專利名稱：心血管疾病的診斷和治療方法及組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動脈粥樣硬化和心血管疾病的預防、治療和風險評估的領域。
背景技術：
動脈粥樣硬化是造成大的和中等大小動脈的最內層(內膜)增厚的慢性疾病。其 減少血流并造成受累血管供應的器官中的缺血和組織破壞。動脈粥樣硬化是心血管疾病包 括心肌梗塞、中風和外周動脈疾病的主要原因。其是西方世界中死亡的主要原因并預測成 為二十年內整個世界的死亡的主導原因。該疾病由脂蛋白(主要是低密度脂蛋白(LDL))在血管的細胞外基質中的積累而 起始的。這些LDL顆粒聚集并進行氧化修飾。氧化的LDL是促炎癥性的、有毒的并造成血 管損傷。動脈粥樣硬化在許多方面代表對這樣的損傷(包括炎癥和纖維變性)的反應。1989年Palinski W等人鑒定了人類中針對氧化的LDL的循環(huán)的自身抗體(Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo. Proc Natl Acad Sci USA.1989,86 1372-6)。這個觀察提示動脈粥樣硬化可能是由針對氧化的脂蛋白的免疫反應造成的自身 免疫疾病。此時幾個實驗室開始尋找針對氧化的LDL的抗體滴度和心血管疾病之間的聯系。 但是，從這些研究中浮現的圖畫遠不清楚。存在針對氧化的LDL中的大量不同的抗原決定 簇的抗體，但是，這些抗原決定簇的結構是未知的。因此術語“氧化的LDL抗體”是指不同 特異性的抗體的混合物，而不是單一特異性的抗體。已經眾所周知在動脈粥樣硬化損傷中存在進行性炎癥，特征為免疫活性細胞的 激活和炎性細胞因子的產生。已確定的風險因素像高血壓、血脂、糖尿病和吸煙有可能 促進這種炎性反應，但是其發(fā)生的機制未被很好地鑒定并且存在不同的非相互排斥的 可能性。已經提出幾個不同的可以引發(fā)這種免疫反應性的自身抗原，包括氧化的低密度 月旨蛋白(oxLDL)和熱激蛋白(HSP) (Binder CJ 等人 Innate and acquiredimmunity in atheroRenesis. Nat Med. 2002,8 1218-26 ；Frostegard J. Autoimmunity, oxidized LDL and cardiovascular disease. Autoimmun Rev. 2002,1 233~7) 胃以白勺 云力J0C 樣硬化中免疫反應的作用的數據指示了復雜的關系。其中一個例子是影響動脈粥樣硬化 行成的動物模型中的免疫接種。當使用HSP時，動脈粥樣硬化增加，但當抗原是oxLDL時， 動脈粥樣硬化減少(Palinski W 等人 Immunization of lowdensity Iipoprotein(LDL) receptor-deficient rabbits with homologousmalondialdehyde-modified LDL reduces atherogenesis. Proc Natl Acad SciUSA. 1995,92 821~5 :Xu Q^A Induction of art eriosclerosisinnormocholesteroIemic rabbits by immunization with heat shock protein 65. Arterioscler Thromb. 1992,12 :789_99)。人類疾病中針對oxLDL的抗體(抗-OxLDL)的作用似乎是復雜的。在人類中，以前已經證明抗-OxLDL在健康對照中比在具有臨界性高血壓的人中要高，臨界性高血壓是早期心血管疾病的例子(Wu R等人Autoantibodies to OxLDL are decreased in individuals with borderlinehypertension. Hypertension 1999，33 :53_59)。在另一方面，幾個作者已經報道了抗-OxLDL在人類心血管疾病(CVD)中特別是在
(Bergmark C等人Patients with early-onsetperipheral vascular disease have increased levels of autoantibodies againstoxidized LDL. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995,15 441~5 ；Salonen JT 等人 Autoantibody against oxidised LDL and progression of carotidatherosclerosis. Lancet 1992，339 :883_887)。一個例子是系統(tǒng) 性紅斑狼瘡(SLE)，一種與非常高風險的CVD關聯的自身免疫疾病。具有CVD史的SLE患 者有明顯增高的抗-OxLDL 水平(Svenungsson E 等人 Riskfactors for cardiovascular disease in systemic lupus erythematosus. Circulation 2001,104:1887-93)。這些某 些程度上矛盾的結果可能是由于不同的方法和LDL氧化的階段，從而產生抗原性的差異。 還有可能的是疾病階段和風險因素圖譜與抗體水平有關。氧化的低密度脂蛋白(OXLDL)本身具有許多促炎癥反應的性質，包括T細 胞1、單核細胞/巨噬細胞和內皮細胞的激活(Berliner JA等人Minimally modified low density lipoprotein stimulates monocyteendotheIial interactions. J Clin Invest. 1990,85 1260-6 ；Frostegard J 等 人 Oxidized low density lipoprotein induces differentiation and adhesion ofhuman monocytes and the monocytic cell line U937. Proc Natl Acad SciUSA. 1990,87 904~8 :Frostegard J 等人 Biologically modified LDLincreases the adhesive properties of endothelial cells. Atherosclerosis. 1991,90 :119-26)。但是應該注意的是，oxLDL還可以改善急性炎性反應，反而促進更低級別的慢性炎 癥(如動脈粥樣硬化中所見到的)。有趣的是注意到oxLDL的許多生物作用是由oxLDL中 血小板激活因子(PAF)樣脂質引起的(Frostegard J等人Platelet-activating factor and oxidized LDLinduce immune activation by a common mechanism. Arterioscler ThrombVasc Biol. 1997,17 :963_8 ；Heery JM 等人 Oxidatively modified LDLcontains phospholipids with platelet-activating factor-like activity andstimulates the growth of smooth muscle cells. J Clin Invest. 1995,96 2322~30 ；Subbanagounder G ^ A Evidence that phospholipid oxidationproducts and/or platelet-activating factor play an important role in earlyatherogenesis :in vitro and in vivo inhibition by WEB 2086. Circ Res.1999,85 311~8)。血小板激活因子(PAF)是各種細胞包括單核細胞和內皮細胞合成的磷脂炎性調 節(jié)子。在LDL氧化的過程中，產生PAF-樣脂質。因此PAF可能在病理過程中、在血管壁樣動 脈粥樣硬化和高血壓有重要意義。在先前的報道中，描述了具有磷脂抗體綜合癥的個體中 PAF 抗體的存在(Barquinero J 等人 Antibodies against platelet-activating factor inpatients with antiphospholipid antibodies. Lupus 1994，3 :55_58)。Tektonidou MG 等入(Clinical importance of antibodies againstplatelet activating factor in antiphospholipid syndrome manifestations.EurJ Clin Invest. 2000，30 :646_52)報道抗PAF抗體在APS和SLE中是常見的并且包含血栓發(fā)生發(fā) 展的獨立因子。
WO 00/02046描述了升高的PAF抗體濃度與臨界性高血壓和代謝綜合癥即早期心 血管疾病相關。已經顯示升高的PAF抗體濃度與發(fā)生早期動脈粥樣硬化的增加的風險相關 聯。Wu 等 人(Antibodies to platelet-activating factor are associated withborderline hypertension, early atherosclerosis and the metabolic syndrome. T Intern Med. 1999 246 389-397)進一步提出抗PAF抗體可能反映早期血管變化，因此作 為疾病的新型標記，并且其可能還是致病性的(通過在血管壁中引發(fā)炎性反應)。WO 2005/100405描述了確定針對磷酰膽堿(PC)(其與發(fā)生缺血性心血管疾病的 升高的或降低的風險相關)的抗體(例如IgM或IgG抗體)存在或不存在的方法，并進一 步提出PC-偶聯物或針對PC-偶聯物的抗體在治療或預防動脈粥樣硬化中的用途。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一方面提供了至少一個PAF衍生物、一個PAF偶聯物或對PAF偶聯物 具有反應性的抗體制備物(例如單克隆抗體)在制備用于免疫接種和預防、防止或治療哺 乳動物(包括人類)抵抗心血管疾病(如動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關疾病)的藥物 中的用途。該藥物旨在提供具有抵抗心血管疾病的免疫原性或治療性性質的免疫接種。本發(fā)明的第二方面提供了免疫接種和治療哺乳動物(包括人類)抵抗心血管疾病 (如動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關疾病)的方法，所述方法包括向哺乳動物施用包含 至少一個PAF衍生物、一個PAF偶聯物或對PAF偶聯物具有反應性的抗體制備物(例如單 克隆抗體)的藥物組合物的步驟。所述藥物組合物旨在提供具有抵抗動脈粥樣硬化的免疫 原性或治療性性質的免疫接種。本發(fā)明的第三方面提供如了本發(fā)明的以上方面所定義的一個或多個PAF衍生物 和PAF偶聯物在制備用于心血管疾病的防止、預防和/或治療的免疫治療或治療的藥物組 合物(可選地與佐劑組合)中的用途。本發(fā)明的第四方面提供了預防或治療性處理哺乳動物(可以是人)的方法，所述 哺乳動物患有動脈粥樣硬化或面臨發(fā)生心血管疾病的風險，其中施用治療上有效量的至少 一個PAF衍生物、一個PAF偶聯物或對PAF偶聯物具有反應性的抗體制備物(例如單克隆 抗體)。本發(fā)明的第五方面提供了使用PAF偶聯物診斷與發(fā)生心血管疾病的增加的或減 少的風險相關的抗體(例如IgM、IgG或IgA抗體)存在或不存在的方法。本發(fā)明的第六方面提供了 PAF偶聯物在評估患者發(fā)生或發(fā)展心血管疾病的風險 的方法中的用途，其中評估了病人的對PAF偶聯物有反應性的抗體(例如IgM、IgG或IgA 抗體)的水平。
具體實施例方式本發(fā)明驚奇地發(fā)現低水平的與PAF偶聯物反應的抗體與發(fā)生心血管疾病的增加 的風險相關。這與現有技術報道的相反，現有技術中提示高水平的PAF抗體與發(fā)生心血管 疾病的增加的風險相關。本發(fā)明涉及包含PAF衍生物、PAF偶聯物或對PAF偶聯物具有反應性的抗體制備物(例如單克隆抗體)的藥物組合物，以及這些組合物在治療、預防或防止心血管疾病(如 動脈粥樣硬化)中的用途，例如在治療、防止或減少動脈粥樣硬化的進一步發(fā)展中的用途。 此外，本發(fā)明還涉及PAF衍生物、PAF偶聯物或所述抗體制備物(例如單克隆抗體)在制備 藥物組合物(可選具有佐劑)中的用途。此外本發(fā)明涉及診斷與發(fā)生心血管疾病的增加的或減少的風險相關的抗體(例 如IgM、IgG或IgA抗體)不存在或存在和/或水平。PAF的意思是根據以下通式的1-0-烷基-2-乙酰基-sn-甘油_3_磷酸膽堿。 優(yōu)選地，烷基基團是十六烷(十六烷基)基團或油烯基(十八烷基)基團。PAF偶聯物的意思是與載體連接的PAF部分(moiety)，優(yōu)選通過間隔子(spacer) 連接?？梢詫AF部分共價或非共價地連接至載體。PAF部分可以是PAF的衍生物。優(yōu)選 地通過烷基基團將PAF部分連接至載體。PAF衍生物的例子是根據以下通式的化合物 其中Rl是C2至C25的亞烷基、亞烯基或亞炔基連接基團，R2至R5獨立地選自C1 至 C6 烷基，如 WO 87/05904 和 US 5，061，626 中所述；根據下面通式的化合物 其中Rl是C2至C18烷基，優(yōu)選為十五烷基，R2是H、甲基、乙基、丙基或異丙基；R3 是甲基、乙基、丙基或異丙基，如Karasawa K等人J Biochem(Tokyo) 1991，110 :683_687所 述；根據下面通式的化合物 其中Rl是C6至C18烷基，優(yōu)選為己基或十二烷基，如Smal MA等人Lipids 1991， 26 1130-5 所述；根據下面通式的化合物 其中Rl是C6至C18烷基，優(yōu)選為己基或十二烷基(1-酰基-PAF)，如Muzya GI等 人 Immunologiya(Moscow) 1997,6,9-11 所述。載體可以是例如蛋白、碳水化合物、聚合物、乳膠珠子或膠體金屬。PAF偶聯物可以是例如蛋白-PAF偶聯物，如人血清白蛋白(HSA) -PAF偶聯物、鐵 轉移蛋白-PAF偶聯物、鑰孔戚血藍蛋白(KLH)-PAF偶聯物或牛血清白蛋白(BSA)-PAF偶聯 物。PAF偶聯物和抗-PAF抗體的產生的例子在WO 87/05904中有描述并由 Karasawa K 等 人(Antibodies to synthetic platelet-activating factor(1-0-alkyl-2-0-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine) analogues withsubstituents at the sn-2 position. J Biochem(Tokyo). 1991,110 :683_7), Macpherson JL 等 人 (Production and characterization of antibodies toplatelet-activating factor. T Lipid Mediat. 1992,5 49~59), Smal MA ^A (Synthesis of a PAF immunogen and production of PAF-specific antibodies. Lipids. 1991, 26 :1130_5),Tomii A 禾口 Masugi F. (Production ofanti-platelet-activating factor antibodies by the use of colloidal gold ascarrier. .Ton T Med Sci Biol. 1991,44 75~80),和 Wang C 和 Tai HH. (Asensitive and. specific radioimmunoassay for platelet-activating factor. Lipids. 1992,27:206-8)和US 5，061，626描述，其內容通過引用并入本文。舉例說明了可以根據本發(fā)明治療和/或防止的心血管疾病，所述心血管疾病不限 于動脈粥樣硬化，急性心肌梗塞，穩(wěn)定和不穩(wěn)定心絞痛，中風，動脈移植、動脈支架術和球囊 血管成形術之后的再狹窄，特別是冠狀動脈旁路移植術、冠狀動脈支架術和冠狀動脈血管 成形術之后的再狹窄。在根據本發(fā)明的第一方面的用途中，或根據本發(fā)明的第二方面的方法中，心血管 疾病可以選自動脈粥樣硬化，急性心肌梗塞，穩(wěn)定和不穩(wěn)定心絞痛，中風，動脈移植、動脈支 架術和球囊血管成形術之后的再狹窄，特別是冠狀動脈旁路移植術、冠狀動脈支架術和冠 狀動脈血管成形術之后的再狹窄。優(yōu)選地，在根據本發(fā)明的第一方面的用途中，或根據本發(fā)明的第二方面的方法中，通過注射施用藥物。本發(fā)明的第五方面可以提供確定與發(fā)生心血管疾病的增加的或減少的風險相關 的PAF偶聯物有反應性的抗體(例如IgM、IgG或IgA抗體)存在或不存在的方法。通常，本發(fā)明的第五方面的方法包括向來自個體的樣品暴露于PAF偶聯物并檢測 與PAF偶聯物結合的抗體。優(yōu)選地，在本發(fā)明的第五方面的方法中，個體是人類。優(yōu)選地，在本發(fā)明的第五方面的方法中，樣品是血清。根據本發(fā)明的第六方面的PAF偶聯物的用途可以對應于根據本發(fā)明的第五方面 的使用PAF偶聯物的方法。優(yōu)選地，在本發(fā)明的第五或第六方面中，PAF通過間隔子連接至載體。在這個具體 實施方式中，載體通常是蛋白，優(yōu)選為KLH (鑰孔戚血藍蛋白)、鐵轉移蛋白、人血清白蛋白 (HSA)或牛血清白蛋白(BSA)?；蛘咻d體可以是乳膠珠子。通常，根據本發(fā)明的第五方面，通過一種檢驗(優(yōu)選免疫檢驗)來測定結合至PAF 偶聯物的抗體。患者的對PAF偶聯物有反應性的抗體(例如IgM、IgG或IgA抗體)的水平可以使 用免疫檢驗來測定。下面描述了合適的免疫檢驗的例子，其對于本領域技術人員在任何情 況下是明顯的。通常，在本發(fā)明的第五和第六個具體實施方式
中，低水平的對PAF偶聯物有反應 性的抗體是發(fā)生心血管疾病的增加的風險的指征。相反，高水平的對PAF偶聯物有反應性 的抗體是減少的發(fā)生心血管疾病的風險的指征。通常，在患者血漿或血清的樣品中測定抗 體。在任何給定的人群中，對PAF偶聯物有反應性的抗體的水平有可能變化。對于任 何給定的個體測定的對PAF偶聯物有反應性的抗體的水平可以通過參考廣闊人群中觀察 到的范圍而被分類為高或低。例如，在通過參考廣闊人群而測定的特定百分比值以下的這 樣的抗體的水平可以被分類為低水平。適當地，低水平可以對應于25%以下或20%、10% 或5%以下的值。高水平可以對應于例如5%、10%、20%或25%以上的值。當個體被鑒定為具有低水平的對PAF偶聯物有反應性的抗體時，這個信息可以輔 助發(fā)生或發(fā)展缺血性心血管疾病的增加的風險的診斷或預后。臨床醫(yī)生可以考慮其它因素 以達到診斷或預后。當認為個體有發(fā)生缺血性心血管疾病的增加的風險時，可以推薦預防 性治療和/或生活方式的改變。當個體被診斷為具有進行性缺血性心血管疾病時，他或她 的臨床醫(yī)生可以推薦個體化的治療和/或生活方式的改變。在本發(fā)明的第五和第六方面中，抗體的水平可以通過測定所有對PAF偶聯物有反 應性的抗體，或只測定特定同種型的抗體如IgM、IgG或IgA，或測定兩個或兩個以上抗體同 種型的組合而鑒定。優(yōu)選地，確定IgG的水平。免疫檢驗可以是競爭性的或非競爭性的。在典型的競爭性免疫檢驗中，樣品中的 抗體與標記的抗體競爭性結合至PAF偶聯物。然后測定結合至PAF偶聯物的標記的抗體的 量。樣品中的抗體濃度與檢測的標記的抗體的量之間有反向的關系。在非競爭性免疫檢驗 中，樣品中的抗體結合至PAF偶聯物，然后標記的檢測試劑(通常是抗免疫球蛋白抗體)結 合至該抗體。然后測定結合至該抗體的標記的檢測試劑的量。與競爭性方法不同，非競爭性方法的結果將直接與抗體的濃度成比例。在非競爭性免疫檢驗或western印跡中，標記的檢測試劑(通常是抗免疫球蛋白 抗體)被用于檢測與PAF偶聯物結合的抗體。合適的抗免疫球蛋白抗體必須特異性結合一 種物種(樣品從該物種獲得)的免疫球蛋白。其可以結合至該物種的所有免疫球蛋白同種 型或只結合同種型的一個亞型。例如，其可以只結合IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，或結合兩個 或兩個以上的這些同種型的組合?？姑庖咔虻鞍卓贵w可以只特異性結合任何給定的同種型 的某些亞型。人類IgA的亞型為IgAl和IgA2?？姑庖咔虻鞍卓贵w可以結合至一個或兩個 這些亞型。人類IgG的亞型為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4?？姑庖咔虻鞍卓梢越Y合至一個或 多個這些人類IgG亞型。應該理解的是不同的脊椎動物物種中有不同的同種型和亞型。在放射免疫檢驗中，以放射性同位素如131I或125I標記抗體或檢測試劑。在酶免 疫檢驗中，以酶標記抗體或檢測試劑。合適的酶能夠使用生色底物被檢測到。生色底物是 作為與酶反應的結果而產生有色產物的底物，從而有色產物可以分光光度計測量而被檢測 至|J。酶如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和來自大腸桿菌(E.coli)的焦磷 酸酶已經被廣泛地應用。還可以使用基于酶如熒光素酶的化學發(fā)光系統(tǒng)。其它的標記包括 熒光標記如Alexa系列的熒光基團。經常使用維生素生物素偶聯抗體或檢測試劑，因為這可以通過酶連接的或熒光基 團連接的親和素或鏈霉親和素的反應而容易地被檢測到(生物素以強烈的特異性和親和 力與親和素或鏈酶親和素結合)。在典型的非競爭性酶免疫檢驗中，將需要分析的樣品與吸附在固體基質上的PAF 偶聯物接觸并孵育。因此可能存在于樣品中的任何抗PAF偶聯物的抗體被吸附在固體基質 上的PAF偶聯物特異性地結合，從而產生PAF偶聯物/抗PAF偶聯物抗體復合物。然后通過 例如洗滌將樣品從固體基質上分離以便除去非結合的物質。在該方法的下一步，向固體基 質加入能夠結合任何以PAF偶聯物/抗PAF偶聯物抗體復合物形式存在于基質中的抗-PAF 偶聯物抗體的指示劑抗體，因此產生PAF偶聯物/抗PAF偶聯物抗體/指示劑抗體復合物。 指示劑抗體可以是例如在非人的動物物種中產生的抗人IgG免疫球蛋白。最后，檢測在固 體基質上的PAF偶聯物/抗PAF偶聯物抗體/指示劑抗體復合物的存在，固體基質上的所 述復合物的存在是來自個體的樣品中抗PAF偶聯物抗體存在的指征。通常，固體基質是微量滴定板，例如是用于進行ELISA免疫檢驗的常見類型的微 量滴定板。所述微量滴定板優(yōu)選為聚苯乙烯板。其它適當的固體基質是乳膠顆粒、珠子和 包被的紅血細胞。方便地，通過在含有固體基質的緩沖液中孵育PAF偶聯物而將PAF偶聯 物吸附至固體基質上。合適的緩沖液包括碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖的鹽水?；蛘?，可以 將PAF偶聯物共價連接至固體基質。通常，將PAF偶聯物吸附或共價連接至固體基質上之 后，以封閉試劑孵育固體基質以減少來自樣品的物質與固體基質的非特異性結合。合適的 封閉試劑包括牛血清白蛋白。優(yōu)選對可以結合至PAF偶聯物的抗體的定量測定是通過一種或更多上述技術獲得的。在典型的非競爭性檢驗中，假定了測量的變量(不論其是光密度或一些其它的讀數) 和抗體濃度之間的線性關系。例如，如果樣品A在檢驗中有樣品B的雙倍的光密度(已經 從兩者中減去本底)，則認為A中的抗體濃度是B的兩倍。但是，優(yōu)選的是構建陽性血清樣 品的庫的系列稀釋的標準曲線。優(yōu)選地，在檢驗樣品的同時檢驗這樣的稀釋物。通過這樣做，在測定樣品中抗體量的時候可以將任何來自線性關系的差異都考慮進去。希望的是測定與oxLDL或丙二醛修飾的LDL(MD-LDL)反應的抗體以及測定對PAF 偶聯物有反應性的抗體例如IgM、IgG或IgA抗體。另外希望的是或還希望的是測定脂蛋 白相關的磷脂_A2(LpPLA2)、同型半胱氨酸、C-反應性蛋白(CRP)、HSP70、高密度脂蛋白 (HDL)、TNF(特別是TNF a )和/或HSP60以及測定對PAF偶聯物有反應性的抗體(例如 IgM、IgG或IgA抗體)的水平。對這樣因子的檢驗可以幫助發(fā)生或發(fā)展心血管疾病的增加 的風險的診斷或預后?？紤]到本文描述的任何方法或組合物可以根據本文描述的任何其它方法或組合 物實現。相似地，任何關于本發(fā)明的一個方面所討論的具體實施方式
可以用于本發(fā)明的任 何其它方面的內容中。貫穿本申請，術語“約”用于表明數值包括用于測定該數值的儀器或方法的誤差的 標準偏差。當與權利要求和/或說明書中的術語“包含”結合使用時，使用單詞“一個(a) ”或 “一個(an)”可以意味著“一個(one)”，但還與“一個或多個”、“至少一個”和“一個或一個 以上”的意思一致。在權利要求中使用術語“或”是用于表示“和/或”，除非明確地指出只表示兩者之 一或兩者之一是相互排斥的，雖然本公開支持提及只有兩者之一和“和/或”的定義。本發(fā)明的其它目標、特征和優(yōu)點將在下列詳細的說明中變得顯而易見。但是應該 理解的是詳細的描述和特定的例子，雖然指示了本發(fā)明的特定具體實施方式
，但是其只以 舉例說明的方式給出，因為根據詳細的本說明書，本發(fā)明的精神和范圍內的各種變化和修 改將對本領域技術人員將變得顯而易見。下面公開的實施例只是為了舉例說明本發(fā)明的目的，不應被認為是作為任何對隨 附的權利要求書所劃定的范圍的任何限制。本文參考的文獻通過引用并入本文。描述了測定與發(fā)生心血管疾病的增加的或減少的風險相關的PAF偶聯物有反應 性的IgG抗體的不存在或存在和/或水平的方法的例子。也可以使用本領域已知的其它方法?？梢允褂孟嗨频姆椒y定對PAF偶聯物有反應性的IgM或IgA抗體的不存在或存 在和/或水平。A. PAF 偶聯物在根據本發(fā)明的方法中合成并使用了下列PAF-BSA偶聯物 n = 16B.泖誠PAF {臓勿能謹輸赫&禾口 /赫種誠在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中以5 ii g/ml PAF-BSA偶聯物(以上所述的)包被微量滴定板。以PBS洗滌后，以BSA溶液封閉該板。血清樣品在樣品稀釋液中稀釋(1 101) 并加入板中。將板在室溫孵育30分鐘并洗滌。加入辣根過氧化物酶偶聯的兔抗人 IgGd 1000稀釋)并在室溫孵育30分鐘。洗滌后，通過加入3，3’，5，5，四甲基聯苯胺 (TMB)底物并室溫黑暗中孵育板10分鐘發(fā)生顯色。使用分光光度計在450nm讀出吸收值。 與PAF-BSA偶聯物反應的抗體的水平被計算為從測試樣品獲得的吸收值與從每個檢驗中 包括的陽性對照獲得的吸收值之間的比率。C.針對PAF偶聯物的抗體可以如上述制備針對PAF偶聯物的抗體。參見例如WO 87/05904，Macpherson JL ^ A (Production and characterization of antibodies toplatelet-activating factor. T Lipid Mediat. 1992,5 :49-59)，禾口 Smal MA等人(Synthesis of a PAF immunogen and production of PAF-specificantibodies. Lipids. 1991,26:1130-5)。D.針對PAF偶聯物的單克降抗體可以使用本領域已知的任何標準方法制備針對PAF的單克隆抗體。參見例如 Tomii A禾口Masugi F. (Production of anti-platelet-activatingfactor antibodies by the use of colloidal gold as carrier. Jpn J Med Sci Biol. 1991,44 :75_80)?？梢允褂帽绢I域技術人員熟知的方法制備其它與PAF偶聯物反應的抗體。例如， 可以制備與PAF偶聯物反應的人免疫球蛋白制備物的亞組分，例如如下面所述，例如通過 使用PAF偶聯物進行親和純化。靜脈內免疫球蛋白制備物(例如IGIV ；Baxter和其它)是商業(yè)上可獲得的高度 純化的IgG制備物并用于治療無抗體產生的或有非常低水平的抗體產生的患者。免疫球 蛋白制備物包括那些可以從下列生產商獲得的制備物=Baxter (US)，例如Gammagard , Isiven(Antimo Naples, Italy), Omrix(Tel-Hashomer, Israel), MiIes(Biological Products Division, West Heaven, CT), Sclavo (Lucca, Italy), Sandoz (Novartis, Basel, Switzerland),例如 Sandoglobulin , Biotest Diagnostic Corporation(Deville,
NJ)。免疫球蛋白制備物的例子有 GammagardS/D , GammarlV , Gaimnar-PIV , Gammimune N , Iveegam , Panglobulin , Polygam S/D , Sandoglobulin , Venoglobulin 。免疫球蛋白制備物通常包含一些IgM以及igG。在Gammagard 中存在 痕量的IgM。Pentaglobin(Biotest)是濃縮的已經用于SARS治療的IgM制備物。對PAF 偶聯物有反應性的亞組分可以同時包含IgG和IgM，或可以被選擇而主要包含IgG(例如通 過以富含IgG的制備物如Gammagard 起始和/或通過選擇IgG)；或主要包含IgM(例如 通過以富含IgM的制備物如Pentaglobin起始和/或選擇IgM)。E.主動免疫因此本發(fā)明的一個具體實施方式
是使用PAF衍生物或PAF偶聯物用于制備藥物組 合物，所述藥物組合物用于治療、預防或防止心血管疾病，如動脈粥樣硬化、急性心肌梗塞、 穩(wěn)定和不穩(wěn)定心絞 痛、中風，動脈移植后再狹窄、動脈支架術和球囊血管成形術，特別是冠 狀動脈旁路移植術后的再狹窄、冠狀動脈支架術和冠狀動脈血管成形術。所述偶聯物可以 是與藥學上可以接受的蛋白、碳水化合物或聚合物連接的PAF或PAF衍生物。優(yōu)選通過注射施用藥物組合物。提出的主動免疫的方法將調節(jié)抗體的滴度，其轉而將對心血管疾病的發(fā)生有積極 的作用。F.被動免疫本發(fā)明的另一個具體實施方式
是使用抗體制備物例如單克隆抗體，其識別用于制 備治療、預防或防止心血管疾病的藥物組合物的PAF偶聯物，所述心血管疾病如動脈粥樣 硬化，急性心肌梗塞，穩(wěn)定和不穩(wěn)定心絞痛，中風，動脈移植、動脈支架術和球囊血管成形術 之后的再狹窄，特別是冠狀動脈旁路移植術、冠狀動脈支架術和冠狀動脈血管成形術之后 的再狹窄。單克隆可以使用本領域已知的方法制備。G.診斷和風險評估本發(fā)明的進一步具體實施方式
提供了使用PAF偶聯物診斷對PAF偶聯物有反應性 的抗體(例如IgA、IgM或IgG抗體)的不存在、存在和/或水平的方法，所述PAF偶聯物與 發(fā)生心血管疾病的增加的或減少的風險相關。優(yōu)選的方法是免疫檢驗。該方法可以用于評 估患者的發(fā)生或發(fā)展心血管疾病的風險。實施例1包括了下列實施例以證明本發(fā)明的優(yōu)選的具體實施方式
。本領域技術人員應該理 解的是遵循本發(fā)明人發(fā)現的代表技術的實施例中公開的技術在實現本發(fā)明時可以很好地 發(fā)揮作用，因此可以被認為構成了其實施的優(yōu)選模式。但是，考慮到本發(fā)明，本領域技術人 員應該理解的是在公開的特定具體實施方式
中可以做出許多改變，并且不背離本發(fā)明的精 神和范圍而仍然獲得同樣的或相似的結果。A.受試者在Malm6(theMalmdDiet and Cancer Study)的觀測性研究中，募集來自群體 的約30000個受試者中的約6000個以進行深入的心血管疾病研究，包括通過頸動脈的超聲 測定非侵入性地評估亞臨床動脈粥樣硬化?？偣灿?37個CVD病例(主要是心肌梗塞(Ml) 和缺血性中風)和384個年齡和性別匹配的對照?？筆AF-BSA的截止水平為307 (10%的抗 PAF水平)。抗PAF-BSA IgG的截止水平為60. 8 (25%的水平)?？偣灿?8個CVD病例具 有25%以下的抗PAF-BSA IgG水平(42% )，和79個對照(21 % )，這對應于3. 19的相對風 險(95% CI 2. 04-4. 99)(表 1)。結果顯示低的抗PAF-BSA水平是健康受試者中出現心血管疾病的預測物，可以作 為心血管疾病的標記。B.試劑Maxisorp 鎖定孔板、C96、微量滴定板購自 Nunc (RoskildeDenmark)，PAF-BSA 由 IsoSep, Uppsala (Sweden)合成禾口提供。與兔抗人IgG ( Y _特異的)偶聯的辣根過氧化物酶購自DakoCytomation， Stockholm (Sweden) 。 TMB ^^ 自 Phadia, Freiburg (Germany)。C.針對PAF偶聯物的抗體的測定通過酶聯免疫吸附檢驗(ELISA)測定PAF-BSA的IgG抗體。產生0. 5-0. 70D吸收 值的一個血清被用作內部標準并在每個板上測試。抗原濃度為g/ml時達到抗體結合 的穩(wěn)定水平。因此以PBS中的PAF-BSA(5 u g/ml)包被C96微量滴定maxsorp板(100 u g/孔)并在4°C孵育過夜。吸取包被溶液后，以BSA-PBS在室溫封閉板2小時。吸取封閉 溶液，加入0. 2% BSA-PBS中1 101稀釋的血清樣品(100 μ 1/孔)。于室溫孵育板30分 鐘，如上所述，并以洗滌緩沖液(Phadia，Freiburg, Germany)洗滌三次。每孔加入100 μ 1 辣根偶聯的兔抗人IgG(稀釋1 1000)并在室溫孵育30分鐘。洗滌三次后，如上所述， 通過加入TMB底物(100 μ 1/孔)而顯色。黑暗中在室溫孵育10分鐘以后，通過加入0.5Μ H2SO4 (50 μ 1/孔)終止反應。在450nm在ELISADigiScan分光光度計中讀板。以兩次重復 測定所有的樣品，所有樣品的差異系數在15%以下。P.結果表1 ******************根據本公開，無需花費過量實驗即可得到并實施本文公開的和要求保護的所有組 合物和/或方法。雖然已經根據優(yōu)選的具體實施方式
描述了本發(fā)明的組合物和方法，但是 對于本領域技術人員顯而易見的是可以不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍而對本文描述的 組合物和/或方法以及方法的步驟或步驟順序適用某些變化。更特別地，顯而易見的是同 時在化學上和生理上相關的某些試劑可以替代本文描述的試劑而獲得相同或相似的結果。 所有這樣的對本領域技術人員是顯而易見的相似替換和修改被認為是落在如隨附的權利 要求書所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內。
權利要求
至少一個PAF衍生物、一個PAF偶聯物或對PAF偶聯物有反應性的抗體制備物例如單克隆抗體在制備用于免疫接種和預防、防止或治療哺乳動物包括人類以抵抗心血管疾病的藥物中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其中心血管疾病選自動脈粥樣硬化，急性心肌梗塞，穩(wěn) 定和不穩(wěn)定心絞痛，中風，動脈移植、動脈支架術和球囊血管成形術之后的再狹窄，特別是 冠狀動脈旁路移植術、冠狀動脈支架術和冠狀動脈血管成形術之后的再狹窄。
3.一種用于免疫接種和預防、防止和治療哺乳動物包括人類以抵抗心血管疾病的方 法，所述方法包括向哺乳動物施用藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含至少一個PAF 衍生物、一個PAF偶聯物或對PAF偶聯物有反應性的抗體制備物例如單克隆抗體。
4.根據權利要求3所述的方法，其中心血管疾病選自動脈粥樣硬化，急性心肌梗塞，穩(wěn) 定和不穩(wěn)定心絞痛，中風，動脈移植、動脈支架術和球囊血管成形術之后的再狹窄，特別是 冠狀動脈旁路移植術、冠狀動脈支架術和冠狀動脈血管成形術之后的再狹窄。
5.根據權利要求1或2所述的用途，或根據權利要求3或4所述的方法，其中通過注射 施用藥物或通過注射施用組合物。
6.如前述權利要求中任一項定義的一個或更多的PAF衍生物或PAF偶聯物在制備用于 預防、防止或治療心血管疾病的藥物組合物中的用途，所述藥物組合物可選地與佐劑組合。
7.一種預防或治療性處理患有動脈粥樣硬化或面臨發(fā)生心血管疾病風險的哺乳動物 例如人類的方法，其中施用治療上有效量的至少一個PAF衍生物、一個PAF偶聯物或對PAF 偶聯物有反應性的抗體制備物例如單克隆抗體。
8.一種使用PAF偶聯物診斷與發(fā)生缺血性心血管疾病的增加的或減少的風險相關的 IgM、IgG或IgA抗體存在或不存在的方法。
9.根據權利要求8所述的方法，包括暴露來自個體的樣品的PAF偶聯物并檢測結合至 PAF偶聯物的抗體。
10.根據權利要求9所述的方法，其中個體是人類。
11.根據權利要求9或10所述的方法，其中樣品是血清。
12.根據權利要求8-11任一項所述的方法，其中通過間隔子將PAF連接至載體。
13.根據權利要求9-12任一項所述的方法，其中載體是蛋白。
14.根據權利要求10所述的方法，其中蛋白是KLH(鑰孔戚血藍蛋白、鐵轉移蛋白、人血 清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)。
15.根據權利要求12所述的方法，其中載體是膠體珠子。
16.根據權利要求8-15任一項所述的方法，其中通過一種檢驗優(yōu)選免疫檢驗測定結合 至PAF偶聯物的抗體。
17.PAF偶聯物在評估患者發(fā)生或發(fā)展缺血性心血管疾病的方法中的用途，其中評估患 者的與PAF偶聯物反應的IgM、IgG或IgA抗體的水平。
全文摘要
低水平的與PAF偶聯物反應的抗體與發(fā)生心血管疾病的增加的風險相關。因此，提供了診斷和治療心血管疾病的組合物和方法。
文檔編號A61P9/10GK101842119SQ200880113553
公開日2010年9月22日 申請日期2008年10月29日 優(yōu)先權日2007年10月30日
發(fā)明者H·格倫隆德, I·達爾布姆, J·弗羅斯特蓋德 申請人:阿瑟拉生物技術公司