專利名稱：兩嗅細胞共培誘導(dǎo)嗅干細胞增殖和分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利涉及一種嗅鞘細胞培養(yǎng)與嗅干細胞聯(lián)合培養(yǎng)干誘導(dǎo)嗅干細胞分化的方法，獲
得嗅干細胞分化后的成熟神經(jīng)細胞，用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的細胞移植臨床治療。
背景技術(shù)：
已有報道進行了不同干細胞的體外誘導(dǎo)分化研究，嘗試在體外誘導(dǎo)分化后進行細胞移
植，但嗅干細胞的誘導(dǎo)分化研究尚少見報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的細胞移植治療上的難題，本發(fā)明專利提供了一種嗅鞘細胞 培養(yǎng)與嗅干細胞聯(lián)合培養(yǎng)誘導(dǎo)嗅干細胞分化方法。在體外誘導(dǎo)分化后，獲得嗅干細胞分化后 的成熟神經(jīng)細胞，使用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的細胞移植臨床治療成為可能。
本發(fā)明專利解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是體外分離培養(yǎng)人胚嗅鞘細胞，建立人 胚嗅粘膜神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)方法，獲得足穩(wěn)定傳代的嗅干細胞后將其與嗅鞘細胞共同培
養(yǎng)，同時設(shè)定干細胞培養(yǎng)基組、無血清組。五天后固定細胞，用巢蛋白(Nestin)、微管蛋白
(Tubulin)、微管相關(guān)蛋白(MAP2)、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)多種抗體作免疫細胞熒
光染色，對陽性細胞進行形態(tài)學(xué)鑒定。
本發(fā)明專利的有益效果是，為嗅神經(jīng)干細胞的誘導(dǎo)方法，在體外誘導(dǎo)分化后使人胚嗅干
細胞應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的細胞移植臨床治療成為可能。
具體實施例方式
(一) 收集婦產(chǎn)科流產(chǎn)和引產(chǎn)的無明顯發(fā)育障礙的胎兒，分別分離、獲取嗅鞘細胞和原代嗅神 經(jīng)干細胞。 '
(二) 試劑培養(yǎng)基(DMEM/F12)，細胞因子(B27)，表皮生長因子(EGF)，成纖維細 胞生長因子(FGF)，谷氨酰胺，膠原蛋白酶。
(三) 沿死亡胎兒眉弓上開顱，移去腦組織，暴露前顱底，取下嗅球見篩板、雞冠，于篩板周 邊切開顱底骨板向鼻腔方向切取兩側(cè)鼻腔外側(cè)壁的上、中鼻甲及相對應(yīng)的鼻中隔中上部 分，取下標本放入培養(yǎng)基中清洗數(shù)遍以洗去嗅黏膜上的血液，剪碎后加入少量的基礎(chǔ)培 養(yǎng)基，用彎頭吸管將剪碎的組織移入15毫升離心管中，力口5毫升基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用粗彎頭吸 管上下吹打使之成為組織懸液，離心5minl000轉(zhuǎn)棄上清；如此重復(fù)2次，加入膠原蛋白酶 0.5ug /ml用吸管吹勻，放入37。C水浴鍋中，消化15min后用吸管輕輕吹打靜置lmin吸出上清，加入(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基的離心管中，如此重復(fù)3次基本可以將組織消化為單 細胞懸液，將消化終止后的懸液收集一起離心，D/F12清洗3次，用內(nèi)含表皮生長因子的 條件培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至少20次以上。
(四) 將多次收集的嗅鞘細胞培養(yǎng)基進行0.22 y m纖維素膜過濾除菌后替換嗅神經(jīng)干細胞培養(yǎng) 基觀察至第5天并進行免疫熒光染色分析。
(五) 光鏡下前三天觀察細胞與對照組無明顯變化，第4天和第5天可見細胞突起增多、增殖減 慢。免疫熒光染色觀察GFAP染色陽性細胞比例明顯增加，巢蛋白、微管蛋白陽性細胞降 低。
權(quán)利要求
1.一種嗅鞘細胞與嗅干細胞的共培養(yǎng)誘導(dǎo)嗅干細胞增殖和分化的方法。其特征是觀察嗅鞘細胞培養(yǎng)與嗅干細胞聯(lián)合培養(yǎng)對嗅干細胞的誘導(dǎo)作用，獲得嗅干細胞分化后的成熟神經(jīng)細胞，用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的細胞移植臨床治療。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗅鞘細胞與嗅干細胞的共培養(yǎng)誘導(dǎo)嗅干細胞增殖和分化的方法。其特 征是體外分離培養(yǎng)人胚嗅鞘細胞，建立人胚嗅粘膜神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)方法，獲得足穩(wěn) 定傳代的嗅干細胞后將其與嗅鞘細胞共同培養(yǎng)，同時設(shè)定干細胞培養(yǎng)基組、無血清組。五天后固定細胞，用巢蛋白(Nestin)、微管蛋白(Tubulin)、微管相關(guān)蛋白(MAP2)、神經(jīng)膠 質(zhì)酸性蛋白(GFAP)多種抗體作免疫細胞熒光染色，對陽性細胞進行形態(tài)學(xué)鑒定。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的嗅鞘細胞與嗅干細胞的共培養(yǎng)誘導(dǎo)嗅干細胞增殖和分化的方法。其 特征是本方法為嗅神經(jīng)干細胞的誘導(dǎo)方法，在體外誘導(dǎo)分化后使人胚嗅干細胞應(yīng)用于中樞 神經(jīng)系統(tǒng)損傷的移植臨床治療成為可能。
全文摘要
一種嗅鞘細胞與嗅干細胞的共培養(yǎng)誘導(dǎo)嗅干細胞增殖和分化的方法，收集婦產(chǎn)科流產(chǎn)和引產(chǎn)的無明顯發(fā)育障礙的胎兒，分別分離、獲取嗅鞘細胞和原代嗅神經(jīng)干細胞。在體外誘導(dǎo)分化后使人胚嗅干細胞應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的細胞移植臨床治療成為可能。
文檔編號A61P25/00GK101591642SQ200810110780
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者包建玲, 張秀東, 王洪美, 黃紅云 申請人:北京市虹天濟神經(jīng)科學(xué)研究院