UC-MSC轉(zhuǎn)化為胰島細(xì)胞的方法包括以下步 驟：
[0034] (l)UC-MSC的分離培養(yǎng)
[0035] 無菌條件下取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，臍帶離體后浸泡于每毫升含25U 肝素鈉的生理鹽水中進(jìn)行4_6h處理后，超凈臺內(nèi)剔除臍帶的動靜脈，剝?nèi)ネ鈱友蚰ぃ瑢⒛?帶切成1_X1_X1mm大小的組織塊并貼于培養(yǎng)皿底，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的 低糖DMEM置于37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2周后移除，待貼壁細(xì)胞達(dá) 到80 % -90 %匯合時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0036] 其中，含體積分?jǐn)?shù)為10 %胎牛血清的低糖DMEM(dulbecco'smodifiedeagle medium，改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基）成分為：含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100yg/ml鏈 霉素、15ug/L的IL-3、5ug/L粒細(xì)胞集落刺激生物因子、1. 0-3. 3g/L葡萄糖。
[0037] 當(dāng)然可以理解的是，第三代UC-MSC的來源方式也并不局限于此，現(xiàn)有技術(shù)中可獲 取的第三代UC-MSC均適用于本發(fā)明。
[0038] (2)UC-MSC的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化
[0039] 1)在體積分?jǐn)?shù)為30%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中加入含150yg/L-神經(jīng)生 長因子，10nmol/L激活素A，5mmol/L尼克酰胺，30yg/L表皮生長因子，10yg/L-琉基乙 醇的第一種誘導(dǎo)液，在37°C和5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d至細(xì)胞完成增殖過程，獲得預(yù)轉(zhuǎn) 化干細(xì)胞體；
[0040] 2)添加含10mmol/L尼克酰胺，10yg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子的第二種誘導(dǎo) 液，和含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37°C和5%C02的 培養(yǎng)箱中對預(yù)轉(zhuǎn)化干細(xì)胞體培養(yǎng)14d至細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)束，獲得胰島細(xì)胞液；
[0041] (3)胰島細(xì)胞的分離
[0042] 棄去上述培養(yǎng)液上清，用磷酸鹽溶液（下稱PBS緩沖液）清洗2次，加入 L-DMEM(低糖型改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基，葡萄糖濃度為1. 0-3. 3g/L)培育l-2h后，收集上 清，PBS洗2次，再換為H-DMEM(高糖型改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基，葡萄糖濃度為3. 15-4. 5g/ L)培育l-2h，收集上清，即為分離后的胰島細(xì)胞。
[0043] 實施例2
[0044] 該實施例與實施例1相比，除第三代UC-MSC的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化步驟1)有所區(qū)別以外，其 他過程步驟均相同。
[0045] 該實施例中，第三代UC-MSC的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化步驟1)為：
[0046] 加入含60yg/L0 -神經(jīng)生長因子，lnmol/L激活素A，15mmol/L尼克酰胺，15yg/ L表皮生長因子，15yg/LP-琉基乙醇的第一種誘導(dǎo)液，體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天至細(xì)胞完成增殖過程，獲得預(yù)轉(zhuǎn)化干細(xì)胞體。
[0047] 實施例3
[0048] 該實施例與實施例1相比，除UC-MSC的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化步驟1)有所區(qū)別以外，其他過程 步驟均相同。
[0049] 該實施例中，UC-MSC的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化步驟1)為：
[0050] 加入含100yg/L0 -神經(jīng)生長因子，4nmol/L激活素A，10mmol/L尼克酰胺，25yg/ L表皮生長因子，5yg/LP-琉基乙醇的第一種誘導(dǎo)液，在體積分?jǐn)?shù)為10 %胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天至細(xì)胞完成增殖過程，獲得預(yù)轉(zhuǎn)化干細(xì)胞體。
[0051] 為進(jìn)一步驗證本發(fā)明提供的誘導(dǎo)液在UC-MSC轉(zhuǎn)化為胰島細(xì)胞過程中所起到的有 益效果，對本發(fā)明實施例1-3中所獲得胰島細(xì)胞分別進(jìn)行相應(yīng)參數(shù)的測定，主要包括胰島 細(xì)胞率、C肽分泌量和胰島素分泌量的測定；并通過設(shè)置對照組對比突出本發(fā)明的有益效 果，對照組為通過利用現(xiàn)有技術(shù)中的誘導(dǎo)液誘導(dǎo)UC-MSC和胰島細(xì)胞所獲得的胰島細(xì)胞，詳 見本發(fā)明說明書【背景技術(shù)】部分。
[0052] 具體測定過程為：
[0053] 1、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測胰島細(xì)胞百分率
[0054] 分別對本發(fā)明實施例1-3中誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞液以及對照組誘導(dǎo)第17d后的細(xì)胞 培養(yǎng)上清液分別進(jìn)行如下操作：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%胰蛋白酶消化后，PBS緩沖液洗滌3 次，lOOOrpm離心5min，棄上清，加入insulin-CY5 (胰島素CY5熒光標(biāo)記蘇素），流式細(xì) 胞儀計數(shù)105個細(xì)胞；分別進(jìn)行6組平行實驗胰島細(xì)胞可被insulin-CY5標(biāo)記，通過流式 細(xì)胞器自帶的軟件分析可得出表1中胰島細(xì)胞率的數(shù)據(jù)。
[0055] 2、利用放射免疫法檢測胰島細(xì)胞分泌的胰島素和C肽含量
[0056] 分別對本發(fā)明實施例1-3中誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞液以及對照組誘導(dǎo)第17d后的細(xì)胞培 養(yǎng)上清液分別進(jìn)行如下操作：吸取培養(yǎng)上清液0. 5ml于移液管中，-20°C凍存留取標(biāo)本。按 照北京福瑞生物工程公司的人胰島素和C肽放免試劑盒說明測定留取標(biāo)本中胰島素和C肽 的含量，測定結(jié)果如表1所示。
[0057] 表 1 :
[0058]
[0059] 由表1可知，通過采用本發(fā)明提供細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)UC-MSC轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化的胰島細(xì) 胞率遠(yuǎn)大于現(xiàn)有技術(shù)，且由C肽分泌量和胰島素分泌量可知，轉(zhuǎn)化后的胰島細(xì)胞利用率較 高，因此，本發(fā)明提供的誘導(dǎo)液不僅提高了胰島細(xì)胞的數(shù)量，也提高了胰島細(xì)胞的質(zhì)量。
[0060] 除此之外，通過設(shè)置雙硫腙染色法來進(jìn)一步驗證通過采用本發(fā)明提供的細(xì)胞轉(zhuǎn)化 誘導(dǎo)液能夠提高胰島細(xì)胞數(shù)量并獲得的胰島細(xì)胞團；本次測試對象為：1、實驗組-本發(fā)明 實施例1獲得胰島細(xì)胞；2、對照組-以現(xiàn)有技術(shù)中UC-MSC和胰島細(xì)胞共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)獲得 的胰島細(xì)胞，詳見本發(fā)明說明書【背景技術(shù)】部分；
[0061] 具體步驟為：
[0062] 1、配制雙硫蹤工作液：將50mg雙硫腙溶于5毫升DMS0 (二甲基亞砜），過濾、分裝 貯存于-20°C保存。
[0063] 2、將實驗組和對照組分別以磷酸鹽溶液洗滌2次，各加入1毫升的磷酸鹽溶液和 10yL的雙硫腙工作液（終濃度1 %，V/V)，37°C孵育15min，倒置顯微鏡下觀察胰島細(xì)胞著 色情況，分別如圖1和圖2所示。圖1中深色部分代表通過本發(fā)明提供的方法誘導(dǎo)出的胰 島細(xì)胞，從圖中可以看出，胰島細(xì)胞聚集成團，面積較大，且數(shù)量較多；圖2深色部分代表通 過現(xiàn)有技術(shù)誘導(dǎo)出的胰島細(xì)胞放大圖，從圖中可以看出胰島細(xì)胞較分散、不成團，胰島細(xì)胞 數(shù)量相對較少。
[0064] 綜上所述，本發(fā)明提供的細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液，使UC-MSC在保持細(xì)胞活性的同時，能 夠促進(jìn)UC-MSC增殖轉(zhuǎn)化，同時促進(jìn)UC-MSC增大，為UC-MSC轉(zhuǎn)化成胰島細(xì)胞團和增大胰島 細(xì)胞作準(zhǔn)備，對于改善現(xiàn)有UC-MSC與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)獲得胰島細(xì)胞的方法具有重要的意 義；由本發(fā)明提供的誘導(dǎo)液在UC-MSC轉(zhuǎn)化為胰島細(xì)胞過程中的應(yīng)用可知，本發(fā)明提供的誘 導(dǎo)液不僅省去現(xiàn)有誘導(dǎo)方法中前期獲取胰島細(xì)胞的過程，而且使得UC-MSC轉(zhuǎn)化為胰島細(xì) 胞的過程更易操作，同時可減少花費，而且最終所獲得胰島細(xì)胞數(shù)量較多，且胰島細(xì)胞質(zhì)量 較好，能夠分泌較多的胰島素，對于臨床移植UC-MSC治療1型糖尿病具有重要意義。
[0065] 以上結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體 實施方式，上述的【具體實施方式】僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可做出很多 形式，這些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液，其特征在于：所述誘導(dǎo)液包括尼克酰胺和表皮生長因子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液，其特征在于，所述誘導(dǎo)液中尼克酰胺的濃 度為5-15mmol/L和表皮生長因子的濃度為15-30 y g/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液，其特征在于，所述誘導(dǎo)液還包括60 y g/ L-150 y g/L的-神經(jīng)生長因子和1-lOnmol/L激活素A。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液，其特征在于，所述誘導(dǎo)液還包括還原劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液，其特征在于，所述還原劑為P -琉基乙醇， 且P -琉基乙醇為5-15 y g/L。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液，其特征在于，所述誘導(dǎo)液中尼克酰胺的濃 度為5mmol/L，表皮生長因子的濃度為30 y g/L，P -神經(jīng)生長因子的濃度為150 y g/L，激活 素A的濃度為10nm〇l/L，P -琉基乙醇的濃度為10 y g/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液，其特征在于，所述誘導(dǎo)液中尼克酰胺的濃 度為15mmol/L，表皮生長因子的濃度為15 y g/L，P -神經(jīng)生長因子的濃度為60 y g/L，激活 素A的濃度為lnmol/L，P -琉基乙醇的濃度為15 y g/L。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液，其特征在于，所述誘導(dǎo)液中尼克酰胺的濃 度為10mm〇l/L，表皮生長因子的濃度為25 y g/L，P -神經(jīng)生長因子的濃度為100 y g/L，激 活素A的濃度為4nmol/L，P -琉基乙醇的濃度為5 y g/L。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液在UC-MSC轉(zhuǎn)化為胰島細(xì)胞過程中 的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)液及其應(yīng)用，所述誘導(dǎo)液包括尼克酰胺和表皮生長因子；尼克酰胺能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化，而表皮生長因子可以促進(jìn)UC-MSC增殖及促進(jìn)胰島樣細(xì)胞團的形成，因此，采用本發(fā)明提供的誘導(dǎo)液誘導(dǎo)UC-MSC轉(zhuǎn)化的胰島細(xì)胞不僅數(shù)量較多，且胰島細(xì)胞質(zhì)量較好，能夠分泌較多的胰島素，對于臨床移植UC-MSC治療1型糖尿病具有重要意義。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105039239
【申請?zhí)枴緾N201510397799
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年7月8日