可以達到以下有益效果：該誘導液 能夠在保持UC-MSC細胞活性的同時，促進UC-MSC增大和增殖轉化，促進后期UC-MSC轉 化成胰島細胞團和增大胰島細胞，對于改善現(xiàn)有UC-MSC與胰島細胞共培養(yǎng)獲得胰島細胞 的方法具有重要的意義；由本發(fā)明提供的誘導液在UC-MSC轉化為胰島細胞過程中的應用 可知，本發(fā)明提供的誘導液不僅省去現(xiàn)有誘導方法中前期獲取胰島細胞的過程，而且使得 UC-MSC轉化成的胰島細胞數(shù)量較多，且胰島細胞質(zhì)量較好，能夠分泌較多的胰島素。
【附圖說明】
[0016] 下面將結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中：
[0017] 圖1為采用本發(fā)明提供的細胞轉化誘導液誘導UC-MSC轉化成的胰島細胞通過雙 硫腙染色得到的顯微鏡下的細胞分布圖；
[0018] 圖2為采用本發(fā)明提供的細胞轉化誘導液誘導UC-MSC轉化成的胰島細胞通過雙 硫腙染色得到的顯微鏡下的細胞分布放大圖。
【具體實施方式】
[0019] 為解決現(xiàn)有技術中誘導液誘導UC-MSC與胰島細胞共同培養(yǎng)方式所獲得的胰島細 胞較小，且數(shù)量較少等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點在于提供一種細胞轉化誘導液，可促進UC-MSC 轉化成胰島細胞，該誘導液可促進細胞增殖、增大，從而實現(xiàn)了提高UC-MSC轉化率及提高 轉化后胰島細胞質(zhì)量的目的。
[0020] 具體地，本發(fā)明提供的用于將UC-MSC轉化為胰島細胞的細胞轉化誘導液包括：尼 克酰胺和表皮生長因子，優(yōu)選地，誘導液中尼克酰胺的濃度為5-15mmol/L和表皮生長因子 的濃度為15-30yg/L。尼克酰胺的主要作用是參與呼吸鏈，參與細胞增殖轉化的呼吸過程 及電子傳遞過程，促進細胞的增殖轉化；表皮生長因子可以促進UC-MSC增殖及促進胰島樣 細胞團的形成；因此，通過本發(fā)明提供的誘導液可以促進UC-MSC的增殖轉化，為UC-MSC轉 化為胰島細胞做準備，促進胰島細胞團的形成。
[0021] 進一步地，本發(fā)明提供的誘導液還包括60iig/L-150iig/L的e-神經(jīng)生長因子和 l-10nm〇l/L激活素A。0 -神經(jīng)生長因子屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子，可以促進UC-MSC的生長，維 持UC-MSC正常的活性和功能；而激活素A，可以促進UC-MSC的增殖，因此，在誘導液中加入 神經(jīng)生長因子和激活素A不僅可以保持UC-MSC的活性，提高存活率，而且還可以進一步 促進UC-MSC的增殖。
[0022] 另外，由于在細胞增殖轉化時期，細胞的氧化作用較強，會向培養(yǎng)基中釋放氧自 由基，氧自由基積累到一定程度時，會破壞細胞膜和細胞器膜，殺死細胞，不利于細胞的生 長增殖，使得細胞達不到很高的密度，因此，在本發(fā)明提供的誘導液中還可以包括還原劑， 如琉基乙醇，巰基乙醇是一種強還原劑，可以中和掉細胞培養(yǎng)基中積累的氧自由 基，這樣可以使得細胞分裂到很高的密度而不死亡，從而有利于UC-MSC的增殖，在細胞增 殖轉化時期能降低細胞的氧化作用，提高細胞內(nèi)谷胱甘肽的水平，清除氧自由基，有利于 UC-MSC的轉化，優(yōu)選地，0 -巰基乙醇的濃度為8-10yg/L。
[0023] 本發(fā)明提供的細胞轉化誘導液，應用于UC-MSC轉化為胰島細胞的方法步驟為：
[0024] 取第三代UC-MSC，置于培養(yǎng)箱中，并按以下步驟對第三代UC-MSC進行誘導：
[0025] 1)在細胞培養(yǎng)基中加入第一種誘導液，培養(yǎng)至細胞完成增殖過程，獲得預轉化干 細胞體；
[0026] 2)在含有質(zhì)量分數(shù)為1% -5%的胰島素-轉鐵蛋白-硒的DMEM/F12培養(yǎng)基中，加 入第二種誘導液，培養(yǎng)上述預轉化干細胞體至細胞轉化結束，獲得胰島細胞液；
[0027] 其中，第一種誘導液為本發(fā)明提供的用于將UC-MSC轉化為胰島細胞的誘導液，在 本發(fā)明提供的誘導液促進下，使UC-MSC不斷增殖，促進細胞團的形成，為形成大量的胰島 細胞及胰島細胞團作準備；
[0028] 第二種誘導液包括5_15mmol/L尼克酰胺和5-15yg/L堿性成纖維細胞生長因子。
[0029] 尼克酰胺參與細胞增殖轉化的呼吸過程及電子傳遞過程，促進細胞的增殖轉化； 堿性成纖維細胞生長因子可促進細胞加速增殖，細胞體積增大；含有胰島素-轉鐵蛋 白-硒的DMEM/F12培養(yǎng)基可促使轉化的干細胞體定向轉化成胰島細胞。
[0030] 與現(xiàn)有技術相比，采用本發(fā)明提供的誘導液，能夠對UC-MSC分步進行轉化，使得 UC-MSC可直接轉化成胰島細胞，而無需將UC-MSC與胰島細胞共培養(yǎng)獲得轉化后胰島細胞， 并且采用本發(fā)明提供的誘導液可促進UC-MSC細胞的增殖和增大，促進胰島細胞團的形成， 提高胰島細胞的轉化率。
[0031] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0032] 實施例1
[0033] 應用本發(fā)明提供細胞轉化誘導液將