一種基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 卡那霉素（kanamycin)是由卡那鏈霉菌（Streptomyces.kanamyceticus CGMCX4. 1441)產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，于1957年被Umezawa等人發(fā)現(xiàn)。從化學結(jié)構(gòu) 上看，卡那霉素是2-D0S以糖苷鍵與卡那糖胺和D-葡萄糖胺連接形成的三糖化合物，包括 卡那霉素A、B和C三個組分，其中卡那霉素A是主組分，卡那霉素含量B在5%~7%之間。
[0003] 卡那霉素B是合成地貝卡星和阿貝卡星的原料。地貝卡星（dibekacin，DKB)保持 了卡那霉素B的抗菌活性，在抵制鈍化酶APH(3'）的攻擊方面明顯強于卡那霉素B。阿貝 卡星（arbekacin)，它的耐酶性更好，而且耳、腎毒性較低，對許多耐甲氧西林的金黃色葡萄 球菌（MRSA)有效。
[0004] 多年來，對卡那鏈霉菌的研究一直停留在誘變育種和生產(chǎn)工藝的改進中。對卡那 霉素合成基因的研究也一直以體外表達為主?？敲顾馗鹘M分間結(jié)構(gòu)差異較小，物理性質(zhì) 相近，造成下游分離困難，提高了生產(chǎn)成本?？敲顾睾铣苫蚵窂降年U述也為建立生產(chǎn)單 組分產(chǎn)物的工程菌奠定了基礎(chǔ)?？敲顾氐纳锖铣苫虼赜?004年在卡那鏈霉菌中首 次被分離。Kharel等從卡那鏈霉菌中克隆一段包含有40個0RF的序列，包含卡那霉素合成 基因、調(diào)芐基因、抗性基因和轉(zhuǎn)運基因。
[0005] 分子生物學技術(shù)的發(fā)展使得利用基因工程手段改造抗生素組分成為可能。Hilda 等人于2011年在大腸桿菌中表達了KanJ和KanK，并深入探討了酶的功能和抑制劑。KanJ 是Fe11 /a-酮戊二酸依賴的雙脫氧酶，KanK是NADP依賴的酮還原酶，它們共同參與了卡那 霉素B轉(zhuǎn)變?yōu)榭敲顾谹的C2'位的脫氫和氨化作用。
[0006] 卡那霉素B的生產(chǎn)主要是從卡那霉素的發(fā)酵母液中分離提取，產(chǎn)量低而且工藝繁 瑣，成本高，分離周期長，污染嚴重，產(chǎn)量不穩(wěn)定。
[0007] 構(gòu)建一株直接高產(chǎn)卡那霉素B的工程菌株，可以革命性地降低卡那霉素B的生產(chǎn) 成本，簡化生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)效率。卡那霉素B的工程菌株兼顧了節(jié)能減排和安全高效， 必然產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種直接產(chǎn)生卡那霉素B的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用?？?那鏈霉菌原始菌株中卡那霉素A的產(chǎn)量為93%，而卡那霉素B的量為7%。本發(fā)明利用基 因阻斷技術(shù)對卡那鏈霉菌中的雙脫氧酶基因（KanJ基因）進行破壞，以阻斷卡那霉素A的 合成，使其主要產(chǎn)生卡那霉素B。
[0009] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0010] -方面，本發(fā)明提供經(jīng)基因工程構(gòu)建的卡那鏈霉菌（Streptomyces kanamyceticusXN126)，所述卡那鏈霉菌的雙脫氧酶基因kanj失活或由kanj編碼的雙脫 氧酶失活。
[0011] 優(yōu)選地，所述kanj基因選自下述序列中的至少一種：
[0012] (1)具有SEQIDNO: 1所示核苷酸序列的序列；
[0013] ⑵與⑴中的序列同源的序列；
[0014] (3)在嚴格條件下與（1)或（2)的序列雜交且編碼雙脫氧酶的序列；和/或
[0015] (4)核苷酸序列與（1)或（2)的序列有85%以上的同一性且編碼雙脫氧酶的序 列；
[0016] 優(yōu)選地，所述kanj基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0017] 優(yōu)選地，所述失活是通過選自基因敲除、基因置換、基因沉默、RNA干擾和點突變中 的一種或多種方式實現(xiàn)的。
[0018] 更優(yōu)選地，所述卡那鏈霉菌為卡那霉素鏈霉菌（Streptomyceskanamyceticus)。 所述菌株已于2015年05月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所），保藏 編號：CGMCCNo. 10860。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)卡那霉素B及其衍生物的卡那鏈霉的方法， 所述方法包括：通過基因工程方法使卡那鏈霉菌中的kanj基因失活或由kanj基因編碼的 雙脫氧酶失活；
[0020] 優(yōu)選地，所述失活是通過選自基因敲除、基因置換、基因沉默、RNA干擾和點突變中 的一種或多種方式實現(xiàn)的；
[0021] 優(yōu)選地，所述方法為通過框架內(nèi)缺失來阻斷卡那鏈霉菌中的kanj基因。
[0022] 優(yōu)選地，所述框架內(nèi)缺失包括以下步驟：
[0023] (1)構(gòu)建kanj基因雙交換阻斷質(zhì)粒；
[0024] (2)使用步驟⑴中構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化卡那鏈霉菌，獲得轉(zhuǎn)化子；
[0025] (3)篩選步驟⑵中獲得的轉(zhuǎn)化子，獲得雙交換菌株。
[0026] 優(yōu)選地，步驟（1)包括構(gòu)建含大腸桿菌中的復(fù)制起始位點ori、接合轉(zhuǎn)移起始位點 oriT、大腸桿菌中的抗性篩選標記、鏈霉菌中的抗性篩選標記，kanj的上下游同源片段（核 苷酸序列為SEQIDN0:4)的kanj基因雙交換阻斷質(zhì)粒；
[0027] 優(yōu)選地，所述步驟（1)包括：
[0028] (1-1)以卡那鏈霉菌基因組DNA為模板，分別以SEQIDN0:5和SEQIDN0:6為上 游引物，SEQIDNO: 7和SEQIDNO: 8為下游引物，進行PCR擴增；
[0029] (1-2)連接步驟（1-1)中分別得到的擴增片段，得到kanj上游SEQIDN0:2所示的 核苷酸序列和kanj下游SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，然后上游序列用BamHI和EcoRI 酶切下游序列用EcoRI和Hindlll酶切，一起與經(jīng)BamHI和Hindlll酶切的pIJ2925連接， 得到帶有AkanJ(包括kanj上游SEQIDN0:2所示的核苷酸序列和kanj下游SEQIDN0:3 所示的核苷酸序列）片段的PIJ2925,命名為pDLJ201 ;
[0030] (1-3)以質(zhì)粒pSET152為模版PCR擴增安普霉素（apramycin，Am)抗性基因和oriT 位點，將得到的擴增片段連接到用EcoRI和Kpnl酶切的質(zhì)粒pIJ2925上，用T4DNA連接酶 連接環(huán)化；和
[0031] (1-4)用BamHI和Hindlll酶切步驟（1-3)中得至IJ的含Am抗性基因和oriT位點 的PIJ2925,然后與步驟（1-2)中得到的經(jīng)BamHI和Hindlll酶切的pDLJ2925連接，獲得kanj基因雙交換阻斷質(zhì)粒pDLJ202。
[0032] 所述引物為：
[0033]JII1(SEQIDNO:5):
[0034] CGGGATCCAGGAGTCGCTATGAGCAAGAAG酶切位點：BamHI
[0035]JII2(SEQIDN0:6):
[0036] CGGAATTCATGGCTGGTCTTCCCTTCTCA酶切位點：EcoRI
[0037]JII3(SEQIDNO:7)：
[0038] CGGAATTCCCTGACGGGTGATCATCCCTT酶切位點：EcoRI
[0039]JIII4(SEQIDNO:8)：
[0040] CCAAGCTTGCGGAATGGGTCTGGTACATG酶切位點：Hindlll。
[0041] kanj基因雙交換阻斷質(zhì)粒pDLJ202包括了kanj基因的上下游同源臂、篩選標記基 因Am抗性基因、oriT位點和幾乎刪去了kanj全部基因的AkanJ，是一種自殺型質(zhì)粒；由于 所述質(zhì)粒沒有鏈霉菌復(fù)制起點，因此不能在鏈霉菌中復(fù)制。
[0042] 優(yōu)選地，步驟（2)中所述的轉(zhuǎn)化是以大腸桿菌（例如E.coliET12567)介導(dǎo)的接 合轉(zhuǎn)移方法。
[0043] 優(yōu)選地，所述步驟（2)包括：
[0044] (2-1)將步驟⑴得到的kanj基因雙交換阻斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選氯霉素、卡 那霉素和安普霉素三抗性菌株，獲得用于基因阻斷的供體菌；和
[0045] (2-2)將步驟（2-1)得到的供體菌和經(jīng)熱激與預(yù)培養(yǎng)的卡那鏈霉菌單孢子懸液混 合培養(yǎng)，在安普霉素和萘啶酮酸存在下培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化子。
[0046] 優(yōu)選地，步驟（3)中所述的篩選是根據(jù)抗性表型篩選敏感菌落即在上下游同源片 段上各發(fā)生一次交換而使質(zhì)粒脫落的雙交換菌株或在同一同源片段上發(fā)生兩次交換而使 質(zhì)粒脫落的回復(fù)菌株，然后對抗性敏感菌株（雙交換菌株或回復(fù)菌