一種提高臍帶血巨核祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高臍帶血巨核祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化效 率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1989年世界上第一次進(jìn)行臍帶血造血干細(xì)胞移植并獲得成功后，臍帶血造血干細(xì) 胞的臨床應(yīng)用便越來越廣泛，經(jīng)過20多年的發(fā)展，目前臍帶血已經(jīng)和骨髓、外周血一起成 為造血干細(xì)胞的三大來源。
[0003] 相對于骨髓，臍帶血移植后血小板的恢復(fù)速度稍慢一些，目前普遍認(rèn)為原因是臍 帶血中的巨核祖細(xì)胞數(shù)量不充裕且分化成熟遲緩。由于在造血干細(xì)胞移植前，受者通常要 進(jìn)行大劑量放療/化療以達(dá)到清髓效果，而放療/化療會使受者的造血系統(tǒng)嚴(yán)重受損，導(dǎo)致 一段時間內(nèi)血小板嚴(yán)重缺乏，容易出血甚至引起死亡，所以需要輸注大量外源的血小板。而 在造血干細(xì)胞移植后，血小板的恢復(fù)情況也是影響移植成敗的重要原因。所以，對于臍帶血 移植而言，血小板的作用巨大。
[0004] 造血干細(xì)胞具有自我更新能力并能最終分化為各種血液成分細(xì)胞。造血干細(xì)胞可 分化為巨核祖細(xì)胞（Megakaryocyticprogentitorcell，MKPC)，然后進(jìn)一步分化為成熟的 巨核細(xì)胞，最終釋放出血小板。近年研究發(fā)現(xiàn)，將異體臍帶血造血干細(xì)胞在體外定向擴(kuò)增 為巨核祖細(xì)胞，造血干細(xì)胞移植時在需要的時候輸注到移植受者體內(nèi)，是有可能解決放療/ 化療后血小板缺乏和臍帶血移植后血小板恢復(fù)延遲的重要臨床方法。
[0005] 由于臍帶血的造血干細(xì)胞的含量比例低于骨髓，而且臍帶血中的巨核祖細(xì)胞數(shù)量 較少成熟遲緩，所以如何提高臍帶血造血干細(xì)胞向巨核祖細(xì)胞定向分化的效率具有實際的 臨床意義。當(dāng)前，臍帶血造血干細(xì)胞體外巨核祖細(xì)胞定向擴(kuò)增普遍采用的細(xì)胞因子組合進(jìn) 行擴(kuò)增，主要有IL-3,IL-6,SCF，TPO,FLT等。
[0006] 白藜蘆醇是一種天然的植物抗體，存在于葡萄科、百合科、豆科等70多種植物中， 當(dāng)植物遭遇到真菌感染、紫外線等不利條件時產(chǎn)生的酚類化合物，對植物起保護(hù)、防御作 用。在醫(yī)學(xué)上，白藜蘆醇的抗心血管疾病作用因"法國悖論"而始被學(xué)者們認(rèn)識，隨著世界 范圍內(nèi)的進(jìn)一步研究，白藜蘆醇在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等方面的生物學(xué)作用逐漸被 發(fā)現(xiàn)。在造血干細(xì)胞的分化方面，白藜蘆醇可加速紅系祖細(xì)胞的成熟，在體外擴(kuò)增時提高 CFU-GM的集落生成數(shù)量。
[0007] 隨著分子生物學(xué)及信號通道的深入研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對MAPK或NF-kB信號通道 有明顯的作用效果，在癌細(xì)胞方面，如Hela細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞等，通過較高濃度的白藜蘆醇 處理（60ymol/L)，可促使p38MAPK信號通道激活，從而致使癌細(xì)胞凋亡。p38MAPK信號通 道還參與了多種細(xì)胞因子及其生理作用過程的信號傳導(dǎo)，但不同類型細(xì)胞對于P38MAPK信 號通道有不同的敏感程度，鑒于白藜蘆醇對P38MAPK信號通道的作用，可以用白藜蘆醇來 歧化不同類型的細(xì)胞，從而達(dá)到優(yōu)化培養(yǎng)的效果。
[0008] 臍帶血采集后去除血漿和紅細(xì)胞，得到富含造血干細(xì)胞的總有核細(xì)胞（TNC)?？傆?核細(xì)胞含有大量各種類型的細(xì)胞，復(fù)雜的成分對造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增和分化的效率有不良 影響。雖然通過磁珠分選可獲得較純的造血干細(xì)胞，優(yōu)化體外擴(kuò)增和分化的結(jié)果，但成本的 大幅度增加對于大量擴(kuò)增需要的情況有極大制約，同時更多的操作步驟也帶來更大的污染 風(fēng)險。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足與缺點，本發(fā)明首要目的在于提供一種提高臍帶血巨核 祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化效率的方法，該方法制備過程簡單、可靠且重復(fù)性好，污染可能性低， 兼顧了制備成本的經(jīng)濟(jì)性和操作安全性，為臨床應(yīng)用提供了更可靠的支持。
[0010] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0011] 一種提高臍帶血巨核祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化效率的方法，包含如下步驟：
[0012] 以臍帶血造血干細(xì)胞為標(biāo)本細(xì)胞，使用I型干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行首階段培養(yǎng)72小 時，然后更換II型干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，通過這兩種不同成分的干細(xì)胞培養(yǎng)基的先后培 養(yǎng)順序組合，顯著提高了臍帶血造血干細(xì)胞向巨核祖細(xì)胞定向分化的效率；
[0013] 所述的I型干細(xì)胞培養(yǎng)基為含有終濃度50ymol/L白黎蘆醇的干細(xì)胞培養(yǎng)基；
[0014] 所述的I型干細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選為含有終濃度50ymol/L白黎蘆醇、人白細(xì)胞介 素-3 (Interleukin-3,IL-3)、人白細(xì)胞介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、人干細(xì)胞生長因子 (Stemcellfactor，SCF)和促血小板生成素（Thrombopoietin，TP0)的造血干細(xì)胞培養(yǎng) 基；
[0015] 所述的I型干細(xì)胞培養(yǎng)基中，IL-3、IL-6、SCF和TP0的終濃度分別優(yōu)選為20ng/ mL、50ng/mL、50ng/mL和 50ng/mL;
[0016] 所述的造血干細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選為Stemspan培養(yǎng)基（STEMCELL公司）；
[0017] 所述的II型干細(xì)胞培養(yǎng)基為不含任何白藜蘆醇成分的干細(xì)胞培養(yǎng)基；
[0018] 所述的II型干細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選為不含任何白藜蘆醇成分但含有人白細(xì)胞介 素-3 (Interleukin-3,IL-3)、人白細(xì)胞介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、人干細(xì)胞生長因子 (Stemcellfactor，SCF)和促血小板生成素（Thrombopoietin，TP0)的造血干細(xì)胞培養(yǎng) 基；
[0019] 所述的II型干細(xì)胞培養(yǎng)基中，IL-3、IL-6、SCF和TP0的終濃度分別優(yōu)選為20ng/ mL、50ng/mL、50ng/mL和 50ng/mL;
[0020] 所述的造血干細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選為Stemspan培養(yǎng)基（STEMCELL公司）；
[0021] 所述的繼續(xù)培養(yǎng)的時間優(yōu)選為1~11天；
[0022] 所述的提高臍帶血巨核祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化效率的方法，優(yōu)選包含如下具體步 驟：
[0023] (1)配制培養(yǎng)基：將白藜蘆醇溶于細(xì)胞保護(hù)劑中，得到白藜蘆醇儲存溶液；然后將 白藜蘆醇儲存溶液添加到干細(xì)胞培養(yǎng)基中，得到I型干細(xì)胞培養(yǎng)基；
[0024] (2)誘導(dǎo)分化：將臍帶血造血干細(xì)胞接種于步驟（1)制備得到的I型干細(xì)胞培養(yǎng) 基，首階段培養(yǎng)72小時；
[0025] (3)繼續(xù)培養(yǎng)階段：將步驟⑵中培養(yǎng)后的細(xì)胞離心去上清，接種于II型干細(xì)胞 培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0026] 步驟⑴中所述的白藜蘆醇的純度彡99%，GC;
[0027] 步驟⑴中所述的白藜蘆醇儲存溶液濃度為10mm〇l/L，該濃度為儲存濃度，工作 濃度跟儲存濃度一致，須放置于4°C遮光保存；
[0028] 步驟（1)中所述的細(xì)胞保護(hù)液為含有體積百分比為55%二甲基亞砜（DMS0)和體 積百分比為5%低分子右旋糖酐（Dextran)的注射用水溶液；
[0029] 步驟（1)中所述的I型干細(xì)胞培養(yǎng)基為含有終濃度50ymol/L白黎蘆醇的干細(xì)胞 培養(yǎng)基；
[0030] 步驟（1)中所述的I型干細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選為含有終濃度50ymol/L白黎蘆醇、人 白細(xì)胞介素 _3 (Interleukin-3,IL-3)、人白細(xì)胞介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、人干細(xì)胞 生長因子（Stemcellfactor,SCF)和促血小板生成素（Thrombopoietin，TPO)的造血干細(xì) 胞培養(yǎng)基；
[0031] 所述的I型干細(xì)胞培養(yǎng)基中，IL-3、IL-6、SCF和TP0的終濃度分別優(yōu)選為20ng/ mL、50ng/mL、50ng/mL和 50ng/mL;
[0032] 所述的造血干細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選為Stemspan培養(yǎng)基（STEMCELL公司）；
[0033] 步驟（3)中所述的II型干細(xì)胞培養(yǎng)基為不含任何白藜蘆醇成分的干細(xì)胞培養(yǎng) 基；
[0034] 步驟（3)中所述的II型干細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選為不含任何白藜蘆醇成分但含有人白 細(xì)胞介素 _3 (Interleukin-3,IL-3)、人白細(xì)胞介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、人干細(xì)胞生 長因子（Stemcellfactor,SCF)和促血小板生成素（Thrombopoietin，TP0)的造血干細(xì)胞 培養(yǎng)基；
[0035] 所述的II型干細(xì)胞培養(yǎng)基中，IL-3、IL-6、SCF和TP0的終濃度分別優(yōu)選為20ng/ mL、50